荞麦糊粉层和子叶中贮藏蛋白质积累过程的超微结构

应用透射电镜技术对荞麦(Fagopyrum esculentum)子叶和糊粉层细胞中贮藏蛋白质的积累过程进行了研究.荞麦开花后15天,胚乳最外层细胞的液泡中开始积累蛋白质.开花后25天,最外层胚乳细胞中积累较多的糊粉粒(直径1-2μm)形成糊粉层.开花后20天,子叶细胞中蛋白质开始在液泡和细胞质中积累,同时液泡通过膜的向内生长和缢裂两种方式形成体积较小的液泡.开花后25天,成熟的子叶细胞中含有丰富的蛋白质,贮藏蛋白质主要积累在液泡中形成体积较大的蛋白质贮藏液泡(PSVs,protein storage vacuoles,直径1-3μm).在荞麦子叶积累蛋白质的各个阶段,细胞质中都有一些来源于高尔基体、含蛋白质的电子不透明小泡(直径0.1-0 7μm)存在,观察到有些小泡正进入液泡,推断这种来自于高尔基体膜囊的小泡不仅有将蛋白质运输到液泡形成PSVs的作用,也可能是荞麦成熟子叶积累贮藏蛋白质的一种结构.     

基于NIRS法快速检测荞麦蛋白质与淀粉含量的研究

为建立近红外光谱技术测定荞麦蛋白质与淀粉含量的方法,本研究以217份荞麦样品为试验材料,采用最小二乘回归预测和交叉验证构建近红外预测模型。分析表明:前处理采用多元散射校正法(MSC),维数(Rank)分别为5和5,光谱区间6803.9~6094.2/cm所建立的荞麦蛋白质与淀粉含量模型的预测效果较好,其决定系数(R~2)分别为0.9481和0.9167,交叉验证均方根(RMSECV)分别为0.68和2.08,相对分析误差(RPD)分别为4.39和3.46,均大于3.0,外部验证相关系数均大于0.96。本试验所建立的蛋白质与淀粉含量近红外预测模型具有较高的准确度和稳健性,可用于荞麦品质的快速测定。     

荞麦糊粉层和子叶中贮藏蛋白质积累过程的超微结构

应用透射电镜技术对荞麦（Fagopyrum esculentum)子叶和糊粉层细胞中贮藏蛋白质的积累过程进行了研究。荞麦开花后15天,胚乳最外细胞的液泡中开始积累蛋白质。开花后25天,最外层胚乳细胞中积累较多的糊粉粒（直径1－2μm)形成糊粉层。开花后20天,子叶细胞中蛋白质开始在液泡和细胞质中积累,同时液泡通过膜的向内生长和缢裂两种方式形成体积较小的液泡。开花后25天,成熟的子叶细胞中含有丰富的蛋白质,贮藏蛋白质主要积累在液泡中形成体积较大的蛋白质贮藏液泡（PSVs,protein storage vacuoles,直径1－3μm）。在荞麦子叶积累蛋白质的各个阶段,细胞质中都有一些来源于高尔基体,含蛋白质的电子不透明小泡（直径0.1-0.7μm)存在,观察到有些小泡正进入液泡,推断这种来自高尔基体膜囊的小泡不仅将蛋白质运输到液泡形成PSVs的作用,也可能是荞麦成熟子叶积累贮藏蛋白质的一种结构。     

荞麦子叶发育过程中聚合的粗糙内质网

在荞麦（Fagopyrum esculentum Moench.）子叶的发育过程中观察到粗糙内质网的聚合现象,是一些粗糙内质网平行或成环形排列形成的。这些聚合的粗糙内质网附近通常有蛋白质团块存在,其形状不规则,无膜包被,与周围细胞质的界限不清。推测这些蛋白质团块不是在液泡或膨大的粗糙内质网囊泡中积累形成的,而是由聚合的粗糙内质网直接将合成的蛋白质分泌到细胞质中形成的。这种形式提高了子叶中贮存蛋白质的积累效率。     

韩发现养麦种子蛋白酶抑制剂具有抗人T-急性成淋巴细胞白血病细胞系的抑制活性

Applied Biochemistry and Biotechnology2004年117卷2期65～74页报道：已知马铃薯抑制剂Ⅰ族成员荞麦蛋白酶抑制剂BWT1可抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶,而与豌豆球蛋白族同源的新的蛋白酶抑制剂荞麦蛋白酶抑制剂BWI-2a,则只能抑制胰蛋白酶。     

