人snail真核表达载体构建与鉴定

目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长c DNA,经Bam H I、Eco R I双酶切、连接,插入pc DNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pc DNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI Gen Bank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pc DNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。     

肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中克隆的研究

在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段,为P1蛋白基因片段的扩增、表达及探讨羧基端基因片段功能打基础.采用PCR扩增方法获取P1结构基因.扩增产物用SalI和EcoRI酶切消化,回收1kb大小的DNA片段并与pUC19DNA连接,转入大肠杆菌JM109菌株.用X-gal平板及质粒图谱分析方法筛选重组克隆株,再用限制性核酸内切酶酶切图谱分析鉴定.经PCR扩增MPDNA获得1条5.0kbDNA片段.重组质粒限制性内切酶指纹图谱显示出2条带,1条为pUC19载体DNA带,另1条是1kb的插入片段.实验获得肺炎支原体P1蛋白结构基因及含P1蛋白羧基端DNA片段的重组克隆株.     

重组腺相关病毒介导的大鼠脂联素载体的构建与鉴定

目的:克隆大鼠脂联素基因(Acrp30),并对载有脂联素的重组腺相关病毒(AAV)载体进行构建及鉴定.方法:根据Acrp30的基因序列设计引物,上游引入EcoR Ⅰ位点,下游引入Sal Ⅰ位点,以EX-A0242-M01-Acrp30为模板扩增目的基因.将Acrp30基因克隆入pUC19载体中,获得重组质粒pUC19-Acrp30.然后用EcoR Ⅰ与sal Ⅰ酶切pUC19-Acrp30及质粒pSNAV,回收酶切片段,T4DNA连接酶16℃过夜,转化大肠杆菌DH5a感受肽细胞,筛选阳性克隆获得pSNAV-Acrp30,EcoR Ⅰ/Sal双酶切鉴定,并行全基因测序.结果:PCR电泳及酶切鉴定表明,pSNAV-Acrp30重组成功,基因测序显示装入pSNAV质粒中的Acrp30基因正确.结论:脂联素病毒栽体成功构建,可以满足脂联素基因研究和治疗的需要.     

人Leptin的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

用 RT- PCR自脂肪细胞 RNA扩增人瘦素 (leptin)基因的 c DNA片段 (约 50 0 bp)并克隆至克隆载体 p SK(+) ,获得重组质粒 p SK- OB,DNA序列分析显示获得的 Leptin基因和文献报道一致 .用限制酶 Eco R 和 Bam H 从 p SK- OB切下并插入原核表达载体 p BV2 2 0的相应限制酶位点 ,转化大肠杆菌 DH5α.转化菌株经 42℃诱导 ,SDS- PAGE检测和 Western印迹鉴定 ,获得高水平重组人瘦素的表达菌株 ,其表达量达菌体总蛋白的 30 %以上 .     

粪产碱菌(Alcaligenes faecalix)基因文库的构建和nifH基因同源顺序的克隆

采用λ噬菌体置换型载体EMBL4,构建了Alcaligenes faecalis A-15 H1菌株总DNA的基因文库。用Sau3AⅠ限制酶完成部分酶切,取13—20kb大小的片段进行克隆。载体DNA经BamHⅠ和SaiⅠ完全双酶切,左右臂“退火”形成左右臂载体分子后再与外源片段连接。左右臂载体分子与外源片段按照1:1的分子比进行体外连接。用E.coli BHB2688和E.coli BHB2690制备的包装抽提物进行体外包装,所得基因文库效价测定为1.2×10~6 pfu,远远超过理论上所需的库容量。以nif H基因作为探针,经3轮噬菌斑原位杂交,从基因文库中筛选出含有其同源顺序的克隆,并得到了梯度点杂交的验证。对所得重组噬菌体克隆之一进行Southern转移杂交,结果证实,其3.5kb的EcoRⅠ酶切片段为nif H阳性杂交条带。将其克隆到质粒pUC19 DNA上后,转入受体菌JM101中。再次经Southern转移杂交,证明所得重组质粒克隆(pAFH)含有粪产碱菌中的与nifH基因有同源顺序的片段。     

促DNA修复多效蛋白诱导因子pprI逆转录病毒载体系统的构建及其鉴定

目的:为实现耐辐射球菌pprI基因在哺乳动物细胞中的稳定遗传与表达,构建重组逆转录病毒载体质粒pLXIN-pprI。方法:将目的基因pprI亚克隆经过双酶切后定向连接到pLXIN质粒上,构建逆转录病毒重组质粒pLXIN-pprI。将pLXIN-pprI转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,氨苄青霉素筛选后抽提获得重组质粒pLXIN-pprI,双酶切及DNA测序鉴定。结果:酶切鉴定及测序结果显示结果与预期相符,pprI基因成功插入pLXIN逆转录病毒载体中。结论:重组逆转录病毒载体质粒pLXIN-pprI构建成功,为实现耐辐射球菌pprI基因在哺乳动物细胞中的重组与表达奠定了基础。     

