乳糖诱导的重组人血管内皮抑素(rhEndostatin)蛋白的表达

研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组蛋白的表达,观察乳糖对乳糖操纵子调控的基因工程菌发酵及重组血管内皮抑素表达的影响,从而选取最佳诱导表达条件。以重组人血管内皮抑素表达工程菌pETrhEN/BL21(DE3)作为研究对象,分别用IPTG和乳糖作为诱导剂,在摇瓶中进行表达实验。并对重组蛋白质表达量进行分析。然后在5 L发酵罐中进行验证。在摇瓶培养条件下,乳糖浓度大于0.5 g/L即可以诱导目的蛋白的表达。乳糖浓度1 g/L时诱导目的蛋白表达量与1 mmol/L的IPTG相当,当乳糖浓度为10 g/L,目的蛋白表达量达到最大。在发酵罐培养条件下,补料4 h后葡萄糖浓度基本耗尽,此时开始加入乳糖。诱导后1 h,即有重组蛋白表达,在诱导后4 h达到高峰(占菌体可溶性蛋白的56%),与此同时,诱导后5 h菌体浓度也达到最高值。在以乳糖操纵子为调控手段的工程菌表达系统中,可以使用乳糖作为诱导剂,诱导应在葡萄糖消耗完后进行。     

HCMV pp65截短蛋白原核表达条件优化

为了提高HCMVpp65蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了不同发酵条件对其表达的影响,包括培养基、接种量、温度、摇床转速、pH、诱导时间以及诱导剂IPTG使用浓度等。结果表明,以LB培养基为发酵液,按5%接种量,37℃培养3h后IPTG诱导5h,重组菌菌体生物量为0.6g/L,目的蛋白表达量达18mg/L。用3.7L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达0.85g/L,最高目的蛋白表达量达到25mg/L。     

GABAA受体蛋白片段在大肠杆菌细胞表达条件研究*

为了提高GABAA受体a1蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了重组菌的发酵条件,包括培养基、接种量、温度、摇床转速、pH、诱导培养时间和诱导剂IPTG使用浓度等对GABAA受体蛋白片段表达的影响。结果表明重组菌以LB培养基为发酵基质,按3％接种量,37℃培养细胞3.5h后IPTG 32℃诱导5h,菌体生物量为3.25g/L,目标蛋白表达量达95mg/L。用16L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达4.95g/L,发酵周期5.5h,最高目标蛋白表达量达到136mg/L.     

GABAA受体蛋白片段在大肠杆菌细胞表达条件研究

为了提高GABAA受体α1蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了重组菌的发酵条件,包括培养基,接种量,温度,摇床转速,pH,诱导培养时间和诱导剂IPTG使用浓度等对GABAA受体蛋白片段表达的影响。结果表明重组菌以LB培养基为发酵基质,按3%接种量,37℃培养细胞3.5h后IPTG32℃诱导5h,菌体生物量为3.25g/L,目标蛋白表达量达95mg/L。用16L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达4.95g/L,发酵周期5.5h。最高目标蛋白表达量达到136mg/L。     

FGF20原核表达载体构建及在大肠杆菌中优化表达

[目的]构建人FGF20原核表达载体并在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中优化表达。[方法]从胃癌细胞中经RT-PCR扩增FGF20基因并构建p ET28b-FGF20载体,转化E.coli,IPTG诱导表达。对诱导OD值、IPTG浓度、诱导温度、时间及溶氧量进行优化,同时采用正交试验优化培养基配方,以SDS-PAGE及Western Blot检测蛋白表达,以确定最佳表达条件。[结果]构建了p ET28b-FGF20原核表达载体,实现了FGF20蛋白的表达,确定最佳表达条件为:培养基占锥形瓶容积20%,菌体生长至OD600=0.4,加入终浓度1.0 mmol/L的IPTG,37℃诱导6 h。培养基最佳成分为:蛋白胨11 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L、葡萄糖0 g/L。[结论]实现了FGF20在大肠杆菌中的优化表达,为其基因工程药物生产及药用研究奠定了基础。     

