肝癌患者血清乙肝病毒特异性miRNAs水平指标检测与术后肿瘤复发的相关性研究

目的:HBV感染患者血清中HBV相关miRNAS的表达水平会出现变化,分析乙肝病毒特异性miRNAs在乙肝肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者血清中的表达水平与术后肿瘤复发的关系.方法:采用实时荧光定量RT-PCR (Real-time RT-PCR)检测38例乙肝肝癌患者手术前后血清乙肝病毒特异性miRNAs(miR-122和miR-22)的表达.分析血清乙肝病毒特异性miRNAs的袁达水平与肝癌切除术后的预后与复发的关系.结果:乙肝肝癌患者血清miR-122和miR-22明显高于良性肝病和正常对照组(P＜0.01).手术前后血清miR-122和miR-22的表达差异显著(P＜0.01).乙肝肝癌患者血清miR-122和miR-22表达的高低与HBVDNA、肝硬化、AFP、肿瘤大小、病理分化、TNM分级有关(P＜0.05).血清miR-122和miR-22低表达组的复发转移率显著低于高表达组(P＜0.01).结论:miR-122和miR-22在乙肝肝癌患者血清中表达上调与肝癌复发转移率高和预后差密切相关,提示其可能是一个潜在的HCC预后分子标志物.     

HBV感染者外周血PBMC中TLR4 mRNA与病毒载量的相关性研究

目的探讨乙型肝炎病毒感染者外周血PBMC中TLR mRNA与乙肝病毒复制的相关性。方法采用逆转录PCR检测外周血单个核细胞（PBMC）中TLR4 mRNA的含量,实时荧光定量Real Time PCR的方法检测HBV DNA,进行相关性分析。结果不同病毒载量组（〈1×103copies/μg DNA,1×103copies/μg DNA〈且〈1×105copies/μg DNA,〉1×105copies/μg DNA）TLR4 mRNA水平差异具有显著性（P〈0.01）,HBV病毒载量的对数值与TLR4 mRNA的含量存在负相关（r=-0.537,P〈0.01）。TLR4 mRNA的相对表达量与患者的ALT、AST呈正相关（r=0.608、r=0.659,P〈0.01）。结论HBV在患者体内复制活跃、病毒载量增高与外周血单个核细胞TLR4mRNA的表达下调有关。     

血浆miR-122表达与肝癌手术前后肝损伤的相关性

目的:探讨血浆中micro RNA-122(miR-122)表达与肝癌根治切除术前后肝损伤的相关性。方法:选取2015年1月-2016年1月在我院择期行肝癌根治切除术的肝癌患者36例,作为研究组,另选择同期健康体检者30例作为对照组。分别取研究组患者术前、术后第1 d、7 d及对照组入组时的清晨肘静脉血,采取荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测血浆中miR-122表达水平,并检测两组血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)及转化生长因子-β1(TGF-β1)水平,分析手术前后研究组中各指标的相关性。结果:研究组术前血浆miR-122表达水平与血浆ALT、TGF-β1水平均高于对照组(P0.05)。与术前比较,研究组术后1 d血浆miR-122表达水平与血浆ALT、TGF-β1水平均明显上升(P0.05);且与术后1 d比较,肝癌患者术后7 d血浆miR-122、ALT、TGF-β1水平明显下降,且与术前比较差异有统计学意义(P0.05)。肝癌患者术前、术后1 d、7 d血浆miR-122表达水平与血浆ALT、TGF-β1水平均呈正相关(均P0.05)。结论:血浆miR-122与肝癌根治切除术前后肝功能损伤有关,可作为一种新型生物学指标。     

斑点杂交检测HBeAg阴性慢性携带者血清中乙肝病毒的感染性

<正> 急、慢性乙肝病程中病毒的感染性,目前用测定血清和肝细胞中的HBeAg、HBcAg和病毒DNA多聚酶等标记来评估。这些标记给病毒的启动复制提供了间接指征。只有给传染性携带者做血清病毒定量才是直接测定病毒DNA。重组DNA技术学在乙肝病毒(HBV)生物学上的应用,改变了人类肝炎的诊断和临床治疗。当发现HBsAg慢性携带者的HBeAg阳性血清中HBV DNA高达70-95％时,但在HBeAg阴性血清中却HBV DNA的检出是十分悬     

