恒河猴大脑前额叶cDNA文库的构建

为筛选出与认知、记忆相关的脑部表达基因及基因家族，利用TRIzol试剂从恒河猴大脑前额叶组织抽提总RNA，再用纯化试剂盒从总RNA中成功纯化出mRNA。按照Stratagene公司的cDNA Synthesis Kit(200401)、ZAP-cDNA Synthesis Kit(200400)和ZAP-cDNA GigapackⅢ Gold Cloning Kit(200450)三个试剂盒的操作说明，构建了恒河猴大脑前额叶组织的cDNA文库。文库总库容为2.0×10 ⁶克隆；绝大多数的cDNA插入片段≥0.5 kb，平均长度≈1.0 kb；cDNA片段与噬菌体载体重组率为97.3%。文库各项指标均达要求，为克隆大脑PFC区表达基因、测定基因编码区序列、揭示具有多种剪切组合模式等提供了可靠资源，也为相关基因表达调控的研究提供了方便。     

肠道菌群核酸提取自动化流程的优化

目的:优化肠道菌群核酸提取自动化流程。方法:收集粪便样本,分别采用手工方法、核酸提取工作站提取核酸,然后利用液体工作站制备PCR反应液进行PCR扩增,最后采用文库工作站建库测序。结果:400μl样品用QIAamp~ Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒裂解液裂解后,用MagMAX~(TM) Express 96机器提取核酸的方法与用QIAamp~ Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒手工提取核酸的方法相比,测序得到的序列数基本一致,分析结果也没有明显区别;而单独采用MagMAX~(TM)Viral RNA Isolation Kit试剂盒提取核酸由于样品投入体积受限(50μl)、核酸浓度低、测序得到的序列数太少,不能满足后续的分析要求。结论:通过结合使用两种不同的试剂盒,可以实现核酸提取、PCR反应液配制及文库制备的全流程自动化操作,从而大大提高工作效率和结果的稳定性。     

东亚三角涡虫cDNA文库的构建及EST初步分析

为了快速高效地分离鉴定东亚三角涡虫的发育和再生相关基因,以总RNA为模板,借助CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit和Advantage 2 PCR Kit成功构建了东亚三角涡虫的cDNA文库.经测定,cDNA文库原始库容为1.22×105个独立克隆,重组率超过98 %,插入片段平均大小为900 bp.从文库中随机挑选重组克隆测序,并在NCBI数据库中比对,结果获得208个rRNA基因,148个编码蛋白基因,78个染色体片段基因.该研究为我国涡虫发育和再生的深入研究奠定了坚实的分子基础.     

草地螟中肠cDNA文库的构建及初步鉴定

以草地螟中肠为材料,分别采用、Oligotex mRNA kit、ZAP-cDNA(R)synthesis kit和ZAP-cDNA(R)Gigapack(R)Ⅲ Gold Cloning Kit提取草地螟幼虫中肠总KNA,分离纯化mRNA并构建了草地螟中肠cDNA表达文库.测得文库的原始滴度为3.73×106pfu/ml,蓝白斑测定重组率迭99.7%,插入片段平均长度约为1.8 kb.草地螟中肠cDNA表达文库的成功构建为利用文库筛选中肠靶标蛋白提供了材料来源,为研制、开发草地螟生防药剂的新靶标以及研究其作用的分子机制奠定了基础.     

菠萝果实cDNA文库的构建

以菠萝幼果为研究材料,采用Creator^TMSMART^TM cDNA Library Construction Kit技术构建菠萝幼果cDNA文库,其文库的库容量为1．01×10^6,重组率为92％,PCR检测表明大多数插入片段均大于1000bp。     

烤烟品种南江3号均一化全长cDNA文库构建

目的:为了获得功能基因的信息,构建烤烟品种南江3号的均一化cDNA文库.方法:用RNeasy Plant Mini Kit提取烤烟南江3号叶片和花的RNA,用反转录酶逆转录合成第一链eDNA.以LD-PCR扩增获得的双链cDNA为模板,采用基于双链特异性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease,DSN)的均一化cDNA文库技术,构建南江3号盛花期的均一化cDNA文库.结果:构建了南江3号盛花期的均一化cDNA文库,文库重组率大为97.47%,库容量约为1.26×10<'6>,插入片段平均长度大于1.2kb.从文库中随机48个克隆进行PCR检测,挑取20个克隆进行测序,序列通过BLAST比对结果显示文库可能包含大量基因和ESTs序列.结论:该文库为研究南江3号的基因功能和资源提供材料来源.     

香蕉红素氧还蛋白酵母双杂交eDNA文库的构建及鉴定

结合改良的BD SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit User Manual cDNA合成试剂盒,反转录合成带有目的接头cDNA第一链,通过LD-PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA).产物经双酶切后回收,与经同样双酶切的酵母双杂交系统中pGADT7载体连接转化,并进行了鉴定.结果表明:提取的RAN的A260/A280=1.82,表明所提RNA纯度高:双链cDNA文库大于0.2 kb,且弥散较长,成瀑布条带状;根据生长菌落计数,文库含有1.2×106转化子,重组子不同插入片段在0.3～2 kb之间.表明该文库达到建库要求,为下一步进行酵母双杂交试验奠定基础.此方法用于构建cDNA文库与酵母双杂交系统相结合的研究目前尚未见过相关报道.     

