谷氨酸棒杆菌中芳香化合物降解的β-酮己二酸途径中原儿茶酸分支关键酶的鉴定

β-酮己二酸途径的原儿茶酸分支在革兰氏阴性细菌中研究较多,但在革兰氏阳性细菌中的研究却很少.本研究表明谷氨酸棒杆菌能以原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草醛和对甲酚作为惟一碳源和能源生长,并且生长时诱导表达原儿茶酸3,4-双加氧酶.对谷氨酸棒杆菌基因组分析表明,基因位点ncg12314～ncg12315可能编码原儿茶酸3,4-双加氧酶.通过PCR反应扩增了ncg12314～ncg12315,并克隆到表达载体pET21a上,获得质粒pET21aP34D;携带pET21aP34D的重组大肠杆菌经诱导表达原儿茶酸3,4-双加氧酶.敲除ncg12314～ncg12315后,谷氨酸棒杆菌突变株失去原儿茶酸3,4-双加氧酶活性,同时丧失了利用原儿茶酸、对甲酚、香草醛和4-羟基苯甲酸作为惟一碳源和能源的能力;通过基因互补,这些能力又可重新获得.这些结果证实ncg12314和ncg12315(pcaHG)编码原儿茶酸3,4-双加氧酶.进一步对谷氨酸棒杆菌基因组分析后鉴定到一个完整的编码原儿茶酸分支途径中相关酶的基因簇,该基因簇的独特组织方式为芳香化合物的降解研究提供了新的视点.     

Burkholderia sp.NCIMB 10467菌株中原儿茶酸3, 4-双加氧酶基因的分子克隆和生化特性研究

NCIMB 10467是一株木质素降解菌,根据其16S rDNA序列将其重新分类为Burkholderia菌属.研究显示,在NCIMB 10467菌株中,不同的底物可以诱导该菌株对于原儿茶酸的多种代谢形式.根据克隆到的一段原儿茶酸邻位开环酶,即原儿茶酸3,4-双加氧酶(P34D;EC 1.13.11.3)α-亚基的保守序列,通过染色体步移的方法,得到一段9505bp的DNA片段.序列分析显示,在这段9.5 kb的DNA片段中,两个可能的开放阅读框pcaG和pcaH分别编码P34D的α-亚基和β-亚基.将pcaGH克隆并在大肠杆菌中进行表达后,可以检测到P34D的活性.而pcaH在NCIMB 10467菌株中的敲除则使该菌完全丧失了代谢原儿茶酸的能力.由此证实,克隆到的pcaGH基因确实编码原儿茶酸3,4-双加氧酶,并且对于NCIMB 10467菌株对原儿茶酸的代谢是必需的.     

Burkholderia sp. NCIMB 10467菌株中原儿茶酸3, 4-双加氧酶基因的分子克隆和生化特性研究（英文稿）

NCIMB 10467是一株木质素降解菌, 根据其16S rDNA序列将其重新分类为Burkholderia菌属。研究显示, 在NCIMB 10467菌株中, 不同的底物可以诱导该菌株对于原儿茶酸的多种代谢形式。根据克隆到的一段原儿茶酸邻位开环酶, 即原儿茶酸3, 4-双加氧酶(P34D; EC 1.13.11.3) a-亚基的保守序列, 通过染色体步移的方法, 得到一段9505 bp的DNA片段。序列分析显示, 在这段9.5 kb的DNA片段中, 两个可能的开放阅读框pcaG 和 pcaH分别编码P34D的a-亚基和b-亚基。将pcaGH克隆并在大肠杆菌中进行表达后, 可以检测到P34D的活性。而pcaH在NCIMB 10467菌株中的敲除则使该菌完全丧失了代谢原儿茶酸的能力。由此证实, 克隆到的pcaGH基因确实编码原儿茶酸3, 4-双加氧酶, 并且对于NCIMB 10467菌株对原儿茶酸的代谢是必需的。     

