WAVETM反应器和搅拌瓶中微载体球转球放大培养的比较

目的:哺乳动物细胞目前已广泛用于生物工程药物如单抗和疫苗的生产.而用于贴壁细胞规模化培养的微载体,也应时应需得以开发并应用于生物制药.贴壁细胞微载体培养在搅拌罐和WAVETM反应器中都能进行.而如要进行进一步的放大培养,球转球工艺不可或缺.为了发展球转球这一新的放大技术,以及考量WAVETM反应器这种新型大规模培养设备的应用性,大量的细胞培养和球转球实验在WAVETM反应器和搅拌瓶中进行.收集到的数据得以分析比较.方法:将Vero细胞分别接入WAVETM反应器和搅拌瓶中用微载体Cytodex 1进行培养.适当补充营养并控制温度、pH等培养条件使细胞增殖.长满微载体的细胞用清洗、消化等球转球工艺的一系列步骤而分离,并放大接种到新的培养体系.球转球工艺的有效性通过记录并统计分析细胞消化分离的回收率,以及细胞重新接种生长的存活力来评估.结果:统计学分析比较WAVETM反应器和搅拌瓶中得到的细胞分离回收率分别是67.56％和39.39％,数理统计P值小于0.0003;细胞重新接种存活率分别是95.17％和78.45％,P值等于0.0107.结论:在WAVETM反应器中进行的球转球放大工艺,其总体表现和有效性远高于在搅拌瓶中得到的结果.在WAVETM反应器中培养的Vero细胞有很好的细胞状态,作为种子链和生产用罐相比搅拌型反应罐均有很大的优越性.     

应用生物反应器培养Vero细胞制备EV71病毒初探

目的应用生物反应器培养Vero细胞制备EV71病毒。方法以3 L生物反应器采用4 g/L、8 g/L Cytodex-1微载体培养比较Vero细胞比生长率,并以4 g/L微载体培养EV71病毒。结果 4 g/L微载体培养Vero细胞3～4 d微载体细胞密度达2.3×106/mL,按0.001的感染复数(MOI)接种EV71病毒,病毒收获液的滴度最高达7.90 lgPFU/mL,较静置培养平均高出0.92 lgPFU/mL。结论初步建立了3 L生物反应器微载体培养Vero细胞制备EV71病毒的工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础。     

Vero细胞无血清培养技术的研究与应用

Vero细胞是世界卫生组织和我国生物制品规程认可的疫苗生产细胞系。随着对疫苗质量和安全性要求的不断提高,用无血清培养基取代含血清培养基培养Vero细胞已成为病毒疫苗生产的一个重要发展趋势。Vero细胞无血清培养的技术关键是研发或选择能支持细胞以贴附培养方式生长的无血清培养基。微载体培养是贴附依赖性细胞系规模化培养和病毒疫苗生产的有效技术途径。我们对Vero细胞无血清培养基的研发、Vero细胞无血清培养及病毒疫苗生产工艺做了讨论,对该领域存在的问题和发展策略进行了展望。     

无血清细胞培养在发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒生长中的应用

目的建立无血清培养基培养Vero细胞制备发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)的工艺。方法分别采用含10%牛血清的MEM(10%MEM培养基)和无血清M2培养基(SF-M2培养基)在方瓶中培养Vero细胞制备SFTSV,比较无血清与含血清培养基培养Vero细胞制备SFTSV在病毒滴度及病毒繁殖曲线之间的差异。在生物反应器里用无血清培养的方式进行工艺放大,收获病毒原液并进行检定。结果无血清培养的Vero细胞能够满足SFTSV培养需求,与含血清细胞培养相比,单位细胞病毒产量没有降低,达到30~60个活病毒/细胞。可以实现在生物反应器的工艺放大,病毒高峰时病毒滴度均在7.0lg PFU/m L以上。结论无血清细胞培养可以应用于SFTSV的培养,有利于降低疫苗生产过程中的纯化难度,提高疫苗安全性。     

Vero细胞作为基质的病毒性疫苗研制进展

使用传代细胞系Vero细胞生产脊髓灰质炎疫苗和狂犬病疫苗已有多年的历史。随着传代细胞系潜在致癌性的相关检测技术不断发展完善,消除了人们对其潜在致癌性的担忧,监管部门正逐步认可使用传代细胞系来生产病毒性疫苗。目前,Vero细胞被越来越多地用于生产病毒类疫苗,并用生物反应器工艺取代转瓶工艺,便于规模化培养。本文就Vero细胞作为基质研制的病毒性疫苗作一综述。     