大肠杆菌yfiF基因原核表达系统构建、表达条件优化及蛋白纯化

[目的]构建大肠杆菌功能未知基因yfi F的原核表达系统,对诱导表达条件进行优化,并纯化表达的可溶性Yfi F融合蛋白。[方法]使用p ET16b表达质粒构建p ET16b-yfi F原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,对IPTG加入时机、终浓度及诱导时间进行优化,并使用镍柱纯化裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白。[结果]构建了p ET16b-yfi F重组质粒,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,最佳诱导条件为细菌生长至OD600值为1时加入IPTG,终浓度为0.1 mmol/L,诱导9 h。裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白纯化后浓度为209μg/ml。[结论]成功构建了yfi F的原核表达系统,优化了诱导表达条件,可溶性Yfi F融合蛋白得到纯化。     

棉铃虫乙醇脱氢酶原核可溶性表达条件的优化北大核心

[目的]提高棉铃虫乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)在大肠杆菌中可溶性蛋白的表达量。[方法]研究了诱导温度和诱导剂IPTG浓度对可溶性His-ADH融合蛋白表达量的影响。设置15℃、20℃、25℃、30℃、37℃五个不同温度和0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L五个不同的IPTG诱导剂浓度分别进行原核诱导表达。基于SDS-PAGE和灰度扫描来评价可溶性融合蛋白的表达水平。[结果]表达的目的融合蛋白相对分子质量约为53 k Da,与预测的分子量大小一致,Western Blot分析表明能与His单克隆抗体特异性结合;可溶性融合蛋白的最佳诱导条件为温度25℃、IPTG浓度0.6 mmol/L。[结论]表达优化最终条件为温度25℃(相对表达量为2.21)、IPTG浓度0.6 mmol/L(相对表达量为1.14)。低温有利于可溶性蛋白的形成,诱导剂IPTG浓度并不是越高越好。     

探索不同培养条件对大肠杆菌表达蛋白的影响

应用基因工程技术,在获得表达脱落酸受体蛋白PYL10的重组大肠杆菌菌株后,研究了表达时长、表达温度和诱导剂浓度对蛋白PYL10表达的影响。在22℃时加入200μmol/L IPTG时,设置变量诱导时间分别为0h、1h、2h、4h、8h、16h,结果发现诱导时长为16h时PYL10的表达量最高;其他条件相同时,探索诱导温度为4℃、15℃、22℃、37℃后发现在22℃下PYL10的表达量最高;同样,保持其他条件相同,改变IPTG浓度(0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L)发现,在加入200μmol/L IPTG时PYL10的表达量是最高的。     

藻红蛋白的高效异源生物合成及其生物活性

[目的]实现藻红蛋白在大肠杆菌中的高效生物合成。[方法]将藻红蛋白生物合成的多个基因构建到单一表达质粒上,质粒转化大肠杆菌后获得表达菌株,优化诱导物、诱导温度和诱导时长等发酵条件,利用亲和层析法分离纯化重组藻红蛋白,分析重组蛋白的光谱学性质与抗氧化活性。[结果]获得了高效生物合成藻红蛋白的大肠杆菌菌株,以乳糖为诱导物时最佳诱导条件为:2.0 g/L的乳糖、25℃下诱导28 h,藻红蛋白表达量达211.6 mg/L;以IPTG为诱导物时最佳诱导条件为:0.4 mmol/L的IPTG,在25℃条件下诱导28 h,藻红蛋白表达量达188.7 mg/L。藻红蛋白色基结合率达92.0%,OD555/OD280为8.0。[结论]成功实现了藻红蛋白在大肠杆菌中的高效生物合成,重组藻红蛋白具有羟基自由基的清除活性。     

棉铃虫乙醇脱氢酶原核可溶性表达条件的优化

[目的]提高棉铃虫乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)在大肠杆菌中可溶性蛋白的表达量。[方法]研究了诱导温度和诱导剂IPTG浓度对可溶性His-ADH融合蛋白表达量的影响。设置15℃、20℃、25℃、30℃、37℃五个不同温度和0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L五个不同的IPTG诱导剂浓度分别进行原核诱导表达。基于SDS-PAGE和灰度扫描来评价可溶性融合蛋白的表达水平。[结果]表达的目的融合蛋白相对分子质量约为53 k Da,与预测的分子量大小一致,Western Blot分析表明能与His单克隆抗体特异性结合;可溶性融合蛋白的最佳诱导条件为温度25℃、IPTG浓度0.6 mmol/L。[结论]表达优化最终条件为温度25℃(相对表达量为2.21)、IPTG浓度0.6 mmol/L(相对表达量为1.14)。低温有利于可溶性蛋白的形成,诱导剂IPTG浓度并不是越高越好。     

