CRISPR/Cas核糖核蛋白介导的植物基因组编辑

CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)系统作为一种重要的基因编辑工具,自诞生以来被广泛应用于作物的性状改良。与CRISPR/Cas DNA载体介导的植物基因组编辑相比,CRISPR/Cas核糖核蛋白(CRISPR/Cas ribonucleoprotein, CRISPR/Cas RNP)介导的植物基因组编辑具有作用迅速、脱靶率低和无外源DNA插入(DNA-free)等优点,因而无需清除CRISPR编辑工具而更容易获得纯合的编辑体。但是,由于植物细胞转化方法和细胞再生技术的限制,不借助筛选标记的辅助将CRISPR/CasRNP直接导入植物细胞并获得高效基因编辑仍比较困难,直接限制了CRISPR/CasRNP在植物基因组编辑中的广泛应用。本文系统介绍了CRISPR/Cas RNP基因组编辑技术的分子作用机理及其优势,并总结了CRISPR/Cas RNP导入植物细胞的方法,最后对CRISPR/Cas RNP在植物基因组编辑中的新应用和新思路进行了展望,以期为进一步改进CRISPR/Cas RNP基因组编辑技术和扩大其在作物改良中的应用提供参考。     

CRISPR/Cas系统在植物基因组编辑中的应用

在基因组水平上进行植物基因人工改造对农作物的改良具有重要意义。一直以来,科学家都未发现有效的植物基因组编辑的方法。最近发现的CRISPR/Cas系统因其简易和有效性被广泛应用于包括植物在内的多种生物的基因组编辑中。CRISPR/Cas系统仅需要短RNA和核酸酶就可以对特定的靶标基因进行突变。目前CRISPR/Cas系统已成功在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana benthamiana)、甜橙(Citrus sinensis)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)以及苔藓植物地钱(Marchantia polymorpha)等植物中实现了定点基因组编辑。综述将对CRISPR/Cas系统在植物中的最新研究进行全面的总结和讨论。     

CRISPR/Cas植物基因组编辑技术及其在玉米中的应用*

CRISPR/Cas 系统具有操作简单、效率高等优势,为植物功能基因研究和作物遗传改良提供了重要支撑。介绍了CRISPR/Cas植物基因组编辑技术的研究进展,并对CRISPR/Cas系统及其衍生技术进行了详细比较;结合案例综述了CRISPR/Cas9基因编辑技术在玉米产量、品质、抗逆性改良,以及雄性不育系创制和单倍体诱导等方面的应用;同时针对CRISPR/Cas系统未来需要迫切解决的一些问题进行了分析和展望。     

植物CRISPR/Cas9多基因编辑载体构建和突变分析的操作方法

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是植物基因功能研究与作物改良的有效工具.为此,本实验室开发了高效的CRISPR/Cas9植物多基因编辑载体系统.本载体系统包括6个双元载体和12个含有不同U3/U6启动子的sg RNA中间载体,可满足对单子叶和双子叶植物的遗传转化以及不同抗生素筛选的要求,具有简便、高效,可同时对多基因进行编辑的特点.此外,为了能更高效地应用基因组编辑技术,还开发了一站式在线分析工具包CRISPR-GE.为方便研究人员利用CRISPR/Cas9系统进行植物基因组编辑,本文提供了从靶点选择、CRISPR/Cas9多靶点双元载体构建,以及对靶点突变序列的测序分析等详细的操作方法,以及常见的问题解答.     

CRISPR/Cas9:基因编辑的新时代

基因编辑技术是通过核酸内切酶对基因组DNA进行定向改造的技术,可以实现对特定DNA碱基的缺失、替换等,常用的四种基因编辑工具分别是:巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶以及CRISPR/Cas9系统。其中CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因组编辑技术具有组成简单、特异性好、切割效率高的优点。该文对CRISPR/Cas9系统的结构组成和功能机制,动植物基因靶向编辑和人类在遗传性疾病、病毒感染性疾病以及肿瘤方面进行综述,旨在对CRISPR/Cas9系统的现状和发展进行总结和展望。     