毛冠鹿大脑组织全长cDNA文库构建

运用SMART技术构建了毛冠鹿(Elaphodus cephalophus)大脑组织全长cDNA文库。提取大脑组织总RNA,Oligotex mRNA Kit纯化、获得poly(A) RNA,以CDSⅢ/3′PCR引物进行逆转录,LD-PCR扩增获得全长双链cDNA,经SfiⅠ酶切及柱层析分离后,500 bp以上的片段与载体λTripIEx2连接,体外包装得到cDNA文库。经鉴定原始文库滴度为5.1×105pfu/ml,扩增后文库滴度为1.5×109pfu/ml,重组率达到85%以上,插入片断平均长度约为1.0 kb,说明构建文库质量符合要求,可用于大脑特异表达基因的筛选。从该文库中克隆到了rig基因全长,包含5′和3′非编码区,从第43至477个核苷酸为一完整阅读框(ORF),此阅读框可编码一个145氨基酸的rig蛋白。     

巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建

为构建巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)孢子倾卵囊cDNA表灰文库,从E.maxima孢子化卵囊中提取总RNA,以总RNA为模板、λTriplex2TM为栽体,利用SMARTTM cDNA文库构建试剂盒构建全长cDNA表达文库.经测定构建的E.maxima cDNA表达文库的原始文库容量为1×106 pfu/ml,扩增后的文库滴度为5×1010pfu/ml,重组率为95%,插入片断主要集中在0.5～1kb之间.根据已知序列设计引物,能从文库中扩增出编码E.maxima免疫球蛋白重链结合蛋白的基因序列片段.结果 表明所构建的E.maxima cDNA表达文库质量良好,为克隆、筛选E.maxima的功能性基因奠定了基础.     

蝶兰胚珠的cDNA文库构建及其特异基因表达的研究

以蝶兰(Phalaenopsis“Mt.Kaala”cv SM9108)为材料,分别提取大孢子母细胞时期胚珠和成熟胚珠的PolyA RNA,反转录成cDNA,构建起两个cDNA文库。克隆筛选采用差异杂交法。从上述两个cDNA文库中,各选择一个筛选出的cDNA,对其在植物体不同器官和不同发育时期的胚珠内的表达进行了分析。结果表明该两个cDNA均为胚珠特异,并且分别在胚珠发育的特定时期表达。推测该两个cDNA的表达受胚珠内部的不同因子调控。     

简单克隆存在比率小的cDNA的新方法

英国Medical Research Council(MRC)的Sydney Brenner等开发了能将存在比率小的cDNA均一地文库化的新方法“Cot-PCR法”。1月在大阪召开的国际讨论会“cDNA Research Today”上发表。在普通聚合酶链反应(PCR)的周期中仅新增加退火操作的一点时间,不需要去除用退火生成的双链DNA的时间。     

副肌球蛋白和原肌球蛋白结构上的关系

(一)对同一河蚌斧足肌中共存的TM和PM,在分子大小形状、壹级结构若干特点和免疫专一性等几个方面进行了比较。也观察了同一河蚌的不同肌肉,即斧足肌与闭壳肌之间,同类蛋白质的异同。(二)在河蚌同一肌肉中并存的PM和TM分子大小截然不同;前者的初步数值靠近二十万,而后者约六万。在河蚌两种不同肌肉中的TM分子大小相同。(三)在抗原结构上,TM与PM有着本质上的差异,TM与PM同无免疫交叉反应。(四)TM与PM的酶解图谱属于两种不同的类型。(五)河蚌斧足肌和红、白两种闭壳肌的三种TM之同,免疫行为与酶解图谱极为相似,三种PM之间也极相似。(六)发现67%氯乙醇可使PM分子解聚成约51,000大小的亚基。(七)讨论了TM和PM的关系。从大的方面讲,TM和PM主要相同之处在于“零级”(氨基酸组成)或贰、叁级结构,主要不同之处在于壹级和肆级结构。TM和PM许多性质的同异,可以从这些结构上的同异来理解。看来TM和PM应是两类而非一类蛋白质。     

粗毛栓菌cDNA文库的构建和漆酶基因的表达分析

粗毛栓菌（Trametes gallica）能够分泌多种胞外氧化酶并且快速降解木质纤维素.为了快速高效分离鉴定粗毛栓菌木质纤维素降解酶相关基因,用Trizol试剂提取不同培养条件下粗毛栓菌总RNA,用Creator^TM SMART^TM cDNA Library Construction Kit和Advantage^®2 PCR Kit成功构建了该菌全长cDNA文库.原始文库滴度为1.5×10⁵cfu,重组率达99%,插入片段在0.7～2.0 kb之间,平均大小约1 kb. 随机取16个重组子进行测序,全长cDNA序列完整性率为85.7%;并筛选到1个漆酶基因,编码区长1 551 bp,预测的蛋白质由517个氨基酸残基组成,分子量为55.41 kD,等电点为4.76.用半定量RT-PCR法分析了该漆酶基因在不同培养条件下的表达水平. 结果显示,高浓度的碳源,氮源,Cu^2＋均能诱导此基因的表达,该结果为漆酶基因的表达调控机制的深入研究奠定了基础.     