Burkholderia sp. NCIMB 10467菌株中原儿茶酸3, 4-双加氧酶基因的分子克隆和生化特性研究

NCIMB 10467是一株木质素降解菌, 根据其16S rDNA序列将其重新分类为Burkholderia菌属。研究显示, 在NCIMB 10467菌株中, 不同的底物可以诱导该菌株对于原儿茶酸的多种代谢形式。根据克隆到的一段原儿茶酸邻位开环酶, 即原儿茶酸3, 4-双加氧酶(P34D; EC 1.13.11.3) a-亚基的保守序列, 通过染色体步移的方法, 得到一段9505 bp的DNA片段。序列分析显示, 在这段9.5 kb的DNA片段中, 两个可能的开放阅读框pcaG 和 pcaH分别编码P34D的a-亚基和b-亚基。将pcaGH克隆并在大肠杆菌中进行表达后, 可以检测到P34D的活性。而pcaH在NCIMB 10467菌株中的敲除则使该菌完全丧失了代谢原儿茶酸的能力。由此证实, 克隆到的pcaGH基因确实编码原儿茶酸3, 4-双加氧酶, 并且对于NCIMB 10467菌株对原儿茶酸的代谢是必需的。     

环羟基化双加氧酶α亚基保守序列的克隆及基因定位

利用PCR法成功地克隆了不动杆菌 (Acinetobacter) L2菌株的环羟基化双加氧酶α亚基保守序列310 bp片段,并对其进行测序.序列分析结果表明该片段与3-苯基丙酸盐双加氧酶α亚基、苯1,2-双加氧酶α亚基、甲苯2,3-双加氧酶α亚基的氨基酸序列同源性分别为72%、75%和78%.Southern杂交将菌株L2的环羟基化双加氧酶α亚基基因定位在L2质粒的不同酶切片段上.     

恶臭假单胞菌ND6菌株catA基因的克隆和表达及其儿茶酚裂解途径探讨

恶臭假单胞菌ND6菌株的萘降解质粒pND6-1中编码儿茶酚1,2-双加氧酶的catA基因在大肠杆菌中进行了克隆和表达,并研究表达产物的酶学性质。结果表明:酶的Km为0.019μmol/L,Vmax为1.434μmol/(min.mg);具有很好的耐热性,在50℃保温45min后仍能够保留酶活力的93.7%;Fe2 对酶活性有显著的促进作用,其比活力是对照反应的292%;酶对4-氯儿茶酚的催化活性非常低,属于Ⅰ型儿茶酚1,2-双加氧酶。以萘为底物生长时,ND6菌株的细胞提取液中既存在催化邻位裂解途径的儿茶酚1,2-双加氧酶活性,也存在催化间位裂解途径的儿茶酚2,3-双加氧酶活性。以苯甲酸、对羟基苯甲酸和苯乙酸为唯一碳源生长时,ND6菌株细胞提取液的儿茶酚1,2-双加氧酶活性远远大于儿茶酚2,3-双加氧酶活性。表明ND6菌株既能通过儿茶酚间位裂解途径降解萘,也能通过儿茶酚邻位裂解途径降解萘,而以苯甲酸、对羟基苯甲酸和苯乙酸为诱导物时只利用儿茶酚邻位裂解途径。     

恶臭假单胞菌ND6菌株catA基因的克隆和表达及其儿茶酚裂解途径探讨

恶臭假单胞菌ND6菌株的萘降解质粒pND6-1中编码儿茶酚1,2-双加氧酶的catA基因在大肠杆菌中进行了克隆和表达,并研究表达产物的酶学性质。结果表明:酶的K_m为0.019μmol/L,V_max为1.434μmol/(min.mg);具有很好的耐热性,在50℃保温45min后仍能够保留酶活力的93.7%;Fe²⁺对酶活性有显著的促进作用,其比活力是对照反应的292%;酶对4-氯儿茶酚的催化活性非常低,属于Ⅰ型儿茶酚1,2-双加氧酶。以萘为底物生长时,ND6菌株的细胞提取液中既存在催化邻位裂解途径的儿茶酚1,2-双加氧酶活性,也存在催化间位裂解途径的儿茶酚2,3-双加氧酶活性。以苯甲酸、对羟基苯甲酸和苯乙酸为唯一碳源生长时,ND6菌株细胞提取液的儿茶酚1,2-双加氧酶活性远远大于儿茶酚2,3-双加氧酶活性。表明ND6菌株既能通过儿茶酚间位裂解途径降解萘,也能通过儿茶酚邻位裂解途径降解萘,而以苯甲酸、对羟基苯甲酸和苯乙酸为诱导物时只利用儿茶酚邻位裂解途径。     

