麻疯树佛波酯对菜青虫体内几种酶活力的影响

麻疯树佛波酯是麻疯树中最主要的毒性成分。文章研究了取食麻疯树佛波酯后,三龄菜青虫体内的超氧化物歧化酶(SOD)、中肠蛋白酶、Ca2+-ATP酶以及蛋白激酶C(PKC)活力的变化,旨在探讨麻疯树佛波酯对菜青虫的杀虫作用机理。结果表明:取食低浓度的佛波酯刺激菜青虫体内SOD活力增加,而超过16μg·mL-1的处理浓度则会使SOD活力显著下降。麻疯树佛波酯对试虫中肠蛋白酶活力有较强的抑制作用,8μg·mL-1的处理浓度下其比活力显著低于对照组(t测验,P<0.05),随着佛波酯浓度增加,其抑制作用也增大。此外,佛波酯对菜青虫神经细胞膜上Ca2+-ATPase的活性也具有明显的抑制作用。在一定的浓度范围内,菜青虫中肠细胞PKC活力随佛波酯处理浓度升高而升高,64μg·mL-1时PKC比活力最高,达到对照的2.35倍;同时胞膜PKC/胞浆PKC比值升高,伴随着明显的质膜转位。取食麻疯树佛波酯后3h,试虫中肠细胞PKC活力即显著高于对照(t测验,P<0.05),在12h活力达到最大值,为对照组的4.4倍。由于麻疯树佛波酯结构与PKC的激活物二酰基甘油(DAG)类似,因此能显著激活试虫体内的PKC,PKC可能是麻疯树佛波酯发挥杀虫作用的重要靶标。     

KCα抑制生肌素转位及nAChR基因表达

烟碱样乙酰胆碱受体(nAChR)的表达调控受神经电活动影响,电刺激引起肌细胞膜去极化可抑制nAChR的表达.以往的研究表明,Ca2+和PKC以及生肌素在其中发挥着重要的作用.然而,目前尚不清楚究竟是哪种PKC亚型参与此过程,PKC激活对特异转录因子生肌素浆核转位有何影响?为探讨PKC在去极化-nAChR转录偶联中的作用,构建了含nAChRγ亚基启动子的绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pEGFP-γ,将其分别与4种cPKC(PKCα、PKCβⅠ、PKCβⅡ、PKCγ)真核表达载体共转染C2C12肌细胞.结果发现PKCβⅠ、PKCβⅡ对nAChRγ启动子驱动的GFP报告基因表达没有影响(P＞0.05),PKCγ对报告基因表达有抑制作用(P＜0.05),PKCα则有明显抑制作用(P＜0.01).采用4种cPKC真核表达载体与GFP-生肌素融合蛋白表达载体(pGFP-myog)共转染C2C12肌细胞,观察了不同亚型PKC表达对生肌素浆至核转位的影响,发现只有强制性表达外源性PKCα可明显抑制生肌素向核中转位,而PKCβⅠ、PKCβⅡ及PKCγ对生肌素浆核转位没有明显抑制作用.结果提示,PKCα通过抑制生肌素转位是阻遏nAChR基因表达机制之一.     

PKCα抑制生肌素转位及nAChR基因表达

 烟碱样乙酰胆碱受体 (nAChR)的表达调控受神经电活动影响 ,电刺激引起肌细胞膜去极化可抑制nAChR的表达 .以往的研究表明 ,Ca2 +和PKC以及生肌素在其中发挥着重要的作用 .然而 ,目前尚不清楚究竟是哪种PKC亚型参与此过程 ,PKC激活对特异转录因子生肌素浆核转位有何影响 ?为探讨PKC在去极化 nAChR转录偶联中的作用 ,构建了含nAChRγ亚基启动子的绿色荧光蛋白 (GFP)表达载体pEGFP γ ,将其分别与 4种cPKC(PKCα、PKCβⅠ、PKCβⅡ、PKCγ)真核表达载体共转染C2C12肌细胞 .结果发现PKCβⅠ、PKCβⅡ对nAChRγ启动子驱动的GFP报告基因表达没有影响 (P >0 .0 5 ) ,PKCγ对报告基因表达有抑制作用 (P <0 .0 5 ) ,PKCα则有明显抑制作用 (P <0 .0 1) .采用 4种cPKC真核表达载体与GFP 生肌素融合蛋白表达载体 (pGFP myog)共转染C2C12肌细胞 ,观察了不同亚型PKC表达对生肌素浆至核转位的影响 ,发现只有强制性表达外源性PKCα可明显抑制生肌素向核中转位 ,而PKCβⅠ、PKCβⅡ及PKCγ对生肌素浆核转位没有明显抑制作用 .结果提示 ,PKCα通过抑制生肌素转位是阻遏nAChR基因表达机制之一 .     

