链霉菌Streptomyces antibioticus NRRL 8167中Naphthgeranine A生物合成基因簇的分析鉴定

【背景】微生物来源的天然产物是小分子药物或药物先导物的重要来源。对链霉菌Streptomyces antibioticus NRRL 8167的基因组分析显示,其包含多个次级代谢产物的生物合成基因簇,具有产生多种新化合物的潜力。【目的】对链霉菌S. antibioticus NRRL 8167中次级代谢产物进行研究,以期发现结构新颖或生物活性独特的化合物,并对相应产物的生物合成基因簇和生物合成途径进行解析。【方法】利用HPLC图谱结合特征性紫外吸收和LC-MS方法,排除S. antibioticus NRRL 8167产生的已知化合物,确定具有特殊紫外吸收的化合物作为挖掘对象,然后利用正、反相硅胶柱色谱、高效液相色谱等技术对次级代谢产物进行分离纯化,分离化合物。利用质谱及核磁共振光谱技术对化合物结构进行解析和鉴定;提取链霉菌S. antibioticus NRRL 8167基因组DNA,利用PacBio测序平台进行基因组测序;利用生物信息学对基因组进行注释,并对合成该化合物的基因簇进行定位分析,推导其生物合成途径。【结果】确定这个化合物是NaphthgeranineA,属于聚酮类化合物。全基因组序列分析发现S.antibioticusNRRL8167基因组含有28个次级代谢产物生物合成基因簇,其中基因簇20可能负责Naphthgeranine A的生物合成,并对其生物合成途径进行了推导。【结论】基于紫外吸收光谱和质谱特征,从S. antibioticus NRRL 8167菌株的发酵提取物中分离鉴定了一个聚酮类化合物Naphthgeranine A。该菌株的全基因组测序为其生物合成基因簇的鉴定提供了前提,对Naphthgeranine A生物合成基因簇和生物合成途径的推测为进一步研究这个化合物的生物合成机制奠定了基础。     

三烷基取代芳香聚酮gombapyrones生物合成基因簇的确认及其生物合成推导

【目的】本研究旨在确认链霉菌Streptomyces rubellomurinus ATCC 31215来源芳香聚酮化合物(gombapyrones, GOMs)的生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster, BGC),并对其生物合成途径进行推导。【方法】对链霉菌S. rubellomurinus ATCC 31215进行大规模发酵及提取分离,得到GOM-B和GOM-D;以三烷基取代芳香聚酮生物合成途径保守存在的P450单氧化酶的蛋白序列作为探针,在GOMs产生菌S. rubellomurinus基因组中进行BLAST搜索获得潜在的GOMs生物合成基因簇(gom BGC);通过对gom BGC中的聚酮合成酶(polyketide synthase, PKS)结构基因进行同框缺失突变,对突变株发酵产物进行高效液相色谱-质谱(highperformanceliquidchromatography-massspectrometry,HPLC-MS)分析以确认gomBGC与GOMs的产生相关;基于生物信息学分析,推导GOM-B的生物合成途径。【结果】从S. rubell...     

长松萝中一个聚酮合酶基因簇的克隆和鉴定

【目的】探索药用地衣长松萝(Usnea longissima Ach)聚酮化合物的生物合成基因簇,克隆聚酮合酶(PKS)基因并分析其功能。【方法】以长松萝地衣型真菌为材料,通过巢氏PCR获得聚酮合酶基因片段和原位杂交筛选基因组文库获得聚酮合酶基因及相邻基因簇。并对获得聚酮合酶进行分子系统进化分析和基因表达分析。【结果】获得药用地衣长松萝中的编码聚酮合酶基因UlPKS5的全长序列以及相邻修饰基因β-内酰胺酶和脱水酶。聚酮合酶UlPKS5含有酮体合成酶(KS),酰基转移酶(AT),产物模板(PT)以及酰基载体蛋白(ACP)结构域。分子系统进化分析显示UlPKS5属于非还原型聚酮合酶中第五组,与蒽醌类化合物生物合成相关。通过半定量RT-PCR分析表明山梨醇(10%)和蔗糖(2%和10%)能够强烈诱导UlPKS5基因表达。【结论】聚酮合酶(UlPKS5)及相邻修饰基因β-内酰胺酶和脱水酶与长松萝中蒽醌类化合物生物合成相关。     

