PCR法检测外环境水中脊髓灰质炎病毒Ⅰ型基因的研究

应用聚合酶链反应（PCR）技术检测外环境水中分离的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型（PVⅠ）毒株基因型,发现所分离的22株病毒．均为疫苗SabinⅠ相关株．脊髓灰质炎病毒的温度敏感（T特征）试验亦提示为弱毒株,与PCR试验相吻合。表明在实施强化免疫和常规免疫后,外环境中的脊髓灰质炎病毒已被疫苗相关株循环所取代。同时证实用PCR作为环境中PVⅠ病毒株的基因型分析的检测方法是特异和敏感的。     

用于狂犬病单克隆抗体中和活性检测病毒库的制备及初步应用

以狂犬病街毒株为攻击病毒建立检测狂犬病单克隆抗体中和活性的方法。小鼠脑内接种分离扩增狂犬病阳性标本24株;分离到的街毒株在N2A细胞进行培养及病毒滴度测定,选择能够适应N2A细胞生长且滴度较高的街毒株建立病毒库;建立方法后对TRN006单克隆抗体进行3次检测,评价其重复性。24份狂犬病阳性标本均分离成功;只有15株病毒能够适应N2A细胞,并在细胞上形成荧光灶;最终选取10株滴度较高病毒建立病毒库,该病毒库覆盖了中国9个不同省份及四个中国毒株群;用其中三种病毒对狂犬病单克隆抗体进行中和活性检测3次,T检验发现其具有良好的重复性。     

PCR法检测外环境水中脊髓灰质炎病毒I型基因的研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测外环境水中分离的脊髓灰质炎病毒Ｉ型（ＰＶＩ）毒株基因型,发现所分离的２２株病毒,均为疫苗ＳａｂｉｎＩ相关株,脊髓灰质炎病毒的温度敏感（Ｔ特征）试验亦提示为弱毒标,与ＰＣＲ试验相吻合,表明实施强化免疫和常规免疫后,外环境中的脊髓灰质炎病毒已被疫苗相关株循环所取代,同时证实用了ＰＣＲ作为相环境中ＰＶＩ病毒株的基因型分析的检测方法是特异和敏感的。     

尼帕病毒Taqman qRT-PCR检测方法的建立

尼帕病毒(NiV)是一种高致病性人畜共患病原体,可引起人类致死性脑炎和严重的呼吸系统疾病,目前尚无有效的抗NiV药物和疫苗,建立NiV检测方法十分必要。建立针对尼帕病毒N基因的Taqman qRT-PCR检测方法,应用于样本尼帕病毒检测及定量。针对尼帕病毒N基因保守区域设计引物和探针,建立Taqman qRT-PCR检测方法,评价该检测方法灵敏度、特异性和可重复性,并应用此方法进行样本检测。本研究建立的Taqman qRT-PCR检测方法可以特异性的检测尼帕病毒,检测灵敏度为10~2拷贝/μL,标准曲线线性范围为1.0×10~9～1.0×10~2拷贝/μL,可重复性较好,能够有效检出尼帕病毒马来西亚病毒株和孟加拉病毒株,可用于样本尼帕病毒的检测及定量。     

辽宁发现库蚊黄病毒

2011年从辽宁省丹东地区蚊虫样品中分离到6株病毒,采用逆转录-聚合酶链式扩增(RT-PCR)检测方法,结果黄病毒属通用引物和库蚊黄病毒特异性引物均为阳性。6株病毒核苷酸序列经基因库(GenBank)比对后,证实6株病毒为库蚊黄病毒,为我国首次报道。将病毒NS5基因和E基因核苷酸序列与GenBank中10株库蚊黄病毒参考毒株核苷酸序列进行比较,并构建遗传进化树,结果显示本次分离的6株病毒与美国和日本的毒株亲缘关系较近。     