CRISPR/Cas9技术在表观基因组中应用的探讨

成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins,CRISPR/Cas9)技术是近5年来在生物基因改造中应用最广泛的新型编辑工具,具有成本低、效率高、多位点打靶以及脱靶效应可预测等优点,正在成为不同生物体中设计基因组的有力工具。表观遗传的不断发展对分子生物学的中心法则提出挑战,包括DNA中碱基和组蛋白的修饰、非编码RNA对基因组和染色质结构的调节中都起到至关重要的作用。对CRISPR/Cas9系统的改造可以对表观基因组进行修饰。对CRISPR/Cas9系统在表观基因组中进行修饰的应用进行概述,讨论了定向修饰基因组存在的问题,以期为CRISPR/Cas9系统在基因组编辑领域的应用提供参考。     

基因编辑技术研究进展及其在苜蓿等豆科饲草作物中的应用

基因编辑是对生物基因组进行靶向修饰的一项新型生物技术,可以在不同物种中实现对目标基因的定点敲除、基因片段置换以及基因定点插入等基因定向编辑,目前基因编辑技术已在植物基因功能解析和作物遗传改良研究中得到广泛应用。本文简要回顾基因编辑技术的发展历程,重点介绍新近发展的CRISPR/Cas9技术在植物中的研究进展,并对CRISPR/Cas基因编辑技术在苜蓿等饲草作物中的应用进行探讨和展望。     

基于CRISPR/Cas9的激活系统研究进展

基因编辑技术自问世以来就一直作为生物技术领域的研究热点。基因编辑工具成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关系统(CRISPR/Cas系统)具有特异性、简便性和灵活性等优点,为研究人员提供了丰富的遗传操作工具,也让CRISPR/Cas系统的应用在多种生物中得到了飞速发展。特别是将转录激活因子与失活的Cas蛋白结合,可在RNA转录水平实现基因表达特异性调控,为生物技术在医学研究及农业领域的发展做出了重要的贡献。外源基因的过表达是验证基因功能和基因调控的常用方法,然而由于载体容量的限制难以实现多基因过表达。基于CRISPR/Cas9激活系统可在不同向导RNA的引导下对多个基因进行调控,实现调控水平验证基因功能。本文通过对CRISPR/Cas9激活系统组成及不同激活策略进行总结,整理针对过度激活的解决方案,为CRISPR/Cas9激活系统应用于棉花遗传改良及除草剂抗性研究提供更多参考。     

CRISPR/Cas9系统中引导RNA的研究进展

CRISPR/Cas9系统作为重要的一种基因编辑工具,自产生以来广泛应用于各种生物体基因组序列的精确编辑,可在特定位点产生核苷酸的删除、插入或替换,从而改变编码基因的功能。以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术将应用于包括生物育种在内的各项生物技术领域,产生新一代生物技术产品。目前关于CRISPR/Cas9的研究报道多集中于Cas9蛋白的结构功能,以及CRISPR/Cas9系统的工作原理。引导RNA(Guide RNA)作为CRISPR/Cas9系统的重要组分之一,也是基因编辑技术领域的研究热点,近来有多篇文章报道通过改良引导RNA从而提高CRISPR/Cas9的编辑效率和精确性。对CRISPR/Cas9系统中的引导RNA研究进展进行了综述,围绕引导RNA的序列组成、结构特征以及转录产生方式这3方面内容,有助于全面了解CRISPR/Cas9系统的结构特征,讨论了引导RNA对CRISPR/Cas9基因编辑效率的影响,有利于CRISPR/Cas9系统的使用。最后,展望引导RNA今后的研究发展趋势,旨在解决CRISPR/Cas9目前存在的相关问题,优化出效率更高、精度更高的基因编辑技术。     

植物CRISPR基因组编辑技术的新进展

在过去的4年中,CRISPR/Cas9基因组编辑技术成为生命科学领域的革命性工具,为植物学基础研究和农作物遗传改良提供了高效、快速而又廉价的遗传操作工具。利用CRISPR/Cas9系统可以实现精准的knock-out和knock-in等遗传操作,也可用于靶向激活或抑制基因的表达。在CRISPR/Cas9被广泛地用于基因组编辑的同时,它的编辑能力、效率和精确度也在不断地改进和完善,特别是CRISPR/Cpf1系统的发掘和单碱基编辑技术的创建,使CRISPR系统正逐步成为一个理想的遗传工程技术平台。此外,利用CRISPR/Cas9技术改良的农作物品种也已经涌现,这必将推动精准基因组编辑技术在农作物遗传改良中的应用和发展。     