采用正交设计优化HPV16L1重组蛋白表达的实验研究

通过正交试验对构建的人乳头瘤病毒（HPV）16型L1蛋白的重组表达菌株pQE31—HPV16L1／M15（pREP4）进行表达条件的优化,以增加目的蛋白的表达量。实验选取影响蛋白表达的4个主要因素,分别为诱导时间、诱导剂浓度、细菌密度和诱导温度,采用四因素两水平正交试验,通过SDS-PAGE及Western blot测定重组表达蛋白,以Tanon凝胶成像系统分析目的蛋白含量作为检测条件优化效果的指标,所得数据采用SAS软件进行统计分析。实验结果表明在37℃、IPTG0．5mmol／L,菌密度OD600为1．0的条件下诱导4h所得蛋白量最大;经统计正交分析的最佳诱导条件为37℃、0．5mmol／LIPTG和菌密度OD600为1．0的条件下诱导7h。经实验验证,应用正交分析的最佳条件诱导所得目的蛋白量最大,但实际中通常采用诱导4h条件。实验证明正交试验可以用于基因工程菌株蛋白表达条件优化过程,提高工作效率。     

响应面-满意度函数优化重组大肠杆菌产NMN转移酶发酵条件

重组大肠杆菌Escherichaia coli能高效表达NMN转移酶,以此为出发菌株,以菌体生长量OD600和NMN转移酶的活力为响应值,对重组大肠杆菌产NMN转移酶的发酵条件进行优化.首先以Plackett-Burman实验设计优化筛选出3个主要影响因子:胰蛋白胨、甘油、MgSO4;随后以Box-Behnken中心组合设计建立上述3个因子对OD600和NMN转移酶活力水平的数学模型;最后通过满意度函数获得最佳发酵条件为:酵母粉30 g/L,胰蛋白胨10.5 g/L,甘油3.49 mL/L,MgSO40.45 g/L,K2 HPO440.5 g/L,KH2 PO46.0 g/L,NH4 Cl 1.5 g/L,NaCl 0.6 g/L,接种量1.5%,诱导时间12 h.在该优化条件下,菌体生长和产酶水平均获得了显著的提升.重组NMN转移酶的活力水平从8.85 U/mg提高到15.48 U/mg,菌体生长量OD600从4.85提高到6.01,提高幅度分别为74.92%和23.92%.     

乳糖诱导重组尿酸酶基因在大肠杆菌中的表达

对用乳糖替代异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组产朊假丝酵母尿酸酶基因在E.coli JM109(DE3)中表达进行了研究,拟建立一种高效低成本的生产重组尿酸酶的工艺路线。通过摇瓶试验对诱导所采用的乳糖浓度,诱导时机和诱导持续时间进行了优化,并考察在乳糖诱导下的目的产物表达动力学,随后在5 L发酵罐上进行扩大化培养以验证摇瓶优化的结果,进一步将乳糖作为诱导剂应用于高密度发酵过程。实验结果表明乳糖诱导的最佳浓度为5 g/L,最佳诱导时机是对数生长期中后期,诱导持续时间为9~10h;按照优化的条件在摇瓶和5 L发酵罐上进行分批培养,重组尿酸酶最大表达量可达菌体总蛋白的26%左右,可溶性蛋白的36%左右,略高于IPTG的诱导效果;高密度发酵过程菌体终密度达到OD600值40以上,尿酸酶表达量占菌体总蛋白25%左右。     

呼吸商监控毕赤酵母表达猪α干扰素活性水平的研究

在5L发酵罐下开展毕赤酵母流加培养表达pIFN-α研究。通过多批次研究,结果表明：诱导阶段,RQ稳定情况可以作为反映底物甲醇浓度水平是否合适以及pIFN-α活性高低的监控指标。当甲醇浓度在8～12g/L水平时,RQ在整个诱导阶段能稳定在0.4～0.5之间某个特定值上,同时pIFN-α最高活性都能维持在106IU/mL水平上;而当甲醇浓度在0～5g/L或15～20g/L范围内时,RQ很不稳定,分别在0.15～0.4和0.4～0.8区间上下振动,相应的pIFN-α最高活性也只在10^3IU/mL和10^4IU/mL水平上。     