蓝舌病毒野毒株及疫苗株S10基因多态性分析研究

对中国蓝舌病毒1株疫苗株、31株野毒株及1株南非毒株进行测序。结果揭示33株毒株S10基因核苷酸长度均为822bp,S10基因为基因内基因,其核苷酸链的第20～22和59～61位有两个起始密码子,共有终止子在707～709位,预测编码NS3和NS3A两种蛋白;32株中国毒株间核苷酸差异0～107个,同源性86%～100%; NS3蛋白氨基酸差异0～10个,同源性956%～100%。测序毒株与GenBank中9株其它毒株比较,建立的S10基因系统发生树,将蓝舌病毒分为China group和US group两大基因群,两大群的同源性为85%;US group包括美国8株及南非1株毒株;China group包括中国32株及澳大利亚1株毒株;说明蓝舌病毒S10基因分群与毒株的地理区域来源有关。在国内首次进行了全国较大范围内蓝舌病毒分子流行病学调查,揭示了我国蓝舌病毒毒株的遗传多样性。     

牛副流感病毒3型的分离鉴定

从黑龙江省某牛场患有呼吸道疾病的病牛鼻液中分离到1株病毒, 该病毒能在MDBK细胞上增殖并产生特征性细胞病变, 对分离毒株进行理化特性、RT-PCR鉴定及序列测定与分析, 结果发现该病毒为RNA病毒, 具有血凝性, 对乙醚、氯仿极其敏感, 不耐热, 对酸的抵抗力差; 分离株与GenBank中已发表的病毒株N基因片段的同源性为82.6%~99.1%, 结果表明分离的病毒为牛副流感病毒3型毒株, 命名为BPIV3 DQ1株。根据GenBank上发表的牛副流感病毒3型核衣壳蛋白N基因序列, 设计合成了一对特异性引物, 能扩增704 bp的目的片段, 可以检测出10个 TCID50/100 μL病毒核酸。     

牛源流行性出血病病毒(EHDV)血清10型毒株在我国的分离鉴定

我国存在多种血清型流行性出血热病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)的流行,但尚未有关于EHDV-10型毒株的分离报道。为了解云南省EHDV的流行情况,2012～2015年,本研究在云南省设立江城、师宗、芒市三个监控点,定期采集监控动物血液,接种幼仓鼠肾细胞(Baby hamster kidney cell,BHK-21)进行病毒分离;通过PCR检测、血清中和试验、琼脂糖凝胶电泳和电镜观察等方法对分离病毒进行鉴定;对分离毒株的Seg-2/VP2与Seg-3/VP3基因节段进行克隆、测序与序列分析。2013年在云南省师宗县的哨兵牛上分离出一株EHDV毒株(YNSZ-V277-2013),病毒可引起BHK-21细胞出现圆缩、裂解的细胞病变(Cytopathic effect,CPE);电镜下病毒粒子呈球形,无囊膜,表面有大量纤维突,直径在70～80nm之间;病毒基因组dsRNA的琼脂糖凝胶电泳显示分离毒株与其他血清型EHDV一致,呈现"3-3-3"的电泳带型;序列分析显示YNSZ-V277-2013毒株的Seg-2/VP2与Seg-3/VP3序列与日本EHDV-10型毒株(ON-4/N/98)相似度最高,分别为97.5%/98.5%与98.1%/99.8%,证实分离毒株为EHDV-10型;系统发育分析显示YNSZ-V277-2013毒株的Seg-2与日本EHDV-10型毒株(ON-4/N/98)的亲缘关系最近,Seg-3与分离至日本和澳大利亚的EHDV毒株同属Eastern型。本研究首次报道了EHDV-10型毒株在我国的分离以及分离毒株的Seg-2与Seg-3基因序列特征,为进一步开展中国EHDV-10型的流行病学调查与致病性研究提供了基础。     