人类肥胖基因瘦素蛋白的原核表达

目的：原核表达人类肥胖基因瘦素蛋白,方法：以携人类肥胖基因的pUC119-ob为模拟,PCR扩增瘦素蛋白基因片段,并克隆到pET-32a构建重组表达质粒pET-32a-ob,经酶切和测序鉴定后,转化至大肠埃希菌DH5α中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果：测序和限制性分析均证明了pET-32a-ob的序列正确,转化的DH5α可高效表达一个30kD融合蛋白,与预期结果一致。结论：经pET-32a-ob转化的DH5α可有效表达重组人类瘦素蛋白,为进一步研究瘦素蛋白的生物活性提供了基础。     

运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,以基因组DNA为模板克隆得到运动发酵单胞菌(Zyrnomonas mobilis)乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenaseⅡ)基因adhB,连接到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSE-adhB。将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株DH5α中,重组菌株经IPTG诱导后,在乙醛指示平板检测到乙醇脱氢酶活性。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的40KD特异性蛋白质条带。重组菌株经诱导培养,每毫升发酵液酶活力为5u。     

芜菁花叶病毒（TUMV）核酸cDNA的合成与克隆

从接种芜菁花叶病毒后发病芥菜(Brassica Juneaen)中提取病毒,然后提取其核酸(TuMV-RNA)。以纯化的TuMV-RNA为模板,以Oligo(dT)_(12-18)及小牛胸腺DNA水解物为引物,合成双链cDNA,双链cDNA长度约500—4300bp。将双链cDNA补齐后,钝端连接到pUC19质粒的Smal位点,转化E.coli DH,获得500多个白色克隆。菌落原位杂交及酶切分析表明,重组质粒中的插入片段大多数为芜菁花叶病毒RNA的互补DNA,长度为500—4000bp。     

O139霍乱弧菌质粒基因组文库的建立及O抗原基因的筛选

合成O抗原的基因是串联在一起的一个基因簇,提取O139霍乱弧菌基因组DNA,限制性内切酶EcoRⅠ酶切,电泳回收4～20kb的DNA片段,构建质粒基因组文库。随机筛选重组克隆,获得一株可与O.139霍乱弧菌抗血清发生凝集反应的重组克隆,命名为大肠杆菌DH5α(pMG320)。经鉴定分析重组克隆所表达的O抗原具有良好的免疫原性及反应原性。酶切分析质粒pMG320,推知其O抗原基因大小约4.6kb。这为今后O.139霍乱疫苗的研制及O.139霍乱弧菌O抗原基因的结构和功能研究提供了条件。     

棉铃虫核多角体病毒基因库及其物理图谱

本文报道棉铃虫核多角体病毒DNA经限制性内切酶BamHI酶解,琼脂糖凝胶电泳分离,得到大小不同的11种片段。所得片段与BamHI酶解的pBR_(322)质粒DNA进行体外重组并转化大肠杆菌LE392菌株。根据菌落杂交和插入片段的分子量等鉴定,证明获得11个插入了病毒DNA片段的重组质粒,但其中两个大片段克隆的分子量比原片段小。通过限制酶EcoRI和BamHI酶解片段的交叉吸印杂交及用~(32)p标记的克隆片段与病毒DNA酶解片段杂交等方法,构建了病毒基因组BamHI的物理图谱。杂交结果表明,病毒基因组主要由独特的序列组成。     

O139霍乱弧菌质粒基因组文库的建立及O抗原基因的筛选

合成O-抗原的基因是串联在一起的一个基因簇,提取O139霍乱弧菌基因组DNA,限制性内切酶EcoRⅠ酶切,电泳回收4～20kb的DNA片段,构建质粒基因组文库.随机筛选重组克隆,获得一株可与O139霍乱弧菌抗血清发生凝集反应的重组克隆,命名为大肠杆菌DH5a(pMG320).经鉴定分析重组克隆所表达的O-抗原具有良好的免疫原性及反应原性.酶切分析质粒pMG320,推知其O-抗原基因大小约4.6kb.这为今后O139霍乱疫苗的研制及O139霍乱弧菌O-抗原基因的结构和功能研究提供了条件.     

鹿茸富脯氨酸多肽-APRP基因融合表达载体的构建及表达

目的:构建鹿茸富脯氨酸多肽(APRP)基因融合表达载体,并诱导表达融合蛋白GST-APRP。方法:以鹿茸顶端组织总c DNA为模板,PCR方法扩增目的片段,连接p MDTM18-T载体,转化E.coli DH5α进行TA克隆。酶切与测序鉴定合格后,将目的片段与p GEX-6P-1质粒连接,完成p GEX-6P-1-APRP融合表达载体的构建。利用原核表达系统进行初步诱导表达。SDS-PAGE蛋白电泳检测蛋白表达情况。结果:PCR成功扩增出目的基因片段,目的基因片段大小为216 bp。提取表达载体质粒经酶切及测序分析证实p GEX-6P-1-APRR融合表达载体构建成功。利用终浓度为0.5 m MIPTG诱导,融合蛋白成功表达,分子量为35 k Da。结论:目前利用基因工程技术获得特定的鹿茸多肽的报道很少。本研究结果表明,利用原核表达系统可在体外对鹿茸富脯氨酸多肽基因(APRP)进行融合表达,并且融合蛋白GST-APRP以可溶形式表达,有利于进一步研究APRP。这也为研究其他鹿茸多肽单体成分提供重要参考。     