荞麦胰蛋白酶抑制剂的原核表达及纯化

根据文献报道的荞麦胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列及本研究室先前已获得的部分基因序列设计引物,经过RT-PCR扩增,获得荞麦胰蛋白酶抑制剂编码区基因全序列.将该基因克隆到原核表达载体pQE-31中,并转化至大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达获得可溶性目的蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的25%.该目的蛋白经Ni2 -NTA柱亲和纯化,SDS-PAGE分析显示,在大约9kD处出现明显的目的条带,与预计蛋白分子量大小一致.Western blot鉴定证实,目的蛋白N端带有6个组氨酸标签.活性测定表明,目的蛋白具有专一性的胰蛋白酶抑制剂活性,抑制活性约为77U/mg纯化蛋白.本实验为进一步研究荞麦胰蛋白酶抑制剂结构与功能的关系奠定了基础.     

野生型和突变型荞麦蛋白酶抑制剂的活性比较及抗肿瘤功能分析

运用定点突变技术研究重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)的作用位点,先后构建了R45A-aBTI 和R45F-fBTI 两个突变体．抑制活性测定显示,aBTI 和fBTI 均丧失了胰蛋白酶抑制活性,却分别增加了对弹性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制活性,确定Arg⁴⁵为野生型rBTI 的作用位点．稳定性分析表明,rBTI、aBTI 和fBTI 均具有很高的热稳定性及酸碱稳定性．采用MTT 比色法分别检测野生型和突变型抑制剂对肿瘤细胞生长的抑制作用．结果表明,突变前后的3种抑制剂对HL-60 和EC9706 细胞的生长均显示出很强的抑制作用,并且具有明显的浓度依赖性和时间依赖性．通过研究不仅确定了rBTI 的作用位点,而且获得了两种新型蛋白酶抑制剂,且作用位点的改变并不影响其对肿瘤细胞的生长抑制作用．为进一步研究胰蛋白酶抑制剂的结构与功能的关系以及抗肿瘤药物的研制提供了新的思路．     

荞麦与大豆叶片中草酸含量差异及其可能的原因

用1/5浓度Hoagland营养液培养荞麦和大豆幼苗l0 d后,荞麦叶片、根及其分泌物中的草酸含量均明显高于大豆,说明荞麦叶片的草酸形成能力强.荞麦叶片中存在少量的草酸氧化酶活性,而大豆中未检测到该酶活性,表明荞麦具有一定的降解草酸的能力.乙醇酸氧化酶(GO)催化乙醇酸氧化的活性两种植物之间虽差异不明显,但该酶催化乙醛酸氧化的活性荞麦显著高于大豆.荞麦GO对乙醛酸的Km值明显低于大豆GO,同时其乙醛酸含量也较高,因此其叶片中由乙醛酸形成草酸的速率应高于大豆.由此认为,由乙醛酸氧化生成草酸可能是植物草酸合成限速步骤之一,其反应速率高低可能导致不同种类植物叶片中草酸含量的差异.     

蛋白质表面氨基酸特性研究进展

分布在蛋白质分子表面的暴露于溶剂的氨基酸所具有的一些特性对蛋白质的折叠和聚合过程、蛋白质一蛋白质相互作用以及蛋白质的功能具有重要影响。本文分析了蛋白质表面氨基酸在疏水性、保守性、静电势及结构方面的一些特性,阐述了近年来国际上利用这些特性对蛋白质一蛋白质相互作用界面进行预测的方法,最后介绍了几款预测蛋白质表面氨基酸的软件。     

蛋白质表面氨基酸特性研究进展

分布在蛋白质分子表面的暴露于溶剂的氨基酸所具有的一些特性对蛋白质的折叠和聚合过程、蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质的功能具有重要影响。本文分析了蛋白质表面氨基酸在疏水性、保守性、静电势及结构方面的一些特性,阐述了近年来国际上利用这些特性对蛋白质-蛋白质相互作用界面进行预测的方法,最后介绍了几款预测蛋白质表面氨基酸的软件。     

蛋白酶抑制剂反应环区的结构研究

蛋白质分子表面环区常在蛋白质功能和行为中起重要作用.我们对一些丝氨酸蛋白酶抑制剂的反应环区和已知的限制性水解部位做了结构比较研究.研究结果表明,蛋白质抑制剂反应部位所处的环区具有独特的结构,使其能够对相应蛋白酶发挥很高的抑制作用.     