利用乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA构建慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型

目的通过水动力法注射乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)构建C57BL/6小鼠慢性乙型肝炎病毒感染的模型。方法取29只C57BL/6小鼠,分为实验组、对照组和空白组,应用水动力法分别注射HBV cccDNA、pAAV-HBV1.2及等渗盐水,于注射后收集不同时间点的血清和肝组织。利用放射免疫法检测血清样本中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg);荧光定量PCR检测血清和肝组织中HBV DNA拷贝数;免疫组织化学法检测肝组织中HBsAg和乙型肝炎病毒核心抗原(HBc Ag)的表达;苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织病理变化;使用SPSS 17.0对数据进行统计学分析。结果实验组HBsAg和HBeAg表达均呈现4个上升-下降曲线:HBsAg峰值分别出现在第3天、第3周、第7周和第9周;HBeAg峰值分别出现在第1天、第1周、第4周和第10周。对照组HBsAg和HBeAg表达分别呈现2个或3个明显的峰:HBsAg峰值分别出现在第3天和第8周;HBeAg峰值分别出现在第1天、第3周和第10周。空白组未检测出HBsAg和HBeAg。实验组HBV DNA拷贝数高于对照组的拷贝数(P<0.01);肝组织中HBV DNA拷贝数高于同期血清中的拷贝数(P<0.01);实验组和对照组的肝组织中均有HBsAg和HBc Ag的表达;实验组与对照组出现肝脏细胞炎症、肝细胞纤维化、肝细胞坏死等病理变化,而空白组正常。结论利用水动力法向C57BL/6小鼠体内转入HBV cccDNA,成功建立了慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型,与对照组比较,新建立的小鼠乙肝模型具有更高的HBV表达,动物模型为研究乙型肝炎病毒HBV cccDNA的感染及其引起肝损伤的机制奠定了基础。     

基线血清外泌体miR-155-5p联合乙型肝炎病毒DNA定量实验预测聚乙二醇干扰素治疗乙型肝炎e抗原阳性慢性乙型肝炎的疗效

探讨聚乙二醇干扰素(peginterferon, Peg-IFN)治疗乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)阳性慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者48周后,基线血清外泌体miR-155-5p表达水平联合乙型肝炎病毒DNA定量实验在预测HBeAg血清学转换中的价值。回顾性分析2016年6月至2019年6月在本中心初次接受抗病毒治疗的HBeAg阳性CHB患者88例。根据Peg-IFN治疗48周后是否发生HBeAg血清学转换,将患者分为治疗应答组和无应答组。采用多因素logistic回归探讨预测Peg-IFN治疗应答的因子,并应用受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线下面积评估预测效能。结果发现基线血清外泌体miR-155-5p(OR＝2.193,95% CI 1.315～3.655,P＝0.003)和HBV DNA(OR＝0.398,95% CI 0.163～0.976,P＝0.036)是Peg-IFN治疗效果的独立预测因子。基线血清外泌体miR-155-5p和HBV DNA的截断值分别取2.3和7.2 log₁₀IU/mL时,相应的ROC曲线下面积分别为0.788(95% CI 0.682～0.893)和0.704(95% CI 0.577～0.824)。基线血清外泌体miR-155-5p表达水平≥2.3且HBV DNA定量≤7.2 log₁₀IU/mL的患者,Peg-IFN治疗48周后其HBeAg血清学转换率最高,为66.67% (10/15);而基线血清外泌体miR-155-5p表达水平<2.3且HBV DNA定量>7.2 log₁₀IU/mL的患者,Peg-IFN 治疗48周后其HBeAg血清学转换率最低,仅为3.03%(1/33)。这些结果表明,基线血清外泌体miR-155-5p表达水平联合HBV DNA定量实验可以作为Peg-IFN 治疗HBeAg阳性CHB疗效的预测因子,对于优化CHB的抗病毒治疗有积极作用。     