萘醌-氧吲哚生物碱coprisidins生物合成途径的研究（英文）

【目的】新颖结构的天然萘醌-氧吲哚类生物碱coprisidins(A和B)分离自昆虫肠道相关链霉菌,具有预防癌症的活性。作为首例具有萘醌-氧吲哚骨架的生物碱,对其独特生物合成机理的研究可为Ⅱ型聚酮类化合物生物合成途径提供新的认知。【方法】本研究对coprisidins的产生菌Streptomycessp.SNU607进行全基因组测序,并根据测序结果的生物信息学分析初步定位coprisidins的生物合成基因簇;通过基因敲除以及异源表达手段确定coprisidins的生物合成基因簇;基于体内遗传学实验与生物信息学分析初步推导coprisidins的生物合成途径。【结果】Streptomyces sp. SNU607中有23个基因簇可能参与次级代谢,其中4个基因簇与聚酮合酶(PKS)相关;通过基因敲除与异源表达实验,本研究证实1个Ⅱ型PKS负责coprisidins的生物合成;基于生物信息学分析,我们推测copH/I/M/O/N构成了1个基因盒,并负责起始单元丁酰CoA的合成;KSβ(Cop B)的序列比对表明coprisidins的Ⅱ型PKS系统更倾向于合成C20的初始聚酮链。【结论】Coprisidins的萘醌-吲哚结构是由Ⅱ型PKSs催化形成,我们推测丁酰Co A是coprisidins聚酮骨架的起始单元,在最小PKS、聚酮酶、环化酶的催化下先形成类似蒽环的四环系统,随后在后修饰酶与氧化重排的作用下生成萘醌-氧吲哚骨架。本研究为进一步探究萘醌-氧吲哚类生物碱的生物合成机制奠定了基础,同时增加了Ⅱ型PKSs合成产物的结构多样性。     

聚酮类化合物生物合成基因簇与药物筛选

由微生物和植物产生的聚酮类化合物的数量极其庞大,是一大类结构多样化和生物活性多样性的天然产物,已经成为新药的重要来源.介绍了3种类型聚酮类化合物生物合成基因簇的特点,即以模块形式存在的I型聚酮合酶,包含一套可重复使用结构域的Ⅱ型聚酮合酶以及不需要ACP参与,以植物中的查耳酮合酶为代表的Ⅲ型聚酮合酶.同时,还介绍了基于3种类型聚酮类化合物生物合成基因的特点,利用分子生物学方法构建筛选探针,进行当前药物基因筛选的进展.     

海洋来源节菱孢菌ZSDS1-F3中PKS-NRPS类天然产物挖掘

【目的】以基因组信息为指导,定向激活海洋来源真菌Arthrinium arundinisZSDS1-F3中沉默的聚酮合成酶-非核糖体肽合成酶(PKS-NRPS)类生物合成基因簇,鉴定次级代谢产物结构。【方法】通过启动子工程和异源表达的策略激活实验室培养条件下沉默或低表达的生物合成基因簇,实现目标化合物的分离,通过HR-ESI-MS和NMR数据分析鉴定产物结构,结合基因重组和生物信息学分析结果推导化合物的生物合成途径。【结果】依据基因组生物信息学分析,从海洋来源真菌A. arundinis ZSDS1-F3中选取一个编码PKS-NRPS类次级代谢产物的生物合成基因簇开展研究,在宿主Aspergillus nidulansA1145中实现了基因簇的异源表达,从中分离到2个新化合物,并推导了其生物合成途径。【结论】基因组信息指导下的天然产物挖掘,可以目标明确地分离产物,加快真菌中新颖天然产物的发现步伐。     