人表皮生长因子融合蛋白的表达及纯化工艺的优化

探讨了在大肠杆菌中生产小分子泛素样修饰蛋白与人表皮生长因子（SUMO-hEGF）的最佳表达及纯化条件。将重组表达载体pET3c-SUMO-hEGF转化到大肠杆菌BL21(AI)中,以阿拉伯糖为诱导剂,对诱导表达参数进行优化,并进一步通过离子交换层析,Ni-NTA亲和层析及分子筛层析等进行纯化分析。结果表明： SUMO-hEGF在BL21(AI)中的最佳诱导表达温度为37℃,诱导剂阿拉伯糖的最佳浓度为5.0g/L,最佳诱导表达时间为4h,表达量约为20.2%,Western blot 分析证实,纯化后的蛋白是hEGF,为进一步开发hEGF基因工程药物奠定了基础。     

Production and secretion of recombinant Leuconostoc mesenteroides dextransucrase DsrS in Bacillus megaterium

Leuconostoc mesenteroides dextransucrase DsrS was recombinantly produced in Bacillus megaterium and exported into the growth medium. For this purpose a plasmid-based xylose-inducible gene expression system was optimized via introduction of a multiple cloning site and an encoded optimal B. megaterium ribosome binding site. A cre mediating glucose-dependent catabolite repression was removed. Recombinant DsrS was found in the cytoplasm and exported via its native leader sequence into the growth medium. Elimination of the extracellular protease NprM increased extracellular DsrS concentrations by a factor of 4 and stabilized the recombinant protein for up to 12 h. Cultivation in a semi-defined medium resulted in a further doubling of extracellular DsrS concentration up to an activity of 65 Units/L. To develop an industrial process a high cell density cultivation of B. megaterium was established yielding cell dry weights of up to 80 g/L. After induction of dsrS expression high specific (362 Units/g) and volumetric (28,600 Units/L) activities of dextran free DsrS were measured. However, using high cell density cultivation, most DsrS was found cell-associated indicating current limitations of the production process. A protease accessibility assay identified the major limitation of DsrS production at the level of protein folding. Intracellular misfolding of DsrS hampered DsrS export via the SEC pathway at high cell densities. The subsequent use of a semi-defined mineral medium and the induction of DsrS production at lower cell densities increased protein export efficiency remarkably, but also led to extracellular DsrS aggregation. Further optimization strategies for the production of recombinant DsrS in B. megaterium are discussed.     

argE基因在大肠杆菌中的表达优化

N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶可在重组菌BL21（DE3）-pET22b-argE中表达。首先确定了该酶的细胞表达定位,再研究了诱导温度、诱导剂种类及浓度、诱导起始菌体密度、诱导时间等因素对重组菌生长及目的蛋白表达活性的影响。结果表明,IPTG和乳糖皆可诱导目的蛋白表达,乳糖的诱导效果优于IPTG。在诱导起始0D600为0．46时加入15g／L乳糖,20℃诱导18h最适于目的蛋白的活性表达。表达条件优化后,酶活从1．68U／mL提高至282．99U／mL,约为原来的168倍。     

腈水解酶psn基因工程菌的发酵及产酶条件优化

来自恶臭假单胞菌的腈水解酶具有高效催化3-氰基吡啶产烟酸的能力,对表达该酶的基因psn进行发酵和产酶条件优化,通过对C源、N源、磷酸盐、金属离子、温度、诱导剂浓度和诱导时间进行单因素考察,获得最适培养基条件(g/L):葡萄糖5、蛋白胨15、酵母粉5、(NH4)2SO45、K2HPO424.5、KH2PO45.76、MgSO40.48;最佳诱导条件:培养2.5 h后添加IPTG诱导,浓度0.2 mmol/L,诱导温度30℃。在该条件下培养,重组大肠杆菌的腈水解酶比酶活可达到45.67 U/mL,比优化前提高了2.26倍。在此基础上,于5 L发酵罐上进行C、N源的补料研究,获得最适分批补料策略,发现其腈水解酶活力可达到75.40 U/mL,是优化前的3.74倍。     

A型产气荚膜梭菌α毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌标准株染色体DNA中扩增出α毒素基因,构建了含α毒素基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的表达质粒pXETA02含有α毒素基因序列。经SDS-PAGE、Western blot分析和ELISA检测,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别。表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时α毒素蛋白表达量为34.83%。以乳糖为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH7.5、培养温度37℃,乳糖浓度0.1g/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入乳糖,诱导时间5h,α毒素蛋白表达量为23.82%。动物实验结果表明,用重组菌株α毒素蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。