DH10B菌株高效电转化条件探究

以pUC19、pECBAC1、pCLD04541DNA以及3个不同大小的BACDNA为材料,研究了E.coli DH10B菌株在5个不同脉冲电场下的转化效率。研究发现,随着DNA片段大小的增加,最高转化效率和最适场强迅速减小。利用DH10B细胞转化pUC19 DNA的最适场强是21kV/cm,而190kb BAC DNA仅为13kV/cm;在最适场强下,40kb BAC DNA的转化效率约是190kb BAC DNA的50倍。通过大量数据绘制了不同因素影响下转化效率的变化曲线,优化了E.coli DH10B菌株电转化条件,为质粒的重组转化以及大片段基因组文库的构建奠定了基础。     

含G0S2基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建

目的:克隆人G0S2基因启动子并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究G0S2基因转录调控提供质粒。方法:利用PCR技术从人胚肾293A细胞基因组DNA中克隆获得G0S2基因启动子的DNA片段,将其克隆至pGL3-basic表达载体中,并转化人大肠杆菌DH5α,经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将重组载体质粒与半乳糖苷酶表达质粒psV-β-Galactosidase共转染至大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),检测细胞中荧光素酶的活性。结果:pGL3-G0S2-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的G0S2基因片段有启动子活性(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-G0S2-Promoter报告基因质粒,为进一步研究G0S2基因的表达奠定了基础。     

酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因的克隆

利用PCR方法从酒类酒球菌(Oenococcus oeni)基因组中扩增出651 bp的DNA片段,将之克隆到pUC19-T载体上并转化大肠杆菌(E.coli)JM109菌株.重组质粒的测序结果表明,克隆到了苹果酸-乳酸酶基因(mle),它含有527 bp的阅读框架,其核苷酸序列与文献报道相同.     

地衣形芽孢杆菌热稳定α-淀粉酶基因的分子克隆及其在枯草杆菌中的表达

以E.coli噬菌体λ EMBL 3为载体,用鸟枪法将地衣形芽孢杆菌的热稳定α-淀粉酶基因克隆到λ噬菌体的基因组中。携带α-淀粉酶基因的杂种噬菌体λ pAmy_αL16的DNA,经限制性内切酶HindⅢ水解后,被亚克隆到枯草杆菌的质粒pNQ 122上,并得到了表达。通过重转化作用和物理图谱分析,证明α-淀粉酶基因位于3.9 kb的Hin dⅢ DNA限制片段上。 转化子枯草杆菌(pAmy_αL41)产生的α-淀粉酶的热稳定性、最适反应温度等与亲本菌株一致。α-淀粉酶的分子量和等电点也与原菌株相同。     

北极岛衣共生菌藻宏基因组文库的构建

为从地衣中筛选耐寒基因,采用CTAB法提取岛衣北极变种的共生菌藻中基因组DNA,经Sau3AⅠ酶切,获得2~6 kb的DNA片段。再与经BamHⅠ酶切消化并经去磷酸化处理的质粒载体pUC19体外连接,转化至DH5α大肠杆菌(Escherichia coli)的感受态细胞中,成功构建了岛衣北极变种的宏基因组文库。     

SMART技术构建栀子cDNA文库

目的:构建栀子叶片cDNA文库。方法:提取栀子叶片总RNA。利用SMART技术合成双链cDNA。双链cDNA经限制酶Sfil酶切后与pDNR-LIB质粒连接。利用电刺激转化法将重组质粒导入E.coli DH5α而获得文库。利用PCR法检测文库的重组率。结果:原始文库滴度为2.63×105cfu/ml。随机检测文库中的15个克隆,表明重组率约为86.7%。选择14个插入片段的长度在400bp以上的克隆进行测序和生物信息学分析,结果预测的全长基因占所检测序列的64.3%。结论:成功构建了栀子叶片的cDNA文库,为栀子基因的结构和功能的研究提供了基础。     

表达NM23-H1/NDPK-A工程菌的遗传稳定性研究

目的:研究重组工程菌的遗传稳定性。方法:利用重组表达质粒pBVNM-H1转化宿主菌E.coli DH5α,筛选重组工程菌DH5α-pBVNM-H1。将新构建好的重组工程菌在无选择压力的条件下进行连续传代培养,比较菌落在LB(-)和LB(+)培养基上的生长状况,并对传代菌株目标蛋白的表达情况以及质粒数量和目的基因DNA进行电泳鉴定。结果:重组工程菌连续传代50次中,在LB(-)和LB(+)培养基上的生长状况相同,目标蛋白表达量无显著差异,质粒数量及目的基因DNA结构稳定。结论:重组工程菌DH5α-pBVNM-H1具有良好的遗传稳定性。