生理性胰岛素释放需要蛋白激酶C吗?

近年来,关于生理性胰岛素释放是否与β细胞上蛋白激酶 C 被激活有关的问题,受到注目。一些研究表明,Ca~(2+)依赖性蛋白激酶 C 或磷脂依赖性蛋白激酶 C(作为单独酶或有关酶族)存在于啮齿类动物的β细胞上。蛋白激酶 C(PKC)可由内源性二酰基甘油或花生四烯酸激活;也可由外源性12-0-tetradecanoylphor-bol-13-acetate(TPA)、欧瑞香脂激活。其机制可能为分泌颗粒或细胞支架上关键蛋白质磷酸化,使 Ca~(2+)的细胞外装置被致敏。对蛋白激酶 C 非特异性抑制剂的研究发现,多粘菌素 B、三氟吡啦嗪和抗霉素 A 不仅抑制蛋白激酶 C     

非典型蛋白激酶C的研究进展

非典型蛋白激酶C(atypical PKC,aPKC)是蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)家族中的亚家族。aPKC具有不同于PKC家族中其他亚型的结构特征和功能特性,它在调控细胞极性建立、细胞骨架的动态组装、细胞的非对称性分裂、囊泡运输等多种生物学事件中发挥重要调控作用,从而广泛影响多种组织器官的发育及多类疾病的发生发展。aPKC的蛋白质翻译后修饰对于aPKC的激活与抑制具有重要调控作用。本文就近年来aPKC的结构、功能及蛋白质翻译后修饰的研究进展作一综述。     

蛋白激酶C亚型在HL-60细胞诱导分化中的变化

用全反式维甲酸(ATRA)或佛波酯(PMA)处理人早幼粒白血病细胞(HL-60)3天,用形态学,NBT还原实验,特异性和非特异性酯酶测定,证明细胞分别向粒细胞或单核/巨噬细胞分化。通过免疫组化法观察了蛋白激酶C(PKC)α,βⅠ和βⅡ亚型在分化后的变化。结果显示,ATRA可引起HL-60细胞PKCα,βⅠ和βⅡ的含量升高,分别为对照的5.0,2.8和4.2倍,并存在从胞膜向胞质转位。PMA则使PKCα和βⅡ的表达水平下降,而PKCβⅠ增高,且三种亚型均在核内有不同程度的表达。结果提示HL-60细胞向粒细胞的分化可能需要PKCα和PKCβ评的持续激活,而PKC的核内转位可能是HL-60细胞分化为单核/巨噬细胞的重要环节。     

两种PMA诱导方案对THP-1巨噬细胞M1和M2亚型相关基因表达的影响

佛波酯诱导THP-1单核细胞系分化为巨噬细胞的模型广泛被使用,目前主要使用高、低浓度两种方案,其是否对M1和M2亚型相关基因的表达有影响鲜有报道。该研究比较了两种常用佛波酯方案对THP-1细胞分化为巨噬细胞及进一步极化为M1和M2亚型过程后相关标志基因的表达情况。结果表明,高浓度佛波酯方案增强M0细胞白介素-1β、肿瘤坏死因子-α、诱导型一氧化氮合酶和甘露糖受体C1、转化生长因子-β的表达,而抑制白介素-10的表达。进一步极化为M1和M2亚型时,高浓度佛波酯方案主要增强白介素-1β,而抑制白介素-6对干扰素-γ的应答,而低浓度方案增强甘露糖受体C1、树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3结合非整合蛋白因子对白介素-4的应答。两种佛波酯方案可诱导THP-1产生不同表型的巨噬细胞以及后续极化亚型,需根据实验目的选择合适的诱导方案。     