石磺来源海洋链霉菌Streptomyces ardesiacus SCSIO LO23中germicidin类化合物的分离鉴定及其生物合成分析

海洋共附生放线菌具有生产结构特殊和活性显著化合物的潜力。【目的】以海洋软体动物石磺Onchidium sp.来源共附生海洋链霉菌Streptomyces ardesiacus SCSIO LO23为研究对象,分离并鉴定其次级代谢产物结构,分析化合物的生物合成基因簇及其生物合成途径。【方法】采用多种培养基对该菌株进行发酵优化并放大发酵,利用多种柱色谱方法分离得到germicidin类化合物,并利用波谱学手段和X-Ray单晶衍射技术完成化合物的结构鉴定;利用Illumina HiSeq对目标菌株进行全基因组测序,结合antiSMASH和BLAST在线分析软件实现菌株中germicidin类化合物生物合成基因功能注释和生物合成途径分析,并通过异源表达进一步确定其生物合成基因。【结果】从AM3培养基发酵产物中分离鉴定了6个吡喃酮类化合物germicidinA(1)、germicidinB(2)、germicidin D (3)、germicidin H (4)、isogermicidin A (5)和isogermicidin B (6),其中化合物2和6对斑马鱼神经行为有显著兴奋作用。通过对...     

洛伐他汀工业菌株土曲霉HZ01的次级代谢产物合成分析

【目的】分析洛伐他汀工业生产菌株土曲霉HZ01的次级代谢产物合成能力,为后期的遗传改造、次级代谢产物及其基因簇挖掘提供指导。【方法】对洛伐他汀发酵条件下的样品进行了转录组分析,同时运用色谱分离技术及波谱学方法对主要次级代谢产物进行了分离和结构鉴定。【结果】洛伐他汀合成相关基因转录水平非常高,还有4个聚酮合酶(PKS)、6个非核糖体多肽合成酶(NRPS)和1个PKS-NRPS杂合酶基因进行了转录,其他PKS和NRPS基因都处于沉默状态。此外,从该菌的发酵产物中分离鉴定了10个主要副产物并确定了其结构。【结论】土曲霉HZ01是一株优良的洛伐他汀生产菌株,在构建次级代谢产物异源合成细胞工厂和鉴定次级代谢产物生物合成途径方面具有很好的应用潜力。     

永兴岛白穗软珊瑚共附生放线菌筛选及部分活性次级代谢产物的鉴定

【目的】从白穗软珊瑚中分离和鉴定共附生放线菌,运用PCR技术对所分离的放线菌进行I型聚酮合酶(PKS)筛选,研究其次级代谢产物。【方法】使用11种培养基对白穗软珊瑚共附生放线菌进行分离、鉴定,构建16S rRNA基因系统发育进化树,以基于I型PKS的KS基因设计的简并引物对所分离放线菌进行基因筛选,对阳性菌株用3种培养基发酵检测,对目标菌株进行放大规模发酵分离鉴定次级代谢产物。【结果】从白穗软珊瑚中分离到20株共附生放线菌,包括链霉菌属10株、迪茨氏菌属2株和盐水孢菌属8株,筛选获得18株I型PKS阳性菌株,并从菌株Salinospora arenicola SH04中分离到化合物rifamycin S和rifamycin W。【结论】首次从珊瑚共附生环境中分离得到海洋专属性稀有放线菌盐水孢菌属,并以I型PKS基因筛选为指导,分离鉴定了聚酮类化合物rifamycins,为研究软珊瑚共附生可培养放线菌的多样性和基于基因筛选指导分离次级代谢产物提供了可靠依据。     

