毕赤氏酵母P_(AOX2)突变体序列分析

近年来巴斯德毕赤氏酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）已被广泛用于商业化生产外源蛋白的基因工程菌［１］。与常用的酿酒酵母表达系统相比,该系统具有以下优点：１有强有力的、受甲醇严格诱导调控的启动子;２表达蛋白高分泌;３表达菌株稳定;４适合于高密度培养。但目前使用的系统也有其不足之处,当利用该系统的载体将外源基因通过双交换整合到染色体中ＡＯＸ１基因位置时,ＡＯＸ１基因被破坏［２］。已知醇氧化酶是细胞利用甲醇的关键酶,该酶分别由ＡＯＸ１基因和ＡＯＸ２基因编码合成［３］。虽然ＡＯＸ２与ＡＯＸ１的…     

P.pastoris高效表达外源蛋白的研究进展

Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统具有原核细胞和哺乳类细胞表达系统的特点,已广泛地应用于表达外源基因。为获得高质量外源蛋白的表达而进行了大量研究并取得了许多进展,如构建并筛选多拷贝的由ＡＯＸ启动的表达盒,优化培液组分,减少蛋白降解,分泌蛋白的纯化和Ｎ－连接寡糖链的特点。     

铜和其他重金属离子诱导大肠杆菌抗铜启动子的研究

通过测定荧光酶活性研究了大肠杆菌抗铜基因上的两个铜诱导的启动子。结果表明,在缺少抗铜质粒ｐＢＩＮ１９ｐｃｏ的情况下,启动子ＰｐｃｏＡｂｏｘ－ｌｕｘ和ＰｐｃｏＡｌｏｎｇ－ｌｕｘ的最大诱导均出现在５ｍｍｏｌ／ＬＣｕＳＯ４,而且ＰｐｃｏＡｂｏｘ是一个比即ＰｐｃｏＡｌｏｎｇ强的启动子;铜对两个ＰｐｃｏＥ－ｌｕｘ构建的诱导的生物荧光曲线中,有两个峰,第一个峰出现在０．５ｍｍｏｌ／ＬＣｕＳＯ４时,第二个峰亦即最大诱导出现在约５ｍｍｏｌ／ＬＣｕＳＯ４时,并且ＰｐｃｏＥｌｏｎｇ的活性比ＰｐｃｏＥｂｏｘ高。结果还表明,启动子ＰｐｃｏＥ比ＰｐｃｏＡ活性高得多;此外,由于两个Ｐｐｃｏｓｈｏｒｔ－ｌｕｘ构建均不显示任何荧光酶活性,说明Ｃｏｐｐｅｒｂｏｘ对于抗铜基因来说是非常重要甚至是必需的。在质粒ｐＢＩＮ１９ｐｃｏ存在的情况下,所有启动子的最大诱导均出现在６ｍｍｏｌ／ＬＣｕＳＯ４时,而且比无该质粒时的相应最大诱导值高得多。以其他重金属离子进行诱导实验结果表明,锌和镍可以作为诱导物且锌的效果较好,镉和银则不能诱导抗铜系统。     

人肝金属硫蛋白突变体β基因通过同源重组在蓝藻中的克隆与表达

将人肝金属硫蛋白（ＭＴ）突变体β基因插入到中间载体ｐＲＬ－４３９上的强启动子ＰｐｓｂＡ 下游,利用载体ｐＲＬ－β上的ＰｐｓｂＡ 和β基因与ｐｈａｓｍ ｉｄ ｐＴＺ１８－８上整合平台ＰｓｂＢ,构建整合表达载体ｐＴＺ－β．整合平台ＰｓｂＢ与集胞藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ．ＰＣＣ６８０３）染色体ＤＮＡ 上ｐｓｂＢ基因下游片段为同源序列．为了发生单交换同源重组,将外源基因β插入到整合平台ＰｓｂＢ下游的克隆位点．利用自然转化方法将表达载体ｐＴＺ－β整合到Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｔｓｐ．ＰＣＣ６８０３的染色体上．经氨苄青霉素筛选得到遗传性状稳定的转基因蓝藻．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 证明β基因已整合到Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３的染色体上;Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 表明β基因已在蓝藻中表达．ＥＬＩＳＡ 测定在Ｚｎ２＋ 浓度为１５０ μｍ ｌ／Ｌ时表达量最高,为５９０ μｇ／ｇ 鲜藻;原子吸收表明转β基因的藻对Ｚｎ２＋ 的富集能力约为野生型的２倍．     