TRPC1与Orai1的相互作用参与人脐静脉内皮细胞钙敏感受体介导的钙内流及一氧化氮生成

本研究旨在探讨Ca~(2+)感受蛋白经典瞬时感受器电位蛋白1(canonical transient receptor potential channel 1,TRPC1)与钙释放激活钙通道调节分子1(calcium release-activated calcium modulator 1,Orai1)的相互作用在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)钙敏感受体(Ca-sensing receptor,Ca R)介导的Ca~(2+)内流和一氧化氮(NO)生成中的作用。取2~3代HUVECs,单独或联合用Ca R激动剂精胺[Spermine,激活钙库活化的钙通道(store-operated calcium channels,SOC)和受体活化的钙通道(receptor-operated calcium channels,ROC)]、ROC模拟剂12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)+Ca R负性变构调节剂Calhex231(阻断SOC,激活ROC)、PKC抑制剂Ro31-8220(激活SOC,阻断ROC)以及经典型PKCs和PKCμ抑制剂Go6967(激活SOC,阻断ROC)处理。用免疫荧光技术检测HUVECs中TRPC1和Orai1的蛋白表达、共定位;用免疫共沉淀法检测TRPC1和Orai1之间的相互作用模式;随后用TRPC1和Orai1干扰质粒联合转染HUVECs,采用荧光探针同时检测HUVECs中[Ca~(2+)]i和NO生成的变化。结果显示,HUVECs中TRPC1和Orai1蛋白表达共定位于胞膜。与Spermine+Ca~(2+)组相比,Calhex231+TPA+Spermine+Ca~(2+)组、Ro31-8220+Spermine+Ca~(2+)组和Go6976+Spermine+Ca~(2+)组HUVECs中定位于胞浆中的TRPC1、Orai1蛋白表达均显著降低,二者的结合也减少。免疫共沉淀结果显示,Calhex231+TPA+Spermine+Ca~(2+)组、Ro31-8220+Spermine+Ca~(2+)组和Go6976+Spermine+Ca~(2+)组TRPC1/Orai1和Orai1/TRPC1相对比值百分数均明显低于对照组以及Spermine+Ca~(2+)组(均P0.05),表明Orai1和TRPC1相互作用均减弱。联合转染质粒敲低TRPC1和Orai1显著降低Spermine+Ca~(2+)组、Calhex231+TPA+Spermine+Ca~(2+)组、Ro31-8220+Spermine+Ca~(2+)组和Go6976+Spermine+Ca~(2+)组的HUVECs中[Ca~(2+)]i和NO生成。以上结果提示,TRPC1与Orai1以二元复合物的形式激活SOC和ROC,介导Ca~(2+)内流及NO生成。     

蛋白激酶C研究的最新进展

作为能使蛋白激酶C(PKC)活化的第二信使甘油二酯(DAG)不仅可由磷脂酰肌醇(PtdIns)水解产生,大量实验表明还可从磷脂酰胆碱(PC)水解而来,其中磷脂酶C(PLC)及磷脂酶D(PLD)参与了这一过程,磷脂酶A₂(PLA₂)的作用产物脂肪酸(FA)也能激活PKC.PKC至少有10种亚型,依据其活化方式可分三大类:典型PKC,新PKC和非典型PKC.PKC参与了基因表达的调控.     

植物蛋白激酶C的研究进展

“胞内信使系统”是当前生物科学中的研究热点之一。越来越多的证据表明,植物细胞中可能存在肌醇脂质信使系统,蛋白激酶 C(protein kinase C,PKC)是其关键成员之一,与依赖于环核苷酸(cAMP、cGMP)或者 Ca~(2+)-CaM 的蛋白激酶不同的是,PKC 是一种新发现的蛋白激酶,它依赖于 Ca~(2+)和磷脂。PKG 在细胞效应中所起的作用正受到重视,近年来,     

血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞中大电导钙激活钾通道的多重调节作用（英文）

肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)是影响血管平滑肌细胞张力的重要因素。RAS主要活性物质血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)可通过激活血管紧张素Ⅱ-1型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor, AT1R)升高胞内Ca~(2+)浓度,收缩平滑肌细胞。大电导钙激活钾(large-conductance Ca~(2+)-and voltage-activated potassium, BK)通道是血管平滑肌细胞中分布最广、表达最多的钾离子通道,在维持细胞膜电位和胞内钾钙平衡中发挥重要作用。血管平滑肌细胞上的BK通道主要包含α与β1两种亚基。其中功能亚基BKα上分布有膜电位及Ca~(2+)感受器。因此当膜电位或细胞内Ca~(2+)浓度升高时会反馈性引起BK通道开放。然而,越来越多的研究显示,尽管Ang Ⅱ可升高胞内Ca~(2+)浓度,但却通过激活PKC通路、促进AT1R与BKα通道形成的异源二聚体内吞、加快α与β1亚基解离等途径抑制BK通道的表达和功能。在一些情况下,Ang Ⅱ对BK通道也可表现出激活作用,但机制尚不完全明确。该综述总结了Ang Ⅱ对BK通道抑制或激活两方面效应的可能原因,为改善细胞内离子失衡提供理论依据。     