父系HBeAg 阳性流产胚胎绒毛中HBV-DNA 的表达

目的:探讨在父系HBeAg阳性的流产胚胎中,乙型肝炎病毒在绒毛中的表达。方法:募集仅父系感染乙型肝炎病毒组合,即母HBsAg(-)且父HBsAg(+)流产胚胎。按以下组合将入选对象分为4组:组1为父HBeAg(+)母HBsAb(+);组2为父HBeAg(+)母HBsAb(-);组3为父HBeAg(-)母HBsAb(+);组4为父HBeAg(-)母HBsAb(-),采用酶联免疫吸附实验(ELISA)对胎儿父、母亲血清进行乙肝抗原、抗体检测,并使用荧光定量PCR法对胚胎绒毛进行HBV DNA检测。结果:父系感染乙型肝炎病毒的142例胚胎中,仅在父系HBeAg阳性组别(1、2组)84例胚胎中发现3例绒毛HBV-DNA升高,阳性率为3.57%。其中父HBeAg(+)母HBsAb(-)组合中2例,父HBeAg(+)母HBsAb(+)组合中1例。父系HBeAg均阳性,母系HBsAb阳性与阴性组间子代绒毛HBV-DNA升高率差异无显著性(P>0.05)。结论:HBeAg阳性父亲可能更容易导致乙肝父婴垂直传播。     

乙型肝炎病毒X蛋白通过miR-122调节肝癌细胞增殖及细胞周期的研究

乙型肝炎病毒中的功能蛋白乙肝病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein,HBx)在促进肝细胞恶性改变中起到重要作用,但目前HBx调控肝癌细胞生长的具体机制仍未完全阐明。miR-122是具有抑癌特性的一类miR,在乙肝相关肝癌中表达减少。为了研究HBx通过微小RNA(microRNA,miR)-122调节肝癌细胞增殖及细胞周期的作用,本研究培养肝癌HepG2细胞株并进行分组,NC组转染NC慢病毒载体、HBx组转染HBx慢病毒载体、HBx+NC模拟物组转染HBx慢病毒载体及NC模拟物、HBx+miR-122模拟物组转染HBx慢病毒载体及miR-122模拟物、NC模拟物组转染NC模拟物、miR-122模拟物组:转染miR-122模拟物。通过MTS法检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞周期,PCR检测miR-122表达量,western blot检测细胞周期蛋白G1(CyclinG1)、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)、β-连环蛋白(β-catenin)的表达量。结果显示HBx组细胞的OD值、细胞周期G2/M期比例及细胞中CyclinG1、XIAP、β-catenin的表达量均明显高于NC组(P0.05),细胞周期G0/G1期、S期比例及细胞中miR-122表达量均明显低于NC组(P0.05);HBx+miR-122模拟物组细胞的OD值、细胞周期G2/M期比例及细胞中CyclinG1、XIAP、β-catenin的表达量均明显低于HBx+NC模拟物组(P0.05),细胞周期G0/G1期、S期比例及细胞中miR-122表达量均明显高于HBx+NC模拟物组(P0.05);miR-122模拟物组CyclinG1、XIAP、β-catenin荧光素酶报告基因的荧光活性明显低于NC模拟物组(P0.05)。本研究结果充分说明HBx能够增强肝癌细胞的增殖活力及明显加速细胞周期,且该作用部分由miR-122的下调所介导。本研究首次阐明了HBx调节肝癌细胞生长的分子机制,也初步探明了具有抑癌活性的miR-122在肝癌细胞中可能靶向CyclinG1、XIAP、β-catenin等基因。     