Pseudonomas sp.W2双酚A代谢途径的研究

利用气相色谱质谱联用技术(GC-MS)、液相色谱紫外检测技术(LC-UV)和基因比对分析对Pseudonomassp.W 2菌株双酚A(Bpa)代谢途径进行了初步研究,发现对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酮,为中间代谢产物;并发现该菌株具有原儿茶酸双加氧酶基因(pcaG)。     

嗜盐古菌Haloferax volcanii WFD11中龙胆酸1,2-双加氧酶HagA的研究

【目的】研究嗜盐古菌Haloferax volcanii WFD11菌株以不同芳香酸作为碳源的生长情况;鉴定其通过龙胆酸途径代谢芳香酸过程中的开环酶龙胆酸1,2-双加氧酶的基因,并对其进行生化水平的研究;初步揭示古菌和细菌代谢芳香酸的可能差异。【方法】分别以4 mmol/L的6种不同芳香酸为唯一碳源培养菌株WFD11,利用全自动生长曲线分析仪测定菌株生长情况并绘制生长曲线;利用高效液相色谱检测菌株WFD11代谢3-羟基苯甲酸的中间产物;对菌株WFD11的基因组进行生物信息学分析,寻找潜在的龙胆酸1,2-双加氧酶编码基因,并在Haloferax volcanii H1424中异源表达;通过快速纯化系统(采用Ni2+-NTA亲和层析柱)纯化异源表达的蛋白,以龙胆酸为底物通过紫外分光光度计检测粗酶液和纯化后的龙胆酸1,2-双加氧酶和相关酶学特性;通过实时定量PCR观察hag A的表达类型。【结果】菌株WFD11能以4 mmol/L的3-羟基苯甲酸和3-羟基苯丙酸为唯一碳源和能源生长;高效液相色谱检测证明菌株WFD11通过龙胆酸代谢3-羟基苯甲酸(3HBA);克隆和异源表达了龙胆酸1,2-双加氧酶基因hag A;Hag A粗酶液和纯化蛋白均具龙胆酸1,2-双加氧酶的活性,催化龙胆酸开环生成顺丁二酸单酰丙酮酸;Hag A的龙胆酸1,2-双加氧酶比活力为0.024 8 U/mg,且其活性不依赖于Fe2+;荧光定量PCR实验结果证明hag A是组成型表达。【结论】嗜盐古菌H.volcanii WFD11可能是通过龙胆酸途径代谢芳香酸类物质,为进一步研究古菌和细菌代谢芳香酸的可能差异打下了基础。     