小鼠腹水型肝癌中蛋白激酶C的研究及硒对该酶的调节作用

蛋白激酶C(PKC)是一种依赖于磷脂和Ca~(2+)的蛋白激酶,在生物界中广泛存在,并分布在哺乳动物的各种组织中。在信号传导过程中,磷脂肌醇系统最终以活化PKC和Ca~(2+)动员的方式完成胞外信息的传递。由于磷脂肌醇系统介导的胞外信号之广,因而PKC与诸如受体的增效和脱敏等生理过程以及细胞分化增殖,     

非损伤微测技术实时检测海马脑片跨膜钙离子流

脑内β-淀粉样蛋白(amyloid-βprotein,Aβ)的聚集是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的重要病理特征。Aβ的神经毒性作用机制与其扰乱神经元Ca~(2+)稳态有密切关系。非损伤微测技术(non-invasive micro-test technique,NMT)是近年发展起来的一种利用Fick第一扩散定律和Nernst方程,通过非接触方式检测膜外扩散电位获取离子跨膜流速的最新技术手段。本研究在C57BL/6小鼠海马脑片,利用NMT首次检测了Aβ对谷氨酸(Glu)诱发的Ca~(2+)内流以及细胞外低钙引起的Ca~(2+)外排的影响,并初步探讨了Aβ扰乱神经元Ca~(2+)稳态的相关机制。结果显示:(1)急性给予Glu可诱发海马脑片CA1区神经元产生起始快、继而缓慢衰减的持续性内向Ca~(2+)流;(2)Aβ预处理浓度依赖性地增强海马神经元对Glu的反应性,显著提高给药后5 min内Ca~(2+)内流的平均流速,而NMDA受体拮抗剂D-APV可有效阻断Aβ对神经元Glu反应的这种易化作用;(3)用低钙人工脑脊液急性灌流脑片可引起海马CA1区神经元产生持续的外向跨膜Ca~(2+)流,其大部分可被特异性Na+/Ca~(2+)交换体抑制剂KB-R7943所阻断;(4)Aβ预处理可部分抑制低钙人工脑脊液引起的Ca~(2+)外排。这些结果表明:Aβ引起的细胞内Ca~(2+)超载不仅涉及到Ca~(2+)内流增加,也与其对Ca~(2+)外排的抑制有关;Aβ易化Glu的兴奋毒作用主要是通过NMDA受体介导的,其抑制Ca~(2+)外排的靶点主要是Na+/Ca~(2+)交换体。NMT具有操作相对简单、实时获取结果、非损伤的优点,适用于脑片Ca~(2+)内流和Ca~(2+)外排的长时间测定。因此,本研究不仅为解释Aβ所致Ca~(2+)超载的神经毒性机制提供了新的实验证据,也为开展跨膜Ca~(2+)信号转导机制的脑研究提供了新的技术方法。     

过表达蛋白激酶CβI亚类NRK细胞模型的建立和初步分析

本实验通过逆转录病毒载体pMV7将大鼠蛋白激酶c(Protein Kinase C,PKC)βⅠ亚类cDNA全长片段导入NRK细胞中,建立了一个过表达PKC-βⅠ亚类的NRK细胞模型,并对此细胞模型在佛波脂TPA进一步诱导激活PKC状态下的生长情况及与c-jun基因表达的相关性进行了初步观察。     

去极化时Ca~(2+) 内流引起蛋白激酶C_α浆膜转位

 为观察胞外Ca2 + 内流和肌浆网Ca2 + 释放两种来源的Ca2 + 对cPKCα转位激活的影响 ,揭示PKC在去极化 nAChR转录偶联中的作用 ,构建了pPKCα EGFP N1融合蛋白真核基因表达载体 .转染C2C1 2肌细胞后 ,采用激光共聚焦显微镜记录了KC1或咖啡因处理所引起的细胞Ca2 + 波变化及PKCα GFP融合蛋白在细胞内的分布 .结果提示 ,只有用KC1处理引起细胞膜去极化时 ,伴随Ca2 +内流 ,才能观察到PKCα GFP绿色荧光在细胞内发生的细胞浆至细胞膜分布变化 .然而 ,采用肌浆网Ca2 + 通道激动剂咖啡因刺激肌细胞 ,使肌浆网中Ca2 + 释放 ,未见PKCα GFP绿色荧光在浆、膜分布发生任何变化 .结果提示 ,去极化时外Ca2 + 内流可引起PKCα转位激活 ,肌浆网Ca2 + 释放对PKCα的转位激活没有影响 .     