微载体灌注培养制备Vero细胞狂犬病疫苗

本文研究在生物反应器中用微载体连续灌注培养Vero细胞生产狂犬病毒制备技术。在5L体积的生物反应器中,加入含10g/L微载体的199培养基,接种Vero细胞至细胞浓度达到1×105/mL,培养7d后细胞可生长至6~7×106/mL,然后以感染复数(MOI)为0.01接种狂犬病毒VaG株,接毒后24h开始收获,连续收获12d左右,收获的病毒滴度范围在6.0~8.5logLD50/mL,收获的病毒原液经浓缩、灭活和纯化等步骤制备成疫苗,各项质量指标均达到《中国生物制品规程》2000年版要求。实验表明,用生物反应器微载体灌注培养制备人用Vero细胞狂犬病疫苗小试工艺可行。     

VERO细胞生物反应器放大培养初探

目的:研究用生物反应器放大进行Vero细胞微载体培养,实现生物反应器之间Veto细胞放大培养.方法:5L微载体生物反应器以10g/L微载体浓度培养Vero细胞,96h时经漂洗、消化、接种于30L微载体生物反应器,实现放大后的30L微载体生物反应器细胞怏速增殖,期间对不同时期的微载体细胞进行细胞计数、细胞代谢分析和形态观察.结果:5L生物反应器细胞经过96h灌注培养,平均细胞密度达到7.81×10~6cells/mL.5L微载体细胞放大到30L微载体生物反应器,平均细胞收获率为32.3%;放大到30L生物反应器后经过144h培养,细胞密度达到9.19×10~6cells/mL;放大后的细胞代谢途径依然以葡萄糖氧化代谢乳酸为主.结论:生物反应器由5L到30L进行Veto细胞放大培养是可行的.     

一种1型单纯庖疹病毒载体系统的建立

1型单纯疱疹病毒（HSV-1）作为溶瘤病毒和病毒载体的研究已有很长的历史. 本研究利用细菌人工染色体技术建立了一种HSV-1载体系统. 首先,将HSV-1内部反向重复序列（internal inverted repeat sequences, IR）两侧的片段克隆入pKO5获得穿梭质粒pKO5/BN,其电转含pHSV-BAC的大肠杆菌后筛选获得删除IR区重组DNA的 pHSVΔIR-BAC. pHSVΔIR-BAC转染Vero细胞获得删除IR区的重组病毒HSVΔIR（MH1001）.上述pKO5/BN和含pHSVΔIR BAC的大肠杆菌构成了HSV-1载体系统. 利用该系统获得了表达绿色荧光蛋白EGFP的重组病毒HSVΔIR/EGFP（MH1002）.MH1001和MH1002在感染的Vero细胞中增殖水平略低于野生型HSV-1,但无显著差异|Western印迹检测表明,重组病毒早期蛋白质ICP0、ICP4、ICP8、ICP22、ICP27在感染细胞中的表达水平下降|免疫荧光及激光共聚焦检测表明,重组病毒与野生型病毒均存在于细胞质中.以上结果表明,删除IR区的重组HSV-1保留了复制能力,能够携载并表达外源基因,建立的HSV-1载体系统可用于构建携载外源基因的复制型重组HSV-1.     

Vero细胞狂犬疫苗的研制

利用自建的狂犬病毒Vero细胞适应株和细胞反应器微载体系统培养Vero细胞和狂犬病毒,病毒滴度达到6．0～8．0log(10)LD(50)／ml。病毒原液纯化后制出的纯化狂犬疫苗质量基本上均能达到WHO对此类型疫苗的主要质控要求。表明疫苗小量试制工艺基本可行。     

一种1型单纯疱疹病毒载体系统的建立

1型单纯疱疹病毒(HSV-1)作为溶瘤病毒和病毒载体的研究已有很长的历史.本研究利用细菌人工染色体技术建立了一种HSV-1载体系统.首先,将HSV-1内部反向重复序列(internal inverted repeat sequences,IR)两侧的片段克隆入p KO5获得穿梭质粒p KO5/BN,其电转含p HSVBAC的大肠杆菌后筛选获得删除IR区重组DNA的p HSVΔIR-BAC.p HSVΔIR-BAC转染Vero细胞获得删除IR区的重组病毒HSVΔIR(MH1001).上述p KO5/BN和含p HSVΔIR-BAC的大肠杆菌构成了HSV-1载体系统.利用该系统获得了表达绿色荧光蛋白EGFP的重组病毒HSVΔIR/EGFP(MH1002).MH1001和MH1002在感染的Vero细胞中增殖水平略低于野生型HSV-1,但无显著差异;Western印迹检测表明,重组病毒早期蛋白质ICP0、ICP4、ICP8、ICP22、ICP27在感染细胞中的表达水平下降;免疫荧光及激光共聚焦检测表明,重组病毒与野生型病毒均存在于细胞质中.以上结果表明,删除IR区的重组HSV-1保留了复制能力,能够携载并表达外源基因,建立的HSV-1载体系统可用于构建携载外源基因的复制型重组HSV-1.     