碱基编辑技术的发展与应用

碱基编辑技术,以CRISPR/Cas系统为平台,引导胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶至特定的基因组靶点,产生靶向性的C至T或者A至G的碱基转换。自碱基编辑技术问世以来,全球多个科研团队通过优化改进得到了一系列高精准性、广靶向性、小编辑框、普适性的碱基编辑器。在应用方面,碱基编辑器能够在人体细胞、动植物细胞以及胚胎中进行高效的碱基转换,在治疗人类遗传病、构建动物疾病模型、植物育种等方面具有巨大的应用潜能。本文就碱基编辑技术的发展、优化和应用等方面进行综述和展望。     

“人造精子”介导基因编辑技术的建立与应用

"人造精子",即小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞,是一种可在体外长期培养扩增和进行遗传操作的细胞,因其具备胚胎干细胞自我更新和多向分化的特性,并拥有代替精子使卵母细胞"受精",产生半克隆小鼠的能力,而被广泛应用于生命科学研究的各个领域。与CRISPR-Cas9技术相结合,"人造精子"能够同时实现细胞水平和动物水平的复杂基因编辑,因此可作为一个有力的研究工具。本文就"人造精子"技术的建立与改进、在基因编辑方面的应用,以及全基因组标签计划的提出与进展展开综述。     

一种强力霉素诱导型白念珠菌基因敲除与筛选标记再循环工具包（英文）

【目的】在白念珠菌中建立一个快捷方便经济的基因敲除与筛选标记再循环的DNA操作系统。【方法】通过ExoIII介导的不依赖于连接酶的克隆策略,在异源筛选标记基因CmLEU2、CdHIS1和CdARG4基因的两侧分别插入了loxP位点,成为筛选标记基因盒扩增的模板。全基因合成了经过白念珠菌密码子优化的rTetR元件,并组装成Tet-on启动子。将密码子优化的重组酶Cre基因置于该启动子控制下。然后将他们插入筛选标记基因CdHIS1和CdARG4的CDS区域,形成筛选标记基因再循环载体。【结果】构建了3个用于白念珠菌基因敲除的侧翼含有loxP位点的筛选标记基因载体,以及2个含有Tet-on启动子控制的Cre酶的载体用于筛选标记基因的再循环。【结论】成功构建了一个白念珠菌中可诱导的基因敲除和筛选标记再循环的载体系统并成功应用于多个基因缺失株构建。这个系统有助于快速构建白念珠菌的单基因和多基因敲除菌株。     

斑马鱼胚胎背腹轴建立的分子机制

脊椎动物胚胎发育起始于体轴的建立,是胚胎早期发育过程中最重要的事件之一。Wnt、BMP、Nodal和FGF等多个信号通路协同调控细胞分化和细胞运动,促进胚胎胚层的形成和空间上的分离,调控胚胎背腹轴、前后轴和左右轴线的分化,为胚胎进一步发育勾勒出蓝图。本文主要综述斑马鱼胚胎背腹轴建立的分子机制,包括背部组织中心简介;母源Wnt/β-catenin信号调控背部组织中心形成的分子机制;BMP信号调控背腹轴建立的分子机制。     