三氯卡班降解菌株Sphingomonas sp. YL-JM2C中多个邻苯二酚双加氧酶的功能

【目的】研究Sphingomonas sp.YL-JM2C菌株的生长特性,确定以三氯卡班作为碳源的生长情况。挖掘菌株YL-JM2C潜在的邻苯二酚1,2-双加氧酶及邻苯二酚2,3-双加氧酶基因,在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达邻苯二酚双加氧酶基因并研究其酶学性质。【方法】优化S.sp.YL-JM2C菌株以三氯卡班作为碳源时的培养条件,并利用全自动生长曲线测定仪测定菌株生长情况,绘制生长曲线。通过生物信息学方法挖掘潜在的邻苯二酚双加氧酶基因,并分别在Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达,通过AKTA快速纯化系统纯化蛋白,分别以邻苯二酚、3-和4-氯邻苯二酚为底物检测重组蛋白的酶学特性。【结果】菌株在pH为7.0-7.5时生长最优。在以浓度为4-8 mg/L的三氯卡班做为底物时,菌株适宜生长。当R2A培养基仅含有0.01%酵母提取物和无机盐时,加入终浓度为4 mg/L的三氯卡班可促进菌株生长。挖掘到6个潜在的邻苯二酚双加氧酶基因stcA1、stcA2、stcA3、stcE1、stcE2和stcE3,表达并通过粗酶液分析证明其中5个基因stcA1、stcA2、stcA3、stcE1和stcE2编码的酶均具有邻苯二酚双加氧酶和氯邻苯二酚双加氧酶的活性;纯化酶的底物范围研究揭示了StcA1、StcA2和StcA3均属于Ⅱ型邻苯二酚1,2-双加氧酶,StcE1和StcE2为两个新型邻苯二酚2,3-双加氧酶;它们酶动力学分析研究证明了5个酶对邻苯二酚的亲和力和催化效率最高,4-氯邻苯二酚次之。【结论】在同一菌株中发现了5个具有功能的邻苯二酚双加氧酶基因,stcA1、stcA2和stcA3编码的酶均属于Ⅱ型邻苯二酚1,2-双加氧酶,stcE1和stcE2为两个新型邻苯二酚2,3-双加氧酶编码基因。5个酶均具有催化邻苯二酚和氯邻苯二酚开环反应的功能,这为更好地理解微生物基因组内代谢邻苯二酚及其衍生物氯代邻苯二酚基因的多样性奠定了基础。     

以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸整合型重组钝齿棒杆菌的构建

[目的]为了构建一株直接利用廉价的葡萄糖合成γ-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌,将来自于植物乳杆菌γ-氨基丁酸合成途径的关键酶谷氨酸脱羧酶基因(lpgad)在产谷氨酸菌株钝齿棒杆菌中进行整合表达,实现葡萄糖到GABA的一步法生产.[方法]运用PCR技术扩增得到带有tac启动子的谷氨酸脱羧酶基因tacgad.通过重叠PCR的方法获得钝齿棒杆菌精氨酸合成途径关键酶N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)基因内部缺失型基因△argB.利用自杀载体pK18mobsacB构建同源整合载体pK18-△argB::tacgad,以△argB的上下游序列为同源臂,通过两次同源重组将tacgad基因整合到钝齿棒杆菌基因组,同时将NAGK基因argB灭活,利用蔗糖致死基因sacB反向筛选标记筛选得到谷氨酸脱羧酶的重组钝齿棒杆菌C.crenatum △argB::tacgad.重组钝齿棒杆菌以葡萄糖为底物进行发酵,测定GABA含量.[结果]重组菌C.crenatum △argB::tacgad成功表达谷氨酸脱羧酶,同时阻断了精氨酸合成途径对谷氨酸到GABA代谢途径的竞争,粗酶液基本检测不到NAGK活性,发酵液无精氨酸合成.通过96 h发酵,重组菌可积累约8.28 g/L的GABA.[结论]本研究通过将谷氨酸脱羧酶基因定向整合到钝齿棒杆菌精氨酸合成途径的关键酶基因argB内部,成功表达谷氨酸脱羧酶的同时阻断竞争途径精氨酸的合成.本研究为实现直接利用葡萄糖合成GABA的一步法生产奠定了基础.     