微载体灌注培养制备Vero细胞狂犬病疫苗

本文研究在生物反应器中用微载体连续灌注培养Vero细胞生产狂犬病毒制备技术.在5L体积的生物反应器中,加入含10g/L微载体的199培养基,接种Vero细胞至细胞浓度达到1×105/mL,培养7d后细胞可生长至6～7×106/mL,然后以感染复数(MOI)为0.01接种狂犬病毒VaG株,接毒后24h开始收获,连续收获12d左右,收获的病毒滴度范围在6.0～8.5log LD50/mL,收获的病毒原液经浓缩、灭活和纯化等步骤制备成疫苗,各项质量指标均达到<中国生物制品规程>2000年版要求.实验表明,用生物反应器微载体灌注培养制备人用Vero细胞狂犬病疫苗小试工艺可行.     

MDCK细胞微载体悬浮培养放大工艺研究

MDCK细胞对各种流感病毒具有高度敏感性,广泛应用于流感病毒的分离和疫苗制备.通过探索培养基中促进细胞贴壁的关键组分,并筛选水解物,开发了适合MDCK细胞生长的低血清培养基.发现钙、镁离子是细胞贴壁不可缺少的物质,麦麸水解物可以部分代替培养基中的血清.利用该低血清培养基,经过消化转移将MDCK细胞从5L反应器放大至25 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,25 L反应器中培养48 h细胞密度可达30.5×105 cells/ml.研究结果为工业规模反应器微载体悬浮培养MDCK细胞生产流感病毒奠定了基础.     

自制多孔微球高密度培养Vero细胞的初步研究

多孔微球是动物细胞高密度培养的有效手段,它是1985年由Verax公司开创的,最初用于流化床生物反应器生产单克隆抗体,后来又出现了Percell和Siran系统系列多孔微球,并且使用的反应器种类和生产的产品都在增加,于是便成为一种新型的细胞培养手段而日益受到人们的重视。为此,我们在利用微载体进行Vero细胞高密度培养的同时,又对多孔微球的制备和培养工艺作了初步探索。     

转瓶培养与生物反应器微载体培养乙脑病毒的比较

分别用15L转瓶与15L生物反应器微载体(2.5g/L CytodexⅢ)系统培养Vero细胞并接种乙型脑炎病毒(简称乙脑病毒)。转瓶培养Vero细胞7~8d,细胞数最高能达到8×108;当单层细胞长至3.0~4.5×108时接种乙脑病毒,病毒滴度能达到6.5~6.98 lg PFU/ml,并能够连续收获4~5次;采用微载体系统培养Vero细胞,细胞密度最高能达到170×108;当单层细胞长至60~70×108时接种乙脑病毒,病毒滴度能达到7~7.5 lg PFU/ml,并能够连续收获13~15次。两种方式培养的乙脑病毒收获液分别经灭活、浓缩、柱层析纯化后制备Vero细胞乙脑纯化疫苗,各项检定指标均符合《中国药典》的相关要求。     

基于魔芋葡甘聚糖微球的胶原覆层型微载体的制备研究

以魔芋葡甘聚糖(KGM)微球为基质,用1,4-丁二醇二缩水甘油醚将KGM微球进行活化,将胶原覆层到微球上,对胶原覆层进行再次交联,得到覆层均匀、稳定的微载体.通过四因素三水平的正交回归组合试验设计,考察了活化时间、蛋白质用量、偶联时间、交联剂用量对微载体细胞培养效果的影响.以Vero细胞培养效果为指标,制备胶原包被微载体的最佳工艺为活化时间5h、蛋白用量1∶0.1(球:蛋白)、偶联时间5h、交联剂用量每1gKGM加入0.5ml交联剂.在最优制备条件下,培养Vero细胞最大细胞密度可达到1.7×106 cells/ml,证明了胶原覆层的KGM微球作为动物细胞培养的微载体具有可行性.     

一次性生物反应器悬浮培养HEK293细胞生产Ad-IFNγ的工艺

腺病毒载体是极具发展前景的基因治疗载体之一,为获得一条新型腺病毒规模化生产工艺,研究采用5 L振荡激流式一次性生物反应器悬浮培养HEK293细胞来生产重组腺病毒载体。细胞经种子链逐步扩增后,接种至AP10生物反应器,采用CD293无血清培养基流加培养悬浮HEK293细胞,细胞密度达约2.0×106个/m L时,以30 MOI(Multiplicity of infection)感染重组Ad-IFNγ(Recombinant adenovirus-interferon gamma),48 h后收获细胞,3次冻融裂解离心收获上清病毒粗产品。采用壳蛋白免疫法快速测定粗产品滴度。结果表明,采用振荡激流式一次性生物反应器,流加HEK293细胞悬浮培养6 d,密度可达2.0×106个/m L,Ad-IFNγ粗产量达1.49×1013 IFU(Infectious unit),单细胞包装量达3 800 IFU/cell。采用阴离子交换层析法纯化重组腺病毒,回收率35.9%。建立了利用5 L激流式一次性生物反应器悬浮培养HEK293细胞生产重组腺病毒载体Ad-IFNγ的初步工艺。     