红颈常室茧蜂蛹发育的形态特征

红颈常室茧蜂Peristenus spretus Chen et van Achterberg是一种绿盲蝽若虫的优势内寄生蜂,本研究利用超景深三维显微系统、显微镜观察了红颈常室茧蜂老熟幼虫发育特征、蛹形态特征及蛹发育后期卵巢的超微结构。结果表明:红颈常室茧蜂蛹期为12～15 d,其中雌蛹期比雄蛹期长2～3 d。根据其形态特征,可将蛹划分为预蛹期、第一蛹阶段、第二蛹阶段、第三蛹阶段。蛹期发育前9 d,蛹期组织结构开始分化形成,成蜂的外部形态基本显现,但性别难以区分;蛹期发育至10～14 d,可通过幼蜂体表颜色的变化或腹部末端的形状区分性别,在相同的适宜温度条件下,雌蜂比雄蜂颜色深,雌蜂腹部末端比较尖,有突出的产卵瓣,雄峰腹部末端钝圆,无凸起;雌蜂卵巢在化蛹后的第11天开始形成,卵巢初期的形状如细丝,此时卵巢管已开始初步分化,但卵室尚未分化;蛹发育至第12天时,卵巢管逐渐加粗,卵室开始分化;第13天时,卵巢管、卵室数量逐渐增多;第14天卵巢基部开始有少量成熟卵子产生,呈乳白色。10～12 d,雄蜂腹部末端绒毛逐渐增多,体壁变硬,逐渐角质化,虫体可活动,雄蜂胸部略带黑色,翅逐渐伸展开,整个虫体呈浅红棕色。本研究结果明确了红颈常室茧蜂蛹发育的形态变化过程,提出了蛹期雌雄区分的方法,叙述了蛹后期卵巢发育特征,为研究该蜂繁殖机理奠定了形态学基础。     

极端高温和持续中等高温对小菜蛾耐热性的影响

气候变化频率的增加和持续时间的延长,导致具有较短生活史的大部分农业害虫的某一个或某几个生命阶段都可经历热浪的胁迫。热浪对小型昆虫的生态学效应取决于不同生命阶段的耐热性,因而解析特定龄期下昆虫生命阶段的耐热性对理解气候变暖热浪频发的生态学影响具有重要意义。本研究以世界重要蔬菜害虫小菜蛾为研究对象,试验了小菜蛾4龄幼虫、成虫的基底耐热性和诱导耐热性,以及1龄幼虫和3龄幼虫置于不同高温[(31±1)、33±1)、35±1)℃]和暴露时间(3、6、9、12d)组合的持续中等高温耐热性。试验发现幼虫和成虫具有不同的基底和诱导耐热性,具有较弱基底耐热性的幼虫反而具有更强的诱导耐热性。不同生命阶段在持续数天的中等高温胁迫下具有不同的存活表现,早期生命阶段存活率较后期阶段的低,而且这种差异在较强高温下表现得尤为明显。昆虫不同阶段耐热性的差异,对种群的维持具有重要的生态学意义。大多数农业害虫田间种群具有混合年龄结构,热浪后耐热的发育阶段的存活,保证种群可以一直生存和繁衍下去。     

转录因子ZnF-706在鳞翅目昆虫中的进化格局及在家蚕中的功能

【目的】探讨家蚕Bombyx mori的潜在驯化基因——转录因子ZnF-706在鳞翅目(Lepidoptera)昆虫进化过程及家蚕驯化过程中的分子进化格局;并基于CRISPR/Cas9家蚕基因组编辑平台,探讨ZnF-706基因在家蚕中的功能。【方法】首先分析了家蚕ZnF-706序列特征,并利用已发表芯片数据调研该基因在家蚕幼虫组织中的表达格局;利用Phylogenetic Analysis byMaximum Likelihood (PAML)分支检验方法,分析该基因在鳞翅目不同类群中的分子进化格局。基于已发表的家蚕-野桑蚕Bombyx mandarina群体基因组多态性数据,对ZnF-706进行基因区域人工选择信号分析;对ZnF-706基因上游2 kb的调控区域进行单核苷酸多态性位点频率检测,发掘在家蚕群体中固定下来的突变位点;针对突变位点所在区域进行转录因子结合活性预测。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除ZnF-706基因,获得纯和突变体;以野生型家蚕为对照,检测突变体的茧重及蛹重变化。【结果】家蚕ZnF-706的编码蛋白具有典型的锌指蛋白结构域。ZnF-706在家蚕5龄第3天幼虫各组织中广泛表达,尤其表皮、脂肪体和生殖腺中有很高的表达量;该基因在鳞翅目、蚕蛾总科(Bombycoidea)及天蚕Antherea yamamai 3个分支中均呈现快速进化信号,在家蚕中有强烈的人工选择信号。该基因所在基因组区域的家蚕-野桑蚕种群分歧度参数Fst明显升高,家蚕群体中的群体多样性π明显降低,表明它位于一个选择扫荡区域内;该基因在家蚕-野桑蚕中的9个SNP位点存在于上游调控区,并位于转录因子结合活性区域内。该基因的纯合家蚕突变体ΔZn F-706生存力减弱,并且茧重以及蛹重与野生型家蚕相比都显著降低。但与黑腹果蝇Drosophila melanogaster中不同的是,家蚕中该基因的突变并不致死。【结论】ZnF-706可能在鳞翅目尤其是泌丝昆虫中进化,并在家蚕驯化过程中受到选择压力,提示其对于特征性状茧丝的变异可能发挥作用。该基因可能通过对丝蛋白基因的直接调控,或通过影响家蚕的生长发育而间接地影响茧丝性状。本研究不仅为探究家养动物人工选择机制提供了来自昆虫类材料的独有证据,也为后续深入开展家蚕重要经济性状的转录调控研究提供线索。     

