茶树CsCIGR基因克隆及表达特性分析

该研究以茶树基因组数据库为基础,采用RT-PCR技术,从茶树‘龙井43’中克隆得到基因CsCIGR。序列分析显示,CsCIGR基因开放阅读框长度为1 677 bp,编码588个氨基酸。进化分析表明,CsCIGR属于GRAS家族的PAT1亚家族。多序列比对显示,茶树CsCIGR蛋白与其他植物的GRAS蛋白氨基酸序列具有很高的相似性。氨基酸理化性质分析显示,CsCIGR转录因子属于亲水性蛋白。亚细胞定位预测显示,CsCIGR可能位于细胞核中。启动子预测分析发现,CsCIGR启动子区域包含胁迫响应元件(STRE)、干旱应答元件(MYC)、厌氧诱导元件(ARE)等多种与逆境响应相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析结果显示,CsCIGR基因在低温(4℃)、高温(38℃)、干旱(200 g·L~(-1) PEG)、高盐(200 mmol·L~(-1) NaCl)胁迫下均能诱导表达,且对高盐,低温和高温胁迫响应更为明显,推测CsCIGR基因在茶树响应逆境胁迫中发挥重要作用。该研究为茶树抗性育种筛选基因提供了重要理论依据。     

甘薯盐胁迫响应基因IbMYB3的表达特征及生物信息学分析

MYB转录因子具有多种生物学功能,在植物响应生物和非生物胁迫中发挥重要作用。该文从盐胁迫后的甘薯(Ipomoeabatatas)水培苗转录组数据(RNA-seq)中筛选出2个受盐胁迫显著上调表达的MYB基因,分别命名为IbMYB3和IbMYB4。多种非生物胁迫和植物生长物质处理下的基因表达分析显示, IbMYB3受逆境诱导显著上调表达,暗示其可能参与甘薯非生物胁迫响应。生物信息学分析表明,IbMYB3开放阅读框长度为1059bp,编码353个氨基酸残基,蛋白分子量为39.41kDa,理论等电点(PI)为5.26,为酸性带负电的亲水性蛋白。亚细胞定位结果表明,IbMYB3蛋白定位于细胞核,具有较强的转录激活活性。上述结果表明, IbMYB3转录因子可能在甘薯非生物胁迫响应过程中发挥重要调控作用,研究结果为进一步探明IbMYB3基因的功能奠定了基础。     

甘薯盐胁迫响应基因IbMYB3的表达特征及生物信息学分析

MYB转录因子具有多种生物学功能,在植物响应生物和非生物胁迫中发挥重要作用。该文从盐胁迫后的甘薯(Ipomoea batatas)水培苗转录组数据(RNA-seq)中筛选出2个受盐胁迫显著上调表达的MYB基因,分别命名为IbMYB3和IbMYB4。多种非生物胁迫和植物生长物质处理下的基因表达分析显示,IbMYB3受逆境诱导显著上调表达,暗示其可能参与甘薯非生物胁迫响应。生物信息学分析表明,IbMYB3开放阅读框长度为1059 bp,编码353个氨基酸残基,蛋白分子量为39.41 kDa,理论等电点(PI)为5.26,为酸性带负电的亲水性蛋白。亚细胞定位结果表明,IbMYB3蛋白定位于细胞核,具有较强的转录激活活性。上述结果表明,IbMYB3转录因子可能在甘薯非生物胁迫响应过程中发挥重要调控作用,研究结果为进一步探明IbMYB3基因的功能奠定了基础。     

白番红花CrCBF1基因的克隆及功能分析

该研究选取新疆地区耐寒植物白番红花为研究材料,采用RT-PCR方法,从白番红花中克隆得到白番红花CBF1的全长cDNA序列,命名为CrCBF1(GenBank登录号MF681787)。结果表明,CrCBF1基因完整开放阅读框ORF长642bp,编码213个氨基酸,分子量为23.8kD,理论等电点为4.99,具有CBF家族典型的AP2保守结构域;亚细胞定位分析显示,CrCBF1基因编码的蛋白定位于细胞核;酵母自激活分析显示,CrCBF1转录因子具有转录激活活性;酵母功能验证分析显示,过表达CrCBF1基因可以明显提高酵母的抗寒性。     

胡萝卜低温胁迫转录因子DcICE1基因克隆与非生物逆境响应分析

植物ICE1基因是调控CBF基因表达的上游调控因子,在植物抵抗逆境胁迫中具有重要的作用。该实验以2个胡萝卜品种‘黑田五寸’和‘君川红’为实验材料,分别克隆出DcICE1转录因子基因,并通过荧光定量PCR方法测定了4种不同逆境胁迫下(4℃低温、38℃高温、0.2mol·L-1 NaCl及200g·L-1 PEG)DcICE1基因的表达情况,探讨DcICE1转录因子在植物抵抗非生物胁迫下的功能。序列分析显示,该基因全长1 458bp,编码485个氨基酸。2个胡萝卜品种的DcICE1基因在核苷酸水平上有2个位点的差异,分别为第139位的G/A和第475位的A/G,导致编码的氨基酸在第47位的E/K和第159位的N/D差异,该差异可能与DcICE1转录因子在2个不同品种应对逆境胁迫下的响应不同有关。胡萝卜DcICE1转录因子有一个保守的ICE1功能结构域。实时定量PCR检测DcICE1基因在不同逆境胁迫下的响应表明,低温(4℃)处理能明显地诱导DcICE1基因的表达,但盐(0.2mol·L-1 NaCl)和干旱(200g·L-1 PEG)处理下的诱导效果均不明显。     

