t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达

应用ＰＣＲ方法,在ｔ－ＰＡ ｃＤＮＡ５＇端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体ｐＰＩＣ９重组,构建表达质粒ｐＳＴＥ－Ｙ,利用ＬｉＣｌ转化法转化酵母菌ＹＳ１０８,在ＭＭ和ＭＤ平板上筛选表型,ＰＣＲ筛选ｔ－ＰＡ ｃＤＮＡ与酵母染色体整合而形成的阳性克隆,阳性克隆经甲醇诱导表达后,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证明表达产物的分子量为６ｋＤａ左右,用酪蛋白板溶圈法测定ｔ－ＰＡ的活性。Ｍｕｔ＾ｓ表型菌表     

P.pastoris高效表达外源蛋白的研究进展

Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统具有原核细胞和哺乳类细胞表达系统的特点,已广泛地应用于表达外源基因。为获得高质量外源蛋白的表达而进行了大量研究并取得了许多进展,如构建并筛选多拷贝的由ＡＯＸ启动的表达盒,优化培液组分,减少蛋白降解,分泌蛋白的纯化和Ｎ－连接寡糖链的特点。     

t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达

应用ＰＣＲ方法,在ｔＰＡｃＤＮＡ５′端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体ｐＰＩＣ９重组,构建表达质粒ｐＳＴＥＹ,利用ＬｉＣｌ转化法转化酵母菌ＹＳ１０８,在ＭＭ和ＭＤ平板上筛选表型,ＰＣＲ筛选ｔＰＡｃＤＮＡ与酵母染色体整合而形成的阳性克隆,阳性克隆经甲醇诱导表达后,用ＳＤＳＰＡＧＥ证明表达产物的分子量为６ｋＤａ左右,用酪蛋白板溶圈法测定ｔＰＡ的活性。Ｍｕｔｓ表型菌表达产物活性最高为２５００ＩＵ／ｍｌ,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实表达产物具有天然ｔＰＡ分子的免疫原性。     

P.pastoris高效表达外源蛋白的研究进展

Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统具有原核细胞和哺乳类细胞表达系统特点,已广地应用于表达外源基因。为获得高质量外泊蛋白的表达而进行了大量研究并取得了许多进展,如构建并筛选多拷贝的由ＡＯＸ启动的表达盒,优化培液组分,减少蛋白降低,分泌蛋白的纯化和Ｎ－连接寡糖链的特点。