关于miR-223在慢性乙型肝炎患者外周血中的表达及其生物学作用的研究

观察CHB患者与健康人群外周血microRNA(miRNA)差异表达谱,寻找具有抗HBV能力的miRNA.用高通量测序对CHB患者(C组)和健康对照人群(N组)各3例外周血样本进行检测,筛选差异表达的miRNA后进行qRT-PCR验证,并在细胞模型中转染miRNA mimic后,ELISA实验观察对HBsAg和HBeAg水平的影响.测序结果共1028个基因,其中上调的基因有27个,下调的基因有20个,无明显差异的基因981个(log2FC＜-0.585且P＜0.05为标准),取FC改变最显著的5个miRNAs进行扩大样本量qRT-PCR验证,发现只有miR-223表达水平下降83％,与芯片结果保持一致.与未转染相比,在HepG2.2.15细胞中转染miR-223 mimic后,miR-223表达水平上升5.81倍,而HBsAg和HBeAg分泌分别下降了 42％和34％,P＜0.05;而转染阴性对照的miR-223表达水平及HBsAg和HBeAg分泌无明显改变,P＞0.05.miR-223在CHB患者外周血中的表达显著下降,基于miR-223高表达的新型药物有可能对HBV有较好的抗病毒作用.     

应用慢病毒载体携带HBV基因组DNA制备乙型肝炎病毒感染小鼠模型的影响因素分析

应用慢病毒载体构建不同HBV转导质粒,通过高压水动力法尾静脉注射小鼠,比较不同HBV转导质粒、剂量(5μg和10μg)、小鼠品系(Balb/c和C57BL/6)及鼠龄(6周龄和18周龄)对建立HBV感染模型的影响。不同的时间点尾静脉采血,ELISA检测血清HBsAg、HBeAg的表达水平及动力变化,Real-time PCR检测血清及肝组织病毒载量;免疫组织化学法检测肝组织HBcAg的定位与表达。1.3倍HBV基因组慢病毒载体转导质粒(pCSHBV1.3)优于1.1倍与1.2倍HBV基因组转导质粒(pCS-HBV1.1or pCS-HBV1.2);pCS-HBV1.3注射Balb/c小鼠后抗原表达维持时间短,抗体出现早;pCS-HBV1.3注射C57BL/6小鼠后,HBsAg、HBeAg抗原表达及血清HBV DNA水平维持时间长;且注射5μg质粒相对于10μg质粒注射小鼠后抗原表达维持时间更长;而6周龄和18周龄小鼠血清均可在较长时间内检测到HBsAg、HBeAg及HBV DNA的表达,但在注射后35周内,前者的表达量均高于后者;所有注射质粒的小鼠肝组织中均可检测到HBcAg的表达,且在血清HBV感染标志转阴时均可检测到肝内HBV DNA的存在。注射质粒的HBV基因组长度、剂量以及宿主的遗传背景均对建立乙肝成体转基因小鼠模型有影响,且发现以5μg含1.3倍HBV基因组的转导质粒pCS-HBV1.3注射6周龄C57BL/6小鼠,HBV抗原表达和HBV DNA水平维持时间长,更适合建立HBV持续感染模型。     

血浆microRNA与HIV感染及治疗关系的研究

本次研究分析了Ⅰ型艾滋病病毒(HIV-1)感染者血浆中miRNA表达特点,探讨了血浆miRNA作为HIV-1感染及治疗监测生物学标志物的潜在可行性。选取2017年7月-2018年7月期间在昆明市第三人民医院就诊的HIV-1感染未经抗病毒治疗患者50例作为未治疗组,HIV-1感染经抗病毒治疗患者50例作为治疗组,选取同期本院健康体检者50例作为对照组,应用qPCR技术检测三组对象血浆miR-29a、miR-122,miR-155的相对表达量。结果显示,与健康对照组相比HIV-1感染未经抗病毒治疗组血浆miR-29a、miR-155、miR-122表达均升高,差异有统计学意义(P<0.05);未治疗组与治疗组相比较血浆miR-29a、miR-155和miR-122表达均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。对未治疗组的研究显示,血浆miR-29a、miR-155表达水平与HIV-1RNA病毒载量呈正相关(P<0.05),miR-122与HIV-1RNA病毒载量无显著相关(P>0.05),miR-29a、miR-155表达水平与CD4;T细胞计数呈负相关(P<0.05)。本研究提示HIV-1感染后血浆miRNA有变化,血浆miR-29a、miR-122,miR-155与HIV-1感染相关,可能是HIV-1感染的潜在生物学标志物。而抗病毒治疗可以诱导miR-29a、miR-155和miR-122表达降低,这些miRNA可能具有成为监测HIV-1感染抗病毒治疗效果观察指标的潜在价值。未治疗组血浆miR-29a、miR-155与HIV-1RNA呈正相关,表明其与HIV-1病毒复制相关。     