甲基-β-D-半乳糖与Ca~(2+)及β-唾液酸相互作用的NMR研究

本文主要研究Ca~(2+)与甲基-β-D-半乳糖、Ca~(2+)-β-唾液酸二元复合物与甲基-β-D-半乳糖之间的相互作用.在不同Ca~(2+)浓度时,用500MHz核磁共振波谱仪测得半乳糖与唾液酸质子的化学位移变化.由实验结果的分析得出:半乳糖与Ca~(2+)的专一结合较弱,其结合常数约为24.2M~(-1);半乳糖对Ca~(2+)-唾液酸的二元复合物的作用,增强了二元复合物中唾液酸与Ca~(2+)的亲和力,其结合常数为121.5M~(-1).     

低氧预适应增高小鼠脑组织内cPKCγ的膜转位水平

本实验拟通过观察重复性低氧对经典型蛋白激酶C(cPKC)膜转位水平(激活程度)的影响,初步探讨cPKC特定亚型在脑低氧预适应发生过程中的作用。按我室已建立的小鼠低氧预适应模型方法,制备重复性低氧1-4次的小鼠(H1-H4)。应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹(Western bolt)等生化技术,并结合Gel Doc凝胶成像系统,半定量检测小鼠海马和大脑皮层组织内cPKCα和γ的膜转位水平。实验结果表明,随低氧次数(H1-H4)的增加,小鼠海马组织内cPKCγ的膜转位水平明显增高,且在H2、H3和H4组的变化具有统计学显著意义(P<0.05,n=6);同样,大脑皮层内cPKCγ膜转位水平也随低氧次数的增加(H1-H4)而明显增高,且在H2、H3和H4组的变化具有统计学显著意义(P<0.05,n=6):而cPKCα亚型无论在大脑皮层还是在海马组织内的膜转位变化均无统计学意义。上述观察结果提示,cPKCγ膜转位可能在脑低氧预适应的发生发展过程中发挥着重要作用;但cPKCβ Ⅰ、β Ⅱ以及其它新奇型和非典型PKC特定亚型的变化还有待于进一步的研究和探讨。     

强声暴露对巴马小型猪海马细胞内Ca~(2+)变化及其信号通道的影响

声音对神经系统有重要影响,本研究旨在探讨噪音或高强度声音刺激对神经系统的影响及其机制。将听力正常的巴马小型猪随机分为正常对照组与强声暴露组。强声暴露组的巴马小型猪暴露于中低频强声(900 Hz-142 dB SPL)环境中15min,暴露结束后即刻分离出海马组织。用Fluo-4探针观察海马组织细胞内Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_i)的变化,用real-time PCR和Western blot分别检测Ca~(2+)受体、L-型Ca~(2+)通道α2/δ1亚基、PKC和PI3K的mRNA和蛋白表达,用DAPI染色法观察细胞核形态变化。结果显示,相对对照组,强声暴露组小型猪海马组织细胞[Ca~(2+)]_i明显增加,L-型Ca~(2+)通道α2/δ1亚基、PKC和PI3K mRNA表达上调,Ca~(2+)受体和PKC蛋白表达显著上调。此外,强声暴露引起海马组织细胞核出现肿胀变形等损伤样改变。以上结果提示,强声暴露可以通过激活海马组织PKC信号通路,引起[Ca~(2+)]_i上调,最终导致海马组织内细胞的损伤。本研究结果不仅揭示了强声引起神经损伤的可能机制,同时为防护强声对神经系统造成的损伤提供了新的思路。     

神经节苷脂GM_3对人白血病J6-2细胞PKC转位及DAG含量的影响

应用SDS PAGE及Western印迹技术检测神经节苷脂GM3 处理前后人白血病J6 2细胞不同类型PKC在细胞内的转位情况 ,同时利用高效薄板层析技术观察了细胞内DAG含量的变化 ,从而探讨GM3 抑制PKC活性的机制 .实验发现 ,GM3 处理后胞液PKCα明显增加 ,而颗粒结合PKCα则相对减少 ;GM3 对其它亚型PKC在细胞内分布无显著影响 .同时还发现 ,GM3 处理后细胞内DAG含量降低 (P <0 0 5 ) .结果表明 ,GM3 抑制PKCα由胞浆向质膜转位 ,对其它亚型PKC在细胞内转位无影响 .提示GM3 抑制的PKC亚型可能是PKCα .同时GM3 降低细胞内DAG含量 ,这可能与GM3抑制PKCα活性机制有关     

蛋白激酶C及其在缺血／低氧预适应机制方面的研究

蛋白激酶C(PKCs)最早是由Nishizuka等人于1977年在鼠脑中发现。迄今为止,人们通过分子克隆及酶学分析等已发现了14种PKCs同工酶(亚型),它们广泛地分布于生物体内的各种组织,其中以神经组织含量最为丰富。PKCs不同亚型可使不同的底物蛋白磷酸化和