莲草直胸跳甲胰岛素样生长因子系统相关基因IGFALS和IMP3的表达模式

莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila是恶性入侵杂草空心莲子草Alternanthera philoxeroides的专食性天敌。为阐明该跳甲生殖调控的分子机制,筛选其卵巢转录组数据得到3个胰岛素样生长因子系统相关基因,分别为胰岛素样生长因子酸不稳定亚基(IGFALS)和其亚型X1 (IGFALS X1)以及胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白3 (IMP3),利用半定量PCR方法检测3个基因在雌成虫不同发育时期的表达模式,并通过荧光定量PCR技术检测其在不同组织及不同发育时期的表达水平。结果显示,筛选到的IGFALS、IGFALS X1和IMP3基因在莲草直胸跳甲蛹期和成虫期均有表达,且3个基因在蛹期和成虫期均为全身性表达,IGFALS和IMP3 mRNA在成虫卵巢组织中表达量显著高于其他组织,峰值分别出现在成虫羽化后第5天和第1天,较蛹期第1天分别增加了3.56和3.81倍,因此推测IGFALS和IMP3基因在莲草直胸跳甲卵子发生过程中发挥重要的调控作用。     

昆虫嗅觉相关可溶性蛋白的研究进展

昆虫在长期进化过程中形成了一套高度敏感的嗅觉系统,通过该系统昆虫可以完成寻觅配偶、定位寄主及选择产卵位点等多种行为。在昆虫嗅觉系统中的可溶性蛋白主要有气味结合蛋白(odorant-binding protein, OBP)和化学感受蛋白(chemosensory protein, CSP)。OBP可以特异性结合并运输疏水性的气味分子相应的受体,是昆虫化学识别过程的第一步,具有十分重要的作用。CSP与OBP的结构和功能类似,主要参与化合物的识别和运输,尽管没有直接的证据表明CSP也参与了昆虫的化学感受过程,但已有研究发现,CSP在昆虫嗅觉系统中发挥着重要的作用。本文主要从分子特性、蛋白结构、表达模式、生理功能等方面分别对昆虫的OBP和CSP进行了概述,为深入的研究两者的功能提供理论参考,进而为以昆虫嗅觉系统为靶标的害虫防治提供新的思路。     

伞形霉属3个种的脂肪酸组成初探

伞形霉属是重要的产油真菌,本研究分析了具棱伞形霉(Umbelopsis angularis)、长白伞形霉(U.changbaiensis)和葡酒色伞形霉(U. vinacea) 36个菌株的脂肪酸组成。研究结果共检测到26种脂肪酸,链长12～20碳。特征性脂肪酸为18∶3 cis 6,12,14(十八碳三烯酸)、18∶2 cis 9,12/18∶0a(亚油酸/硬脂酸)、18∶1(w 8)/18∶1 cis 9 (w 9)(顺-10-油酸/油酸)和16∶0(十六烷酸) 4种,累计百分比为92.92%。脂肪酸/菌体生物量比值范围为0.40%～2.18%。结果表明具棱伞形霉、长白伞形霉和葡酒色伞形霉富含长链不饱和脂肪酸和重要功能性脂肪酸,具有潜在的开发价值。