巴斯德毕赤酵母表达体系研究及进展

毕赤酵母表达体系是近十年发展起来的真核表达体系。作为一种成功的表达体系,有好几种因素促进了它的快速推广。主要包括如下几方面：　　　　毕赤酵母醇氧化酶（Ａｌｃｏｈｏｌ　ｏｘｉｄａｓｅ,ＡＯＸｌ）基因的强启动子特别适合于外源基因的调控表达;毕赤酵母基因操作技术和酿酒酵母Ｓｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ非常相似,后者是现代分子生物学中研究得透彻和应用很广的酵母表达体系;毕赤酵母对需氧生长有强的偏好,这一生理学特性使得它既能高密度发酵生长,亦有利于工业放大生产;毕赤酵母自身分泌到培养基中的…     

P.pastoris高效表达外源蛋白的研究进展

Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统具有原核细胞和哺乳类细胞表达系统特点,已广地应用于表达外源基因。为获得高质量外泊蛋白的表达而进行了大量研究并取得了许多进展,如构建并筛选多拷贝的由ＡＯＸ启动的表达盒,优化培液组分,减少蛋白降低,分泌蛋白的纯化和Ｎ－连接寡糖链的特点。     

GRO家族:与细胞生长相关的趋化因子

ＲＯ(ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｌａｔｅｄｏｎｃｏｇｅｎｅ)家族是一类属于ＣＸＣ族的趋化因子 ,包括ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ ,系统命名为ＣＸＣＬ1、ＣＸＣＬ2、ＣＸＣＬ3。1 987年分离并测序了ＧＲＯｃＤＮＡ ,并推测其表达与细胞生长相关 ,类似于ｃ ｆｏｓ原癌基因 ,因此而得名为ＧＲＯ。因ＧＲＯ可如丝裂原样刺激黑色素瘤细胞生长 ,曾被称为ＭＧＳＡ(ｍｅｌａｎｏｍａｇｒｏｗｔｈｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙ)。小鼠的相对应基因为ＫＣ ,发现于ＣＯＳ细胞 ,是ＰＤＧＦ(ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔ…     

毕赤氏酵母醇氧化酶-2基因启动子突变体的分离和鉴定

巴斯毕赤我苯酵母表达系统已被广泛用于生产外源蛋白的寄主菌。利用该系统将外源基因整合交换到染色体上时,ＡＯＸ１基因被破力的甲醇利用缓慢,给发本报生产千古 定影响。在不改变现有表达系统前提下,从ＡＯＸＩ功能缺陷 株分离出Ｍｕｔ＾＋自发突变化突变体,通过突变体在甲醇培养基中生长曲线的测定,ＨＳＡ表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,证明突变体的甲醇利用能力和蛋白表达比原始菌株大大提高,突变体ＡＯＸ２基因上游     

人血小板生成素全长分子在酵母系统中的分泌表达及活性分析

外源基因可通过整合型载体被整合到毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）染色体上,获得遗传性稳定分泌表达株．利用酵母信号肽ＭＦα,对该信号肽蛋白酶识别位点的相关序列进行重新设计,使天然人ＴＰＯ成熟肽在毕赤酵母系统中分泌表达成功．表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ进行分析,分子量约为６６ｋＤ处蛋白条带可被ＴＰＯ抗体识别;表达量约为０．１ｇ／Ｌ;Ｎ端氨基酸序列分析结果与设计的一致;表达产物对小鼠骨髓细胞形成巨核细胞集落形成单位（ｍｅｇａｋａｒｙ－ｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ,ＣＦＵ－Ｍｅｇ）具有明显的刺激作用．     

小鼠金属硫蛋白──I cDNA在蓝藻中的克隆和表达

生物工程技术在工业、农业和环境保护上的应用日益广泛,将工程微生物应用于环境污染的治理,是一条快速、安全又经济的途径。本文报道了获得一种清除重金属污染工程藻的研究。将小鼠金属硫蛋白－Ｉ（ｍｏｕｓｅｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ－Ｉ,ｍＭＴ－Ｉ）ｃＤＮＡ基因片段插入到质粒ｐＲＬ４３９上的强启动子ＰｐｓｂＡ之后,并与穿梭载体ｐＤＣ－８相连构建成功大肠杆菌──蓝藻穿梭表达载体ｐＤＣ－ＭＴ,然后通过三亲结合转移法将ｐＤＣ－ＭＴ转入固氮丝状体蓝藻鱼腥藻（Ａｎａｂａｅｎａ）７１２０中,经新霉素筛选获遗传稳定的转外源ＤＮＡ藻株;纯化单藻落扩大培养后,提取蓝藻质粒,斑点杂交确定ｍＭＴ－ＩｃＤＮＡ的转人;在培养基中加入重金属Ｃｄ,培养后收集藻细胞,用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ,极谱法和原子吸收等多种方法确定金属硫蛋白的表达,并计算表达量约为４０μｇＭＴ／ｇ藻鲜重。