高致病性禽流感病毒H5N1中和抗体的单链抗体构建与活性鉴定

在本实验室研制出的多株针对H5N1血凝素的鼠单抗中,10F7对34株H5N1病毒株都有血凝抑制和中和活性,具有特异性高、反应性强、识别谱广的特点。通过基因工程构建10F7单链抗体(scFv)表达重组质粒,在大肠杆菌中表达并纯化scFv,经血凝抑制实验及中和实验检测其活性。结果在针对3株病毒的血凝抑制实验中,10F7scFv蛋白对其中2株H5N1病毒均显示出结合活性,而对H9毒株没有反应。在针对7株H5N1病毒的中和实验中,10F7scFv对5株病毒具有较好的中和能力。H5N1广谱中和抗体10F7的单链抗体构建,为进一步研制针对H5N1禽流感病毒的治疗性抗体奠定了基础。     

一株牛源阿卡斑病毒的分离鉴定

阿卡斑病毒(Akabane virus,AKV)是能引起牛、绵羊、山羊流产、早产、新生胎儿畸形的虫媒性RNA病毒。为了解家畜虫媒病毒在我国西南边境地区的分布和流行情况,本研究对中缅边境西盟县的52份牛抗凝血和140份血清(牛70份、羊70份)中的蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、鹿流行性出血热病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)、AKV等虫媒病毒进行检测与分离,通过ELISA及qRT-PCR方法检测病毒,通过核酸阳性抗凝血接种BHK细胞传代以分离病毒,通过设计特异性引物,扩增分离毒株S基因721bp片段及M基因816bp片段,通过克隆测序及中和试验以鉴定病毒,最终从38号牛的抗凝血中分离到一株AKV,TCID50为10-3.5/0.1mL,经比对,分离株S片段与日本KS-2/Mo/06毒株亲缘关系最近,核苷酸同源性为97.66%,M片段与中国DHL10M110毒株亲缘关系最近,核苷酸同源性为96.56%。本研究首次报告了从云南边境地区牛群中分离到AKV,证实了西南边境存在AKV的流行,为AKV在我国的流行病学和边境地区疫病风险防控提供了重要参考及有力依据。     

仙台病毒黑龙江省地方株的分离与鉴定

目的自本省普通级实验动物中分离并鉴定出仙台病毒地方毒株,为建立仙台病毒血清抗体检测方法奠定基础。方法通过鸡胚尿囊腔传代自普通级小鼠肺脏分离病毒,经血凝实验、血凝阻断实验和结构基因序列测定对分离得到的病毒进行鉴定;大量繁殖病毒并通过蔗糖密度梯度离心纯化,免疫动物制备阳性血清,用标准试剂盒检测阳性血清效价。结果自150份小鼠肺脏分离到2株有血凝性的病毒,经形态学、血清学和结构基因序列测定鉴定为仙台病毒,命名为SV-HLJ。SV-HLJ与标准毒株Fushimi核蛋白基因(N)的核苷酸、氨基酸同源性分别为99·6%和99·0%。结论分离并鉴定出了仙台病毒黑龙江省地方毒株,为检测试剂盒的研制奠定了基础。     

利用表面增强拉曼光谱技术分析温度及pH值对H1N1亚型流感病毒增殖的影响

表面增强拉曼光谱(SERS)是一种基于纳米颗粒的拉曼光谱,可以高灵敏度地检测流感病毒等重要病原微生物,鉴定不同毒株间的差异。为了建立一种快速检测流感病毒SERS的方法,本实验利用SERS技术对流感病毒H1N1亚型不同毒株在不同温度和pH值的条件下进行了病毒毒价强弱的检测,将流感病毒样品与金纳米颗粒混合静置后用拉曼共聚焦显微镜进行激光扫描。结果显示在pH为7.2、温度为37℃的条件下3个H1N1亚型的毒株SERS检测结果显示均出现至少1个大于(或等于)3 000的峰值,该状态下病毒毒价最强,最适合病毒生长。另外,细胞生物学方法与SERS技术结果一致,检测中均表现出较好的稳定性和准确性。     