HBV感染者外周血TLR4mRNA表达与疾病进展关系研究

构建pUCm-TLR4质粒作为定量模板,采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测 140 例HBV感染者外周血单个核细胞(PBMC)中TLR4mRNA的含量,并结合HBV感染者临床情况进行分析.HBV感染者PBMC中TLR4mRNA的表达范围是1.1×105～10.5×107 copy/μg RNA,显著高于健康对照组(4.5×105～1.25×106 copy/μg RNA),其中慢性乙肝组TLR4mRNA的表达明显高于慢性重型乙肝组(P＜0.05);HBV病毒载量的对数值与TLR4mRNA的含量存在负相关(r=-0.316,P＜0.01).结果表明,HBV感染者PBMC中TLR4mRNA的表达与疾病进展明显相关.     

血清VEGF、miR-122、GDF15及TK1在乙肝相关性肝病表达水平及其临床意义

摘要 目的：分析不同类型乙肝相关性肝病患者血清血管内皮生长因子（VEGF）、microRNA-122（miR-122）、生长分化因子15（GDF-15）及胸苷激酶1（TK1）的表达差异变化及其临床意义。方法：随机选取2020年1月-2022年6月在我院消化内科收治的不同类型乙肝相关性肝病患者135例作为研究组。其中根据乙型肝炎诊断标准分为慢性乙型肝炎组（CHB）76例,乙型肝炎肝硬化组（LC）57例,乙型肝炎肝癌组（HCC）78例,选取同时期在本院进行体检的健康受检者96例作为健康组。比较各组的基本资料、检测研究对象血清VEGF、miR-122、GDF15、TK1、HBV DNA载量水平和AFP表达水平。采用Pearson相关性检验分析乙肝相关性肝病患者血清VEGF、miR-122、GDF15及TK1表达水平与HBV DNA载量水平的相关性,采用受试者工作特征曲线（ROC）诊断LC和HCC的价值。结果：CHB 组、LC 组 和HCC组VEGF、TK1表达水平显著高于健康组,差异具有统计学意义（P<0.01）,CHB 组、LC 组 和HCC组组间两两比较,差异具有统计学意义（P<0.01）。CHB 组、LC 组 和HCC组miR-122表达水平显著低于健康组,差异具有统计学意义（P<0.01）,CHB 组、LC 组 和HCC组组间两两比较,差异具有统计学意义（P<0.01）。LC 组 和HCC组GDF15表达水平显著高于 CHB 组和健康组,差异具有统计学意义（P<0.01）,CHB 组和健康组组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。CHB 组、LC 组 和HCC组HBV DNA载量水平显著高于健康组,差异具有统计学意义（P<0.01）,LC 组 和HCC组组间比较,差异无统计学意义（P>0.05）。LC 组 和HCC组AFP表达水平显著高于 CHB 组和健康组,差异具有统计学意义（P<0.01）,LC 组 和HCC组、CHB 组和健康组组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。CHB组、LC+HCC组血清VEGF、miR-122、GDF15及TK1水平与HBV DNA载量水平具有相关性（P<0.01或P<0.05）。血清VEGF、miR-122、GDF15及TK1单独检测诊断LC和HCC的曲线下面积（AUC）为0.695、0.783、0.743及0.7687,四项指标联合检测诊断LC和HCC的AUC为0.839,敏感度为84.21,特异度为83.25。结论：血清VEGF、miR-122、GDF15及TK1在各类型乙肝相关性肝病中表达水平存在差异,血清VEGF、miR-122、GDF15及TK1联合检测诊断LC和HCC具有临床价值。     