非核糖体多肽Surugamides生物合成基因簇镶嵌式结构的解析

【目的】多肽化合物Surugamides(sgm)生物合成基因簇包含4个非核糖体多肽合酶(NRPS)基因surA–D,负责2个NRPS生物合成途径。已有报道确认surA基因与SurugamideA产物相关,而surB基因与sgm F产物相关,但对surC和surD基因功能的归属尚没有实验证据。本工作拟在之前研究的基础上进一步确认surA和surD负责Surugamide A产物生物合成,为基因工程改造Surugamides生物合成途径以及研究其NRPS蛋白之间的识别机制提供理论依据。【方法】从海绵中分离放线菌并通过16S rRNA基因序列比对分析其分类单元。通过在线数据库antiSMASH分析基因组序列,发现天然产物生物合成基因簇。通过UPLC-Q-TOF-MS和~(13)CNMR鉴定化合物结构。把构建完成的同源重组双交换质粒导入链霉菌宿主后筛选基因缺失或替换突变株。【结果】从胄甲海绵来源链霉菌S.albidoflavus LHW3101基因组中发现了Surugamides生物合成基因簇,确认了该菌株发酵产物中的化合物sgmA和sgm F。构建了surB和surC基因同时缺失的突变株RJ9,发现RJ9不再产sgm F而仍然产Surugamide A。在缺失突变surB和surC基因的同时在surD基因前引入了组成型强启动子ermEp*,结果发现RJ9产SurugamideA水平是野生型菌株的约2倍。【结论】确认了surB和surC基因与sgmA产物无关。在surD基因前引入强启动子后显著提高了SurugamideA的产量,提示surD基因与sgmA产物相关,结合已报到surA基因与Surugamide A产物相关的证据,进一步确认了surA和surD基因负责Surugamide A生物合成的推论。     

珠江口沉积物来源链霉菌SCSIO 40020中bafilomycins的鉴定及其生物合成基因簇的异源表达

[目的] 从珠江口沉积物来源的菌株SCSIO 40020中分离bafilomycins,并对其生物合成基因簇进行克隆和异源表达研究。[方法] 通过分析菌株SCSIO 40020的16S rRNA基因序列并构建系统发育树以鉴定菌种,以柱层析法和制备色谱法对次级代谢产物进行分离纯化,借助波谱学手段完成单体化合物的结构鉴定,采用生物信息学分析定位bafilomycins的生物合成基因簇,通过筛选菌株SCSIO 40020基因组的细菌人工染色体文库和接合转移将bafilomycins生物合成基因簇导入3种链霉菌进行异源表达,利用高效液相色谱检测异源表达菌株的发酵产物。[结果] 菌株SCSIO 40020被鉴定为链霉菌属菌株,从其发酵产物中分离鉴定了2个单体化合物bafilomycins A₁和D。克隆了链霉菌SCSIO 40020中bafilomycins的生物合成基因簇并推导了其生物合成途径,在3种链霉菌中表达产生了bafilomycins。[结论] 从珠江口环境中获得了一株产生bafilomycins的链霉菌SCSIO 40020,成功建立了该菌株次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达体系,并首次在链霉菌Streptomyces lividans SBT18、Streptomyces coelicolor M1154和Streptomyces albus J1074中进行了表达,获得了bafilomycins,为后续bafilomycins结构类似物的生产和链霉菌SCSIO 40020中新结构活性化合物的挖掘奠定了基础。     

一种适用于链霉菌异源合成基因簇同框缺失的高效方法

【背景】对抗生素生物合成途径的阐明有助于提高目标化合物的产量并开发具有更高活性的新化合物。基因的同框缺失是天然产物生物合成研究的常规手段,通过分析突变菌株积累的中间产物,可以帮助推导天然产物的合成途径及相关基因的功能。天然产物生物合成基因簇的大小一般在20 kb以上,对每个基因进行同框缺失耗时耗力,因此,优化链霉菌来源的基因同框缺失的方法有重要的意义。【目的】基于PCR-targeting重新设计了一套在链霉菌柯斯文库质粒上进行基因同框缺失的方法,实现链霉菌基因在大肠杆菌中快速、高效的基因同框缺失的技术体系。【方法】使用氨苄青霉素抗性基因bla作为PCR-targeting DNA片段的筛选标记,同时使用体外的Pac I酶切和酶连系统代替体内的Flp/FRT系统来介导同框缺失的构建。【结果】利用这种方法,在6 d内完成了米多霉素生物合成基因簇中14个基因的同框缺失。【结论】此方法与传统的PCR-targeting方法相比,构建同框缺失载体的效率明显提高;Pac I识别序列在链霉菌基因组上的稀有性使得此方法在构建抗生素生物合成基因簇必需基因的同框缺失载体上具有普适性。     