医院污水中脊髓灰质炎等肠道病毒消长动态的初步观察

在废水中有100种以上对人有致病性的不同类型肠道病毒,浓度可达到10,000～100,000PFU/升,并且有在水中存活数月的能力。因此加强水中病毒的监测,并根据不同季节病毒存在动态给予严格地消毒措施,是控制疾病流行的有力保证。     

SMV不同毒株在大豆植株内的病毒浓度比较

用SMV不同毒株接种大豆后,定期检测植株体内的病毒浓度。结果各毒株接种48小时后即在部分植株顶芽内洲出病毒,按种后20—25天植株内病毒含量最高。     

一株广谱中和抗原性出血热病毒株的发现

一株分离自杭州市褐家鼠的出血热病毒Gou_3株的免疫血清对10株I型病毒的中和滴度除二株为160外均为320,而对4株Ⅱ型病毒的滴度为320—640,说明Gou_3株免疫血清对两型毒株中和效价大多数无差异或只差2倍,是一株中和抗原广谱的毒株。用I型和Ⅱ型毒株免疫血清对Gou_3株进行型别检定结果表明Gou_3株是Ⅱ型病毒。     

口蹄疫病毒热驯化及生物学特性分析

口蹄疫（Foot and mouth disease, FMD）是一种全球性的、感染偶蹄动物的传染病。病毒衣壳对温度，pH敏感，容易在疫苗生产及储存过程中裂解为免疫原性较低的五聚体，影响疫苗的质量。口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus, FMDV）对热敏感的机制研究对于疫苗抗原稳定性意义重大。本文通过循环热应激驯化方式诱导基因突变向耐热性发展，经噬斑纯化获得了驯化毒株M3,M9和M10。通过多序列比对分析发现驯化毒株P1区发生氨基酸突变，一步生长曲线表明驯化毒株氨基酸突变基本不影响病毒的复制，而驯化毒株相比野生型毒株衣壳耐热性有显著提高。驯化毒株M10单一位点突变（A1013T）增强衣壳稳定性，表明A1013T位点对于O型FMDV毒株衣壳耐热性的重要性，但机制仍待后期进一步阐明。该研究将为制备耐热性的FMD疫苗提供了理论依据。     

几种鸡传染性支气管炎病毒活疫苗对中国流行毒株CK/CH/LDL/97I的保护作用评价

选择我国应用的五株鸡传染性支气管炎活疫苗毒株(JAAS、IBN、Jlin、J9和H120)和当地流行毒株(CK/CH/LDL/97 Ⅰ)作为研究对象,对其S1基因进行序列比对分析,结果表明疫苗株与流行毒株的核昔酸序列及推导的氨基酸序列同源性分别不超过76.4%和78.7%.S1基因的核苷酸系统发育树显示,疫苗株与流行毒株分属不同进化群,亲缘关系较远,属于不同的基因型.用这五株活疫苗进行针对强毒株CK/CH/LDL/97Ⅰ株的免疫保护实验,可见临床发病率为30%～100%;攻毒5d后每组随机扑杀10只鸡,采集器官,应用RT-PCR法检测病毒,气管样品病毒检出率为50%～90%,肾脏样品病毒检出率为10%～30%.由此可见:我国目前使用的主要活疫苗对异种IBV分离株的感染不能提供完全的保护作用.     

汉坦病毒沟3株PCR分型

汉坦病毒(HV)沟3株在以往报道的免疫学中和效价检测,为一株中和抗原广谱的毒株。本研究对这一毒株经过两次挑斑纯化,并经PCR方法进行分型检定,初步认为沟3毒株为SEO型HV病毒。     

汉坦病毒沟3株PCR分型

汉坦病毒 (HV)沟 3株在以往报道的免疫学中和效价检测 ,为一株中和抗原广谱的毒株。本研究对这一毒株经过两次挑斑纯化 ,并经PCR方法进行分型检定 ,初步认为沟 3毒株为SEO型HV病毒。