乙型肝炎病毒复制水平对原发性肝癌发病的影响

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)复制水平对原发性肝细胞肝癌(HCC)发病的影响.方法:调查226例HCC患者和51例乙型肝炎后肝硬化(LC)患者,分别应用ELISA法和聚合酶链式反应(PCR)检测血清乙型肝炎病毒标志物(HBV-M)和DNA含量.结果:HCC患者中HBsAg阳性率为96.9%;168例HCC患者和51乙型肝炎后LC患者接受HBV DNA定量检测.阳性率分别为85.1%、88.2%,两组患者lg HBV DNA均服从正态分布,HBV DNA的均数为105.49±1.49拷贝/ml、106.15±1.38拷贝/ml,乙型肝炎后LC组患者血清HBV DNA含量较高(P＜0.05);乙型肝炎后LC患者中HBeAg阳性率较HCC组高(P＜0.05);HCC患者血清HBVDNA含量与HBeAg阳性没有明显的相关性(P＞0.05),乙型肝炎后LC患者血清HBV DNA含量与HBeAg阳性密切相关(P＜0.05);两组患者血清HBV DNA含量与性别、年龄、感染HBV的时间等因素均无明显的相关性(均为P＞0.05).结论:我国HCC的发病与HBV感染密切相关,但可能与患者是否存在HBV高水平复制无关.     

CXCL8及其受体的表达在慢性乙肝患者临床诊断中的意义

为了揭示慢性乙肝患者外周血中性粒细胞上CXCL8及其受体CXCR1和CXCR2的表达情况。本研究选取2015年1月至2017年12月在我院确诊并治疗的慢性乙肝患者126例,其中男性78例,女性48例;HBeAg(+)患者51例,HBeAg(-)患者75例,中性粒细胞内的HBV DNA(+)患者48例,HBV DNA(-)患者78例。另外,选取同期我院经病理诊断为肝细胞正常的肝移植供肝者30例作为对照组。检测各组受试者外周血中性粒细胞上的CXCL8、CXCR1和CXCR2的m RNA和蛋白表达。病理G分级为G3~G4的患者的平均CXCL8、CXCR1和CXCR2 mRNA表达水平均显著高于G1~G2患者。病理S分期为S3~S4患者的CXCL8、CXCR1和CXCR2 mRNA表达水平显著高于S0~S2患者。严重程度为重度的患者的CXCL8、CXCR1和CXCR2 mRNA表达水平显著高于轻中度患者。HBeAg(+)患者的CXCL8和CXCR1 mRNA表达水平显著高于HBeAg(-)患者,且HBV DNA(+)患者的CXCL8和CXCR1 m RNA表达水平显著高于HBV DNA(-)患者。研究结果表明,病例组患者的CXCL8、CXCR1和CXCR2蛋白的阳性表达率分别为89.68%、83.33%和58.73%,而健康对照组的为10.00%、23.33%和43.33%。病例组的CXCL8和CXCR1阳性表达率显著高于对照组,而病例组CXCR2蛋白阳性表达率与对照组无显著差异。初步结论表明,CXCL8及其受体CXCR1和CXCR2与患者临床病理分期及疾病严重程度密切相关。监测CXCL8与CXCRl的表达水平对慢性乙肝的早期诊断及肝细胞损伤程度的判断具有重要意义。     