生物反应器培养轮状病毒基因重配株Ls条件的优化

目的轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在生物反应器微载体培养Vero细胞条件的优化。方法采用3 L生物反应器微载体培养Vero细胞,观察Ls株在不同病毒感染复数(0.001、0.002、0.010、0.040 MOI)、不同温度(34.5℃和35.5℃)、不同病毒收获时间(24和48 h)对病毒增殖的影响。根据病毒滴度和收获量筛选出最适MOI、培养温度及病毒的收获时间。结果以0.002 MOI接种Vero细胞,温度为34.5℃培养病毒,滴度最高达7.50 lg CCID50/m L;48 h可连续收获4次病毒液,且收获总量及病毒滴度均高于24 h。结论通过对Ls株在生物反应器微载体Vero细胞培养条件的优化,获得的病毒液滴度高及连续培养多次收获量增加的有效方法,为进一步规模化培养奠定了基础。     

基于CRISPR-Cas9系统的HSV-1基因治疗载体的快速构建北大核心CSCD

基因改造的1型单纯疱疹病毒(HSV-1)载体在肿瘤溶瘤病毒治疗及基因转导中具有广泛的应用前景。本研究报道一种基于CRISPR-Cas9系统的高效快速的重组HSV-1载体构建方法。首先,双顺反表达靶点g DNA和Cas9核酸酶的基因编辑质粒与同源重组模板质粒共转染Vero细胞后,用亲本株感染细胞;然后,Cas9对胞内病毒基因组定点切割,诱导外源基因同源重组,修复至病毒基因组指定位点。通过PCR、Western印迹、免疫荧光等方法证明,相比于传统自发同源重组的构建方法,该方法能显著提升病毒重组率(4.1%vs 1.1%)。同时,本研究建立了一种新的单克隆病毒纯化方案,简化了阳性病毒筛选步骤。本研究结果提供了一种高效快速的重组HSV-1构建方法,这对于HSV-1相关基因治疗及其病理机制研究将具有重要意义。     

基于CRISPR-Cas9系统的HSV-1基因治疗载体的快速构建

基因改造的1型单纯疱疹病毒(HSV-1)载体在肿瘤溶瘤病毒治疗及基因转导中具有广泛的应用前景。本研究报道一种基于CRISPR-Cas9系统的高效快速的重组HSV-1载体构建方法。首先,双顺反表达靶点g DNA和Cas9核酸酶的基因编辑质粒与同源重组模板质粒共转染Vero细胞后,用亲本株感染细胞;然后,Cas9对胞内病毒基因组定点切割,诱导外源基因同源重组,修复至病毒基因组指定位点。通过PCR、Western印迹、免疫荧光等方法证明,相比于传统自发同源重组的构建方法,该方法能显著提升病毒重组率(4.1%vs 1.1%)。同时,本研究建立了一种新的单克隆病毒纯化方案,简化了阳性病毒筛选步骤。本研究结果提供了一种高效快速的重组HSV-1构建方法,这对于HSV-1相关基因治疗及其病理机制研究将具有重要意义。     

Vero细胞和脊髓灰质炎病毒在无血清条件下的培养探究

目的：探索Vero细胞和脊髓灰质炎病毒在无血清条件下的最佳培养条件,为无血清培养Vero细胞生产脊髓灰质炎疫苗奠定基础。方法选择直接适应（直降组）和序贯适应（驯化组）两种无血清培养方法,观察Vero细胞和脊髓灰质炎病毒在无血清条件下的生长情况,并检测脊髓灰质炎病毒及其病毒滴度。结果 Vero细胞在两种无血清条件下均生长良好,其中驯化组细胞生长速度更接近对照组。以脊髓灰质炎病毒Sabin株Ⅰ型分别感染直降组、驯化组和对照组细胞的病毒滴度平均值分别为8．94、8．81和8．94 LgCCID50/mL;Ⅱ型病毒滴度平均值分别为8．84、8．25和7．94 LgCCID50/mL;Ⅲ型病毒滴度平均值分别为8．91、8．57和8．63 LgCCID50/mL;且3组的变异系数（ CV）均小于10％。结论 Vero细胞在无血清条件下生长良好,无血清培养的Vero 细胞可用作脊髓灰质炎疫苗生产的基质。