中华鲟生长激素受体的分子克隆和功能分析

为研究生长激素对中华鲟生长的调控机制,克隆了中华鲟生长激素受体cDNA.csGHRcDNA的可读框编码了611个氨基酸残基的跨膜蛋白质,含有GHR的所有特征结构域.序列对比发现其他种属GHR中高度保守的氨基酸残基在csGHR中发生了替换.我们利用CHO细胞分析了csGHR的生物功能和csGHR分子中高度保守性氨基酸残基替换的生物意义.csGHR稳定表达细胞中共转染的受丝氨酸蛋白酶抑制剂2.1（Spi1.2）启动子驱动的荧光素酶报告基因受海鲤生长激素（seabream GH,sbGH）诱导表达,并且sbGH诱导稳定表达细胞显著增殖.csGHR稳定表达细胞培养液中检测到中华鲟生长激素结合蛋白质,并且csGHBP的生成需要金属蛋白酶活性的参与.csGHR配体结合域的Asp突变为Glu显著提高csGHR介导的上述生物活性,而Asp突变为Ala则明显降低csGHR的生物活性.这些结果表明,克隆的csGHR具有完全生物功能,并且csGHBP可能通过csGHR蛋白酶解而生成.这些发现将有助于全面了解中华鲟生长调控机制.     

蛋白酶及其抑制剂关键活性位点研究进展

蛋白酶广泛存在于生物体中,参与分解蛋白质,维持生物体正常的生命活动。蛋白酶抑制剂通过与蛋白酶活性位点结合调控靶蛋白酶活性,从而影响蛋白质代谢。蛋白酶及其抑制剂关键氨基酸的突变,可以影响其生理功能、稳定性、催化活性、抑制特异性等。通过挖掘自然界蛋白酶及其抑制剂的各种突变体,分析它们的关键活性位点,并运用蛋白质工程手段改造和设计活性更强、稳定性更高、特异性更好、环境更友好、成本更低的蛋白酶及其抑制剂,已成为当前的热点研究之一。文中对近年来蛋白酶及其抑制剂关键活性位点研究进行了简要综述,以期深化人们对蛋白酶及其抑制剂活性作用机制的认识,并为蛋白酶及其抑制剂的生物学活性改造研究提供理论参考。     

荞麦籽粒结构的观察与分析

从荞麦籽粒的和分析中可以看出,荞麦的果皮和种皮容易分开,种子中心巨大的“Ｓ”形胚芽、胚根以及糊粉层虹适量科贮藏蛋白质存在的主要场所。在“Ｓ”形胚芽和胚根两侧是荞麦的两片叶子,由淀粉贮藏细胞组成。该细胞呈长方多棱体,细胞壁极薄且透明,人淀粉粒呈多面球形,大小均匀整齐,淀粉粒间结合紧密、严实,具有一定的几何构形。在淀粉粒间未发现基质蛋白质。     

响应面法优化荞麦胰蛋白酶抑制剂固定化条件

目的:以大肠杆菌表达的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂为原材料,研究其固定化方法及条件。方法:以0.2%聚乙烯醇-3%海藻酸钠溶液为载体,CaCl2为固定剂,用物理包埋法对荞麦胰蛋白酶抑制剂进行固定化;在CaCl2浓度、载体与抑制剂体积比以及固定化时间3个单因素基础上,利用响应面法对荞麦胰蛋白酶抑制剂固定化的影响因素进行优化。结果:建立了响应面法优化固定荞麦胰蛋白酶抑制剂的模型,经优化后得到如下最佳固定化条件:CaCl2浓度为5.5%,载体与抑制剂体积比为1.6∶1,固定化时间为31min。在此条件下实际测得固定化抑制剂抑制率为72.4%,而模型预测此条件下的抑制率为74.3%,实测值与理论值相差很小。结论:所建模型拟合程度较高,用该模型优化荞麦胰蛋白酶抑制剂固定化的工艺条件参数准确可信,可为进一步开发胰蛋白酶的应用提供重要参考。     