肝癌患者单个核细胞线粒体DNA拷贝数与抗氧化能力的变化

目的:探讨肝癌患者单个核细胞(PBMC)线粒体DNA(mt DNA)拷贝数的变化及其与机体抗氧化能力的关系。方法:用Ficoll Hypaque离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),采用实时荧光定量PCR反应,检测线粒体NADH脱氢酶亚基1(ND1)基因的拷贝数,并以核基因组的β-actin作为内参基因,比较25例肝癌患者与30例健康人外周血单个核细胞中mt DNA拷贝数的差异。流式细胞术检测单个核细胞活性氧(ROS)含量的变化。生化检测法检测血浆中总抗氧化能力(T-AOC)的变化。结果:肝癌组外周血单个核细胞ND1基因拷贝数是健康对照组的73%,表明肝癌患者外周血单个核细胞mt DNA拷贝数明显下降。肝癌组单个核细胞活性氧含量的平均荧光强度为(417.82±110.62),健康对照组为(301.82±75.54),肝癌组单个核细胞活性氧含量显著高于健康对照组(P0.01)。肝癌组血浆总抗氧化能力(单位/毫升血浆)吸光度为(1.30±0.85),健康对照组为(3.20±1.62),肝癌组血浆总抗氧化能力显著低于健康对照组(P0.01)。结论:肝癌患者的外周血单个核细胞线粒体DNA拷贝数减少可能与机体抗氧化水平下降有关。     

高嗜肝性8型重组腺相关病毒体内转导法制备乙型肝炎病毒持续感染小鼠模型

用高嗜肝性的重组8型腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus type8,rAAV8)载体携带1.3拷贝乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)基因组(ayw亚型)体内转导法,建立持续表达HBV抗原的C57BL/6小鼠模型。首先,制备并纯化了携带1.3拷贝HBV基因组(ayw亚型)的重组8型腺相关病毒(rAAV8-1.3HBV);将rAAV8-1.3HBV以剂量2×10e11vg/只注射C57BL/6小鼠(Viralgenome,vg);在不同时间点实施尾静脉采血,采用ELISA方法监测血清中HBsAg和HBeAg的水平及动力学变化;10周后处死小鼠,取血液、肝组织样本,提取基因组DNA,荧光定量PCR检测HBVDNA拷贝数;利用鉴定HBVDNA环化形式的特异性引物进行PCR扩增以检测肝组织中环化的HBVDNA,并检测HBV抗原特异性的免疫组化和肝脏病理变化。结果显示,注射rAAV8-1.3HBV的3只C57BL/6小鼠第1周开始在血液中检测到HBsAg和HBeAg的表达,并持续至第10周均为阳性,其中HBsAg的表达水平经历了一个上升-下降-再上升的过程(注射后第4周时最低,第6周后维持较高水平),而HBeAg表达水平则持续阳性且比较稳定。荧光定量PCR结果显示,3只小鼠10周后血清中HBV DNA的拷贝数分别为4.2×103、3.6×103、2.5×103copies/mL,肝脏中则分别为8.0×106、5.7×106、2.6×106copies/g肝组织。在3只小鼠肝组织中均检测到环化HBV DNA,提示AAV8载体携带的线性HBV DNA成功回复成环化HB VDNA。免疫组化分析显示3只小鼠肝脏中均存在HBsAg和HBcAg表达;体内转染10周后肝脏组织切片的HE染色分析显示未见明显的炎性细胞浸润及组织结构异常。结果表明,本研究利用高嗜肝性重组8型腺相关病毒载体携带1.3拷贝乙型肝炎病毒基因组(ayw亚型)体内转导C57BL/6小鼠,成功地建立了HBV病毒在肝内稳定复制并持续表达HBV抗原的小鼠模型,为进一步研究HBV慢性持续感染的机制与应用于药物以及疫苗评价打下了基础。     

重组8型腺相关病毒介导HBV急性感染树鼩模型建立

目的利用重组8型腺相关病毒介导1.3拷贝HBV基因组（1.3HBV,ayw亚型）在树鼩肝脏表达,建立HBV急性感染树鼩模型。方法通过大腿内侧静脉注射将携带有1.3 HBV的重组8型腺相关病毒（recombi-nant adeno-associated virus 8,rAAV8-1.3HBV）导入树鼩肝脏,通过ELISA检测树鼩血清中HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAb,荧光定量PCR检测树鼩肝脏和血清中HBV DNA,全自动生化分析仪检测血清中ALT水平,并观察感染后肝脏的病变情况。结果 HBV感染主要血清标志物1～2周内均检测阳性;30 d后肝组织仍可检测到病毒抗原阳性细胞;55 d时肝组织HBV DNA拷贝数仍可达到104～105;树鼩血清中HBV DNA拷贝数持续一个月高于正常组;肝组织炎细胞略增多,血清ALT水平持续升高。结论 rAAV8所携带的HBV基因组高效专一导入树鼩肝细胞并复制表达,成功建立HBV急性感染树鼩模型,为进一步探索rAAV8树鼩慢性感染模型打下一定的基础。     