赖氨酸-尸胺反向转运蛋白cadB基因谷氨酸棒杆菌表达载体的构建及转化

旨在提高谷氨酸棒杆菌合成尸胺的能力,将CadB克隆至谷氨酸棒杆菌中,与LDC共表达,在谷氨酸棒杆菌合成尸胺的同时,帮助尸胺转运至细胞外,解除尸胺的反馈抑制作用。谷氨酸棒杆菌能够高产赖氨酸脱羧酶的底物L-赖氨酸,但不含ldc和cadB基因,因而不能够直接合成尸胺。从E.coliK12中克隆出赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因,与绿色荧光蛋白基因gfp融合构建成融合表达载体pXBG,并转化至谷氨酸棒杆菌进行诱导表达,结果表明表达的CadB蛋白可以正确的定位于谷氨酸棒杆菌的细胞膜上。将基因cadB连接到含有赖氨酸脱羧酶基因的pXMJ19-ldc上,构建成能够共表达赖氨酸脱羧酶和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白的重组质粒pXLB,并转化到谷氨酸棒杆菌中。     

深海多环芳烃降解菌新鞘氨醇杆菌H25的降解特性及降解基因

[目的]为了从深海环境中筛选新的多环芳烃降解菌,了解其降解基因及降解特性.[方法]以原油作为碳源从印度洋深海海水样品中富集筛选出降解能力较强的多环芳烃降解菌,并根据已报道的相关菌属的多环芳烃起始双加氧酶大亚基序列及侧翼序列设计兼并引物进行扩增.[结果]获得了1株能够高效降解原油、柴油及多种多环芳烃的菌株H25.经16S rDNA序列系统发育分析表明它属于新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)(96%).并从该菌株中扩增获得2条相似度为91.0%双加氧酶基因片段.2条序列在NCBI上Blastn分析表明均与菌株N.aromaticivorans DSM12444T的降解质粒pNL1上的双加氧酶大亚基具有最高相似度,分别为99.6%和91.0%.根据pNL1上的双加氧酶序列设计引物获得了包含H25双加氧酶大亚基及上下游序列的2个基因片段H25 Ⅰ(2.9kb)和H25Ⅱ(4.5kb).另外,单碳降解实验表明H25对联苯、2-甲基萘、2,6-二甲基萘、菲、二苯并噻吩、二苯并呋喃等均有较好的降解能力.[结论]H25菌株是Novosphingobium属可能的新种.深海细菌在大洋环境多环芳烃污染的自然净化中起到一定作用,并在环境生物修复中有较大的应用前景.     

木糖异构酶基因xylA表达载体构建

以大肠埃希菌MG1655的基因组为模板,通过PCR扩增获得木糖异构酶基因xylA。利用敲除编码对基因转录起负调控作用的lacIq基因的大肠埃希菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pEC-XK99E,酶连后转化大肠埃希菌BL21和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。成功构建出了具有大肠埃希菌BL21表达活性的木糖异构酶表达载体pEC(lacI-)-xylA。     

嗜吡啶红球菌R04的联苯降解途径的研究

通过GC-MS测定出嗜吡啶红球菌R04菌降解联苯的中间代谢物2,3-二氢二羟基联苯、2,3-二羟基联苯和苯甲酸,并测定了该菌的2,3-二羟基联苯双加氧酶、2-羟基-6-酮基-6-苯基-2,3-己二烯酸(HOPDA)水解酶和苯甲酸双加氧酶活性。最终确定了R04菌降解联苯的途径为2,3-二羟基联苯双加氧酶途径。     

谷氨酸棒杆菌中选择性σ因子的研究进展

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种重要的工业微生物,其基因组中包含编码RNA聚合酶的7种sigma(σ)因子基因,除σA外,其余6种属于选择性σ因子。通过σ因子进行基因表达调控是细菌调控网络中的重要组成部分,因此研究σ因子的功能和调控机制将有助于完善谷氨酸棒杆菌基因调控网络,进而有利于工业生产中菌种优化策略的制定。本文主要对谷氨酸棒杆菌中6种选择性σ因子的功能和调控机制做一综述,并且讨论了在研究选择性σ因子调控功能中需要注意的实验设计问题。最后探讨了选择性σ因子在实际应用中的价值及未来需要深入研究的方向,以期能够为谷氨酸棒杆菌调控网络的进一步完善以及选择性σ因子研究的规范化提供一些参考。     