卡伍尔氏链霉菌NA4的Ⅱ型聚酮基因簇的靶向激活及其产物鉴定

【目的】以基因组信息为导向,定向激活海洋来源卡伍尔氏链霉菌（Streptomyces cavourensis） NA4中沉默的Ⅱ型聚酮类次级代谢产物生物合成基因簇,鉴定新产生的次级代谢产物的结构和抑菌活性。【方法】通过添加启动子和敲除负调控基因的方法激活实验室培养条件下沉默或低表达的生物合成基因簇,并完成目标化合物的分离与纯化,通过电喷雾质谱（electrospray ionization-mass spectrometry,ESI-MS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）数据分析鉴定目标化合物结构,对目标化合物进行抑菌活性鉴定,基于生物信息学信息推导化合物的生物合成途径。【结果】根据基因组生物信息学分析,从海洋来源链霉菌Streptomyces cavourensis NA4中选取一个编码PKSⅡ型次级代谢产物的生物合成基因簇开展研究,成功激活目标基因簇,从中分离到1个PKSⅡ型化合物,推导了其生物合成途径并进行了抑菌活性鉴定。【结论】基因组导向下的天然产物挖掘,可以目标明确地分离产物,充分挖掘链霉菌编码次级代谢产物的潜力。     

链霉菌CB02959中四霉素及四烯菌素的鉴定及培养基优化

【背景】四霉素(Tetramycin)和四烯菌素(Tetrin)是具有广谱抗真菌活性的四烯大环内酯类抗生素。链霉菌CB02959是一株雷纳霉素(Leinamycin)类化合物的潜在产生菌株,利用antiSMASH分析其基因组发现该菌株含有一个纳他霉素(Natamycin)类四烯大环内酯化合物的生物合成基因簇。【目的】对Streptomyces sp. CB02959中次级代谢产物进行研究,确定其是否可以产生四烯大环内酯化合物,对其发酵产物进行分离和结构鉴定,并进行初步的发酵优化以提高产量。【方法】基于生物信息学预测和高分辨质谱数据,推测CB02959中多烯化合物的结构;在不同发酵培养基中培养CB02959,确定适合大规模发酵的培养基;敲除tetrA基因以确定目标基因簇和四烯大环内酯化合物产生的相关性;分离和鉴定CB02959产生的主要代谢物的结构;通过改变培养基中葡萄糖、麦芽提取物和胰蛋白胨的含量,提高四烯大环内酯化合物的产量。【结果】通过对CB02959中纳他霉素类化合物生物合成基因簇的分析及16S rRNA基因序列的进化树分析,推测CB02959可能是一株新的四霉素和四烯菌素产生菌;在YEME发酵培养基中对CB02959进行大规模发酵,分离得到4个化合物,鉴定为四霉素A (1)、四霉素B (2)、四烯菌素A (3)、四烯菌素B (4);最后通过培养基的初步优化,将化合物1–4的产量分别提高至208.1、100.0、1 315.6、109.9 mg/L。【结论】通过基因组挖掘策略发现了一株新的四霉素和四烯菌素产生菌链霉菌CB02959,并通过培养基优化提升了其四烯大环内酯化合物的产量,此发现为这类抗真菌天然产物的后续开发奠定了基础。     