健康人成功接种乙肝疫苗后的细胞免疫应答状态评价

目的:探究健康人成功接种乙肝疫苗后外周血单个核细胞(PBMCs)增殖及其Tbet、GATA-3、Foxp3、RORγt和Bcl-6五种CD4+T淋巴细胞亚群特异性转录因子的表达特征,评价细胞免疫应答状态。方法:本研究共采集64份外周血样本,分别来自43例疫苗免疫[HBs Ab(+)]和21例未疫苗免疫[HBs Ab(-)]的健康人。其中,有部分样本使用HBV重组核心抗原(r HBc Ag)进行诱导培养。通过CCK-8法检测细胞增殖情况;采用荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测五种转录因子的m RNA表达水平。结果:HBs Ab(+)组五种转录因子基础表达水平均高于HBs Ab(-)组,其中GATA-3、Foxp3和R/F比值有显著差异(P0.001)。经r HBc Ag诱导后,HBs Ab(-)组五种转录因子的m RNA表达水平较基础水平均有意义地增加(P0.05);而在HBs Ab(+)组中,则均有不同程度降低,其中GATA-3显著降低(P=0.044);且诱导后HBs Ab(-)组五种转录因子表达水平均高于HBs Ab(+)组(P0.05)。结论:乙肝疫苗免疫成功人群的细胞免疫在基础和体外再次应答水平上与非疫苗免疫健康者均存在明显的差别。     

血清乙肝病毒大蛋白与乙肝前S1抗原联合检测在HBeAg阴性乙肝患者诊断中的意义

目的探讨乙型肝炎e抗原阴性[HBeAg(-)]乙肝患者血清乙肝病毒大蛋白(HBV-LP)和乙肝前S1抗原(PreS1-Ag)联合检测的临床意义。方法采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定300例慢性乙肝患者的血清HBV-LP和PreS1-Ag浓度;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测血清HBV-DNA表达量;比较不同HBV-M模式下HBV-LP、PreS1-Ag与HBV-DNA的阳性检出率;分析以HBV-DNA表达量作为HBV感染及复制的金标准时,血清HBV-LP和PreS1-Ag单独检测及联合检测对HBeAg阴性乙肝患者的阳性预测值和阴性预测值。结果 (1)115例HBeAg(+)血清中,HBV-LP和PreS1-Ag的阳性率均与HBV-DNA阳性率差异无统计学意义(Ps0.05);120例HBeAg(-)HBeAb(+)血清中,HBV-LP阳性率(64.2%)明显高于HBV-DNA阳性率(P0.05),而PreS1-Ag阳性率与HBVDNA阳性率差异无统计学意义(P0.05);65例HBeAg(-)HBeAb(-)血清中,HBV-LP阳性率(72.3%)和PreS1-Ag阳性率(67.7%)均明显高于HBV-DNA阳性率(Ps0.05);(2)以185例HBeAg(-)乙肝患者的HBV-DNA表达量为参考标准,HBV-LP、PreS1-Ag的阳性预测值分别为72.6%、71.6%,阴性预测值分别为93.4%、84.1%;HBV-LP和PreS1-Ag联合检测,HBV-LP/PreS1-Ag双阳性中的HBV-DNA阳性率(66.0%)显著高于HBV-LP/PreS1-Ag双阴性(P0.05)。结论血清HBV-LP和PreS1-Ag水平与HBV-DNA表达量有关,二者联合检测可灵敏地反映HBeAg(-)乙肝患者HBV的复制状态,预测HBV-DNA水平。