谷氨酸棒杆菌1dh基因的敲除

谷氨酸棒杆菌中ldh基因编码乳酸脱氢酶,可催化丙酮酸转化生成乳酸.利用重叠延伸PCR的方法,获得中间缺失部分序列的dldh基因片段,将其与载体pk 18mobsacB连接,转化大肠杆菌感受态,筛选出阳性转化子后,转化谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞.分别在卡那霉素抗性平板及10％蔗糖平板上进行两次筛选,利用PCR方法鉴定,成功获得ldh基因缺失的谷氨酸棒杆菌突变株ATCC 13032-(4)ldh.应用荧光定量PCR检测,ATCC 13032-(z)ldh中的ldh基因在转录水平与野生型菌株ATCC 13032相比,相对表达量为O.ldh基因的敲除对菌株的生长造成了一定的影响.     

谷氨酸棒杆菌metX、dapA基因敲除对苏氨酸合成的影响

谷氨酸棒杆菌中metX基因编码蛋氨酸合成途径关键酶高丝氨酸乙酰转移酶,dapA基因编码赖氨酸合成途径关键酶二氢吡啶二羧酸合成酶。为研究这两个基因缺失对苏氨酸积累的影响,以谷氨酸棒杆菌R102(AHVr)为出发菌株,通过重叠延伸PCR及同源重组技术分别构建了metX、dapA单基因缺失突变株R102ΔmetX、R102ΔdapA以及双基因缺失的突变株R102ΔmetXΔdapA。对出发菌以及上述3株重组菌进行初步摇瓶发酵试验,用HPLC法测定发酵液中苏氨酸含量。结果表明,发酵72 h后,3株重组菌的苏氨酸产量分别为2.58、2.38和3.01 g/L,比原始菌株分别提高了42.5%、31.5%和66.3%。     

反馈抑制不敏感邻氨基苯甲酸合成酶基因作为筛选标记基因用于大豆遗传转化研究

目前广泛采用的抗菌素或抗除草剂基因作为植物转化筛选标记基因可能带来转基因逃逸 ,因此寻找能够用于植物转化的来源于植物本身的筛选基因是解决这一问题的方法之一。通过从烟草中克隆的邻氨基苯甲酸合成酶基因 (ASA2 )作为筛选标记基因 ,并采用氨基酸的类似物 5-甲基色氨酸为筛选剂 ,进行了农杆菌介导的大豆成熟胚尖转化研究。Southern杂交结果表明ASA2基因成功整合到大豆基因组 ,Northern杂交也显示该基因在转化大豆叶片中表达。HPLC检测转化大豆叶片游离色氨酸的含量比野生型要高 5 9%～ 12 3%。PCR检测转化子 1代结果显示转化基因通过孟德尔规律稳定遗传。这些结果表明反馈抑制不敏感ASA2基因可以作为筛选标记基因用于大豆遗传转化。同时也证实来源于一种植物 (烟草 )编码的邻氨基苯甲酸α 亚基能够与另一种植物 (大豆 )编码该酶的 β 亚基结合形成具有完整活性的邻氨基苯甲酸合成酶。对ASA2基因作为一种新的植物转化筛选标记基因的优缺点进行了讨论     

洋葱伯克霍尔德氏菌L68双加氧酶区基因克隆及序列分析

克隆洋葱伯克霍尔德氏菌L68双加氧酶区基因并对其进行序列分析。采用邻苯二酚喷洒方法从洋葱伯克霍尔德氏菌L68的基因文库中筛选到了1株含有双加氧酶区基因的重组子,其重组质粒命名为pB2k。重组质粒pB2k含有8030bp的L68基因片断,经BLAST比对,该片断含有11个与已报道的ORF相近的ORF。在该片断的5’端,ORF1和ORF2分别编码两个转移酶基因,tomA1t、omA2t、omA3和tomA4编码酚羟化酶组份,tomA5编码氧化还原酶,phnT编码铁氧还蛋白,phnE编码邻苯二酚2,3-双加氧酶,ORF3编码未知功能蛋白,phnG编码部分2-羟粘糠酸半醛脱氢酶。