珊瑚来源真菌Parengyodontium album SCSIO SX7W11中聚酮化合物的发现及其生物合成途径分析

海洋来源真菌的天然产物因其独特的结构与生物学活性而备受关注,而利用基因组信息对其代谢产物进行深入挖掘也成为研究策略之一。[目的] 本文以一株南海珊瑚来源的真菌Parengyodontium album SCSIO SX7W11为目标菌株,挖掘其生产聚酮类化合物的潜能。[方法] 本研究利用Illumina Miseq技术对SX7W11菌株进行全基因组扫描测序,运用生物信息学手段对其基因组的生物合成基因簇进行预测和基因功能注释,挖掘可能产生新颖聚酮化合物的基因簇。对SX7W11进行放大发酵后,利用正相色谱、中压反相色谱、Sephadex LH-20凝胶色谱、HPLC半制备等分离手段分离纯化出单体化合物。再利用高分辨质谱（HR-ESI-MS）、¹H NMR、¹³C NMR、X-ray单晶衍射等波谱手段确定化合物的结构,并根据生物合成基因簇对化合物的生物合成途径进行推导。[结果] 全基因组扫描测序结果显示,P.album SCSIO SX7W11基因组大小为34.0 Mb,含有24个生物合成基因簇,包括6个聚酮合酶基因簇以及3个萜烯合酶基因簇。从发酵产物中分离鉴定到3个聚酮类化合物：emodin（1）、alternaphenol B（2）和sydowinin A（3）,其中化合物3获得了单晶结构数据。通过生物信息学方法从菌株基因组中定位到了sydowinin A的生物合成基因簇。结合文献对emodin（1）、alternaphenol B（2）和sydowinin A（3）的生物合成途径进行了分析。[结论] 本研究通过基因组挖掘及培养基优化,发现1株珊瑚来源的真菌P.album SCSIO SX7W11具有生产sydowinins类聚酮类化合物的能力,为该类化合物生物合成机制深入研究奠定了基础。     

红色红曲菌M7的丝衣霉酸基因簇及其功能研究

【目的】明确红色红曲菌(Monascus ruber) M7的基因组中是否存在丝衣霉酸(byssochlamic acid, BA)基因簇,并探讨BA基因簇中聚酮合酶基因mr-Bys及3-羟酰基辅酶A脱氢酶基因mr-hdh对BA产生的影响。【方法】采用生物信息学方法对M7基因组进行分析,以确定BA候选基因簇;以基因敲除及过表达方法研究mr-Bys和mr-hdh对BA产生的影响;以超高效液相色谱(ultra-performance liquid chromatography, UPLC)和质谱(mass spectrometry, MS)方法分析BA。【结果】在红色红曲菌M7基因组中发现了BA基因簇,敲除mr-Bys后,BA消失,而敲除和过表达mr-hdh均可影响BA的产生。【结论】红色红曲菌M7基因组中存在BA基因簇,可产生BA。研究结果不仅丰富了红曲菌次生代谢产物及其合成途径的相关研究,也为以红曲菌为菌种开发新产品奠定了基础。     

稀有放线菌Lechevalieria rhizosphaerae NEAU-A2的次级代谢产物研究及遗传操作系统的建立

【背景】菌株Lechevalieria rhizosphaerae NEAU-A2是一株新的稀有放线菌,其基因组中包含多个与次级代谢产物生物合成相关的基因簇,具有产生丰富代谢产物的潜力。【目的】对稀有放线菌L. rhizosphaerae NEAU-A2的次级代谢产物进行研究,以期发现结构新颖或生物活性独特的化合物,并建立其遗传操作系统。【方法】应用硅胶柱色谱和高效液相色谱等方法对菌株NEAU-A2的次级代谢产物进行分离和纯化,整合质谱分析、核磁共振等方法进行结构解析。在对该菌株全基因组测序的基础上,以基因组序列中编码杂合的聚酮合酶-非核糖体肽合成酶(PolyketideSynthase-Nonribosomal Peptide Synthetase,PKS-NRPSs)基因1609为目标基因,利用PCR-Targeting介导的基因置换技术构建重组质粒,通过接合转移的方式导入野生菌株。【结果】从菌株NEAU-A2中分离鉴定了2个新的吲哚二聚化合物(1,2)和5个已知化合物N-乙酰色胺(3)、4-((2-(1H-Indol-3-Yl)Ethyl)Amino)-4-Oxobutanoic Acid (4)、Brevianamide F (5)、4S,7R-Germacra-1(10)E,5E-Diene-11-Ol (6)、1H-吡咯-2-羧酸(7)。接合子通过培养2代即可获得双交换突变菌株,PCR分析结果显示PKS-NRPS基因被成功中断。【结论】从稀有放线菌L. rhizosphaerae NEAU-A2中分离鉴定出7个化合物,并成功建立了该菌的遗传操作系统。