人绒毛膜促性腺激素β亚基和绵羊垂体促性腺激素共有α亚基组成的单链多肽的生物合成

采用重叠PCR方法,将人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCGβ)cDNA3'端与绵羊垂体促性腺激素共有α亚基(oLHα)cDNA 5'端串联起来,构建了hCGβ-oLHα嵌合cDNA。将嵌合cDNA克隆入核型多角体病毒(AcNPV)表达载体pVL1393得到表达型质粒pVL1393-hCGβ-oLHα,并与BaculoGold~(TM)线性化AcNPV基因组DNA共转染昆虫细胞Sf9,筛选得到重组病毒AcNPV-hCGβ-oLHα。以扩增后的重组病毒感染昆虫细胞进行表达,并进一步经偶联抗hCGβ单抗亲和层析柱纯化得到hCGβ-oLHα单链多肽。SDS-PAGE银染和免疫印迹分析结果表明表达产物在非还原条件下表观分子量约40.5kD,还原条件下约为38.0kD,这说明表达产物具有链内二硫链及次级构象。竞争抑制~(125)I-hCGβ与抗体结合的检测结果表明其与hCGβ抗体结合活性较天然hCG弱,但较天然hCGβ略有增加。由此可见单链多肽作为抗hCG夏合抗原避孕疫苗的靶抗原,具有潜在的应用前景。     

水母雪莲愈伤组织cDNA文库的构建

用TRIZOL Reagent提取水母雪莲红色系1~15 d愈伤组织总RNA,用SMART cDNA Library Construction Kit构建cDNA文库。经测定原始文库滴度达到1.5~4×106,扩增总文库滴度达到1011,重组率达到98%,插入片段在0.5 kb到3 kb之间,多在1 kb左右。通过PCR检测,从总文库中检测到了雪莲CHS、DFR及SmP基因的特异片段。SmP基因是转录调控因子,其表达丰度很低。各项指标都表明,已获得高质量的cDNA文库,为雪莲基因资源保存,雪莲类黄酮次生代谢分子调控奠定了坚实的基础。     

水母雪莲愈伤组织cDNA文库的构建

用TRIZOL Reagent提取水母雪莲红色系1～15d愈伤组织总RNA,用SMART cDNA Library Construction Kit构建cDNA文库.经测定原始文库滴度达到1.5～4×106,扩增总文库滴度达到1011,重组率达到98%,插入片段在0.5kb到3kb之间,多在1kb左右.通过PCR检测,从总文库中检测到了雪莲CHS、DFR及SmP基因的特异片段.SmP基因是转录调控因子,其表达丰度很低.各项指标都表明,已获得高质量的cDNA文库,为雪莲基因资源保存,雪莲类黄酮次生代谢分子调控奠定了坚实的基础.     

重组人卵泡刺激素在昆虫细胞中的表达

为了研究在昆虫细胞中表达重组人卵泡刺激素,我们以人胎盘组织提取的染色体DNA为模板,利用重叠PCR方法扩增出hFSHβ亚基的cDNA的编码区。将此cDNA克隆入核型多角体病毒(AcNPV)非融合蛋白基因表达载体pVL1393,我们得到了表达载体pVL1393-hFSHβ,然后与BaculoGold~(TM)线性杆状病毒DNA共转染昆虫细胞SF9,经多次扩增后获得高滴度的重组病毒AcNPV-hFSHβ。将此重组病毒感染昆虫细胞,我们得到了在胞浆中表达的hFSHβ亚基,Western blot显示分子量大约为21kDa。以重组病毒AcNPV-hFSHβ与AcNPV-hCGα一同感染昆虫细胞得到了具有分泌性的重组hFSH异二聚体,在非还原的条件下Western blot显示分子量大约为33kDa。     

犬瘟热病毒小熊猫株反向遗传系统的构建及其鉴定

以驯化致弱的犬瘟热病毒小熊猫株(Canine distemper virus,CDV)为模板,构建犬痘热病毒感染性cDNA克隆.对其全基因组序列测定后,用RT-PCR的方法获得组成全长基因的7个片段,通过酶切、拼接将7段CDVcDNA序列插入到真核表达载体pCI的MCS上,构建犬瘟热病毒小熊猫株的全长cDNA质粒(pCI-CDV-LP),同时分别克隆CDV小熊猫株N、P、L蛋白ORF构建三个辅助质粒.酶切鉴定和序列测定表明,pCI载体中插入的核酶及CDV cDNA序列正确无误,使用转染试剂Lipofectamine TM 2000将全长质粒和三个辅助质粒共转染中国仓鼠肾细胞(BSR),经RT-PCR、间接免疫荧光和病毒感染VERO-SLAM细胞试验鉴定,成功拯救出CDV小熊猫株,显示CDV小熊猫株反向遗传系统构建完成,为犬瘟热病毒致病机理及免疫研究奠定基础.