荞麦与大豆叶片乙醇酸氧化酶的纯化和性质比较研究

分别从荞麦与大豆叶片中部分纯化了乙醇酸氧化酶 (GO ,EC1 .1 .3 .1 ) ,并研究其部分性质。结果显示荞麦与大豆叶片中GO的催化特性有明显差异 :大豆叶片中GO对乙醇酸Km值为 0 .3 1mmol/L ,对乙醛酸Km值为 1 .98mmol/L。外源草酸对GO氧化乙醇酸活性影响很小 ,但对其氧化乙醛酸活性抑制明显 ,5mmol/L草酸可抑制 44%。而荞麦叶片中GO性质有所不同 :GO对乙醇酸Km为 0 .46mmol/L ,对乙醛酸Km为 0 .85mmol/L。草酸对荞麦GO氧化乙醇酸活性影响也很小 ,对其氧化乙醛酸活性的抑制作用明显小于大豆 ,5mmol/L草酸只抑制 2 4%。上述研究结果表明 ,荞麦GO对乙醛酸的亲和力明显强于大豆 ,并且草酸对其GO氧化乙醛酸活性影响较小。因此相对于大豆而言 ,GO可能在荞麦叶片草酸合成中起重要作用。     

甜荞胰蛋白酶抑制剂cDNA片段的克隆及序列特征

采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等方法从甜荞中纯化出荞麦胰蛋白酶抑制剂(buckwheat trypsm inhibitor,BTI),经活性鉴定该抑制剂属丝氨酸类蛋白酶抑制剂家族。为了获得BTI的基因序列,并弄清其在体内的表达调控机制,应用RTPCR和3’-RACE等方法,直接体外扩增该抑制剂基因,首次获得总长为361bp的DNA片段(GenBank登录号为AY335158),并命名为BTI-W1。该片段包括一个183bp的开放阅读框,编码61个氨基酸。由该基因推导的氨基酸序列与已报道的荞麦胰蛋白酶抑制剂BTI-2的氨基酸序列的同源性达100％。BTI-WI基因的获得,对于深入开展荞麦胰蛋白酶抑制剂结构与功能关系的研究具有重要意义,也为荞麦植物资源的开发利用建立了前期研究基础。     

应用于二维电泳细胞蛋白质样品提取的复合蛋白酶抑制剂的优化

阿维链霉菌在复合培养基中生长时合成大量蛋白酶以满足菌体分解有机氮源进行生长代谢的需要。而大量蛋白酶的存在对二维电泳的蛋白质组分析细胞蛋白质样品的提取带来了很大的困难。根据阿维链霉菌胞内蛋白酶的组成,以EDTA、PMSF、Bestatin、Pepstatin和E-64等5种蛋白酶抑制剂为基础,通过单因子实验和正交实验优化得到了高效的蛋白酶抑制剂复合配方。验证实验表明,该复合蛋白酶抑制剂在阿维链霉菌细胞蛋白质样品提取中,具有良好的蛋白酶活性抑制效果。     

蛋白质-蛋白质相互作用及其抑制剂研究进展

蛋白质-蛋白质相互作用在细胞活动和生命过程中扮演着非常重要的角色。基因调节、免疫应答、信号转导、细胞组装等等都离不开蛋白质-蛋白质的相互作用。近几年,靶向蛋白质-蛋白质相互作用及其抑制剂研究也逐渐成为研究的热点;但是蛋白质复合物相互作用界面的一些特点和性质,如相互作用界面较大、结合界面较为平坦等,使蛋白质-蛋白质相互作用及其抑制剂研究充满了挑战。本文主要总结了蛋白质-蛋白质相互作用界面的一些性质和特点,分析了界面特性与其抑制剂设计的关系,并讨论了蛋白质-蛋白质相互作用的理论预测方法及其抑制剂的类型和特点,最后又通过实例说明了如何进行蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂的设计。     

荞麦属2个野生荞麦种的染色体核型研究

对荞麦属皱叶野荞麦(Fagopyrum crispatifolium J.L.Liu)及其近缘种细柄野荞麦[F.gracilipes (Hemsl.) Dam.et Diels]的染色体核型进行了分析.结果表明,2个野生荞麦的染色体数目均为2n=4x=32,但二者在随体数目、染色体长度等方面差异明显,染色体核型不同,皱叶野荞麦的核型公式为:30m(4SAT)+2sm,细柄野荞麦的核型公式为:32m,属首次报道.