紫花苜蓿NAC转录因子MsNAC1基因的克隆、生物信息学分析及非生物逆境胁迫下的表达分析

NAC转录因子是高等植物所特有的具有多种生物功能的转录因子,在植物生长发育、抵抗逆境和激素调节等过程中发挥着重要作用。本研究利用RACE-PCR技术,克隆获得了紫花苜蓿NAC转录因子Ms NAC1(Gen Bank登录号为JN099384.1)基因的c DNA序列。生物信息学分析显示,Ms NAC1基因的开放阅读框(ORF)为993 bp,编码一个由330个氨基酸残基组成的亲水性蛋白,N-端具有保守的NAM结构域,C-端高度变异,具备NAC转录因子的基本特征;Ms NAC1蛋白被定位在细胞核中,含有2条核定位信号序列,具有9个糖基化位点和23个磷酸化位点,三级结构为对称的同型二聚体。多重比对发现,Ms NAC1蛋白与拟南芥ATAF1和水稻Os NAC6蛋白的同源性较高;系统进化分析表明,Ms NAC1蛋白属于NAC转录因子家族中的ATAF亚族,与ATAF1的亲缘关系最近。非生物逆境胁迫下的表达分析显示,Ms NAC1基因在高盐、干旱和低温胁迫下表达量均呈现先上调后下调的趋势,不同处理时间的差异达到极显著水平,并且根中的表达量上调幅度高于叶片,说明该基因可能参与调控非生物逆境胁迫的生理响应。     

巴西橡胶树HbNAC24基因克隆和表达分析

该研究以巴西橡胶树为实验材料,从橡胶树胶乳cDNA中克隆了NAC转录因子基因(HbNAC24)完整开放阅读框(ORF),并通过酵母实验和实时荧光定量PCR技术,进行转录激活活性分析和表达分析。结果显示:(1)HbNAC24基因ORF为1 167bp,编码388个氨基酸,在N端第7~174氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域。(2)酵母实验表明,HbNAC24具有转录激活活性,转录激活区在高度变异C端,具备了NAC转录因子的基本特征。(3)序列比对和系统进化分析表明,HbNAC24蛋白属于NAC转录因子家族中的TIP亚族。(4)实时荧光定量PCR分析结果发现,HbNAC24基因在叶中的表达量显著高于其他部位;割胶和茉莉酸(JA)处理均能够诱导HbNAC24表达上调。研究认为,HbNAC24基因可能参与植物的生长发育和胁迫应答过程。     

高山离子芥CBF/DREB1转录因子基因的分离与表达

以冷胁迫和脱水处理的高山离子芥幼叶为材料,采用RT-PCR技术获得1条新的C重复/脱水应答元件结合因子(CBF/DREB1)基因(CbCBF,登录号AY994127).该基因含651 bp的开放阅读框(ORF),编码216个氨基酸的蛋白质,预测该蛋白具有一个AP2 DAN结合域,一个核定位信号和碳端酸性激活域.多序列比对结果表明,CbCBF蛋白与拟南芥及其他植物CBF具有较高的相似性.Northern杂交结果显示,CbCBF基因不能被冷处理诱导表达,但可被脱水和ABA处理快速诱导;同时发现CbCBF基因也能被紫外辐射和机械刺激诱导表达.表明高山离子芥CbCBF基因可能参与应答多种非生物胁迫过程.     

梅花CBF转录因子的克隆及表达

根据GenBank中与梅花同属的桃、甜樱桃等已发表CBFs转录因子序列设计简并引物,采用PCR和RT-PCR方法,从梅花基因组DNA和cDNA中克隆CBF转录因子片段。结果表明,两种途径获得的CBF基因序列一致,基因全长821bp,编码238个氨基酸,其氨基酸序列具有典型的CBF蛋白特征,包含保守的AP2/EREB DNA结合结构域及CBF家族蛋白特征短多肽序列(PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR)。氨基酸相似性分析结果表明,该基因与欧洲甜樱桃、矮扁桃等CBF转录因子相似性较高。相对荧光定量PCR结果显示,4℃低温胁迫下,其表达量符合CBF转录因子表达特点,随着胁迫时间的增长表达量呈上升趋势,8h时达峰值,说明该基因在低温胁迫下上调表达。     

百子莲ApSPI基因原核表达及其重组菌的抗逆性研究

丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine Protease Inhibitor,SPI)通过抑制靶蛋白活性参与调节内源蛋白平衡,并在植物发育、防御机制中发挥重要作用。该研究利用RACE技术克隆获得百子莲(Agapanthus praecox ssp.orientalis)ApSPI基因全长序列,构建了E.coli Transetta(pET-32a-ApSPI)重组菌株,并检测重组菌株在不同非生物胁迫下的耐受性。结果显示:(1)ApSPI基因全长为652 bp,开放阅读框为366 bp,编码122个氨基酸。(2)ApSPI蛋白含有一个N端信号肽和一个典型的Kazal结构域,是一种Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂。重组蛋白最佳诱导温度为37℃,诱导时间6 h,IPTG浓度为0.1 mmol·L~(-1),且主要以可溶性形式存在。(3)重组菌非生物胁迫耐受性研究发现,重组菌Transetta(pET-32a-ApSPI)对NaCl(200～400 mmol·L~(-1))、KCl(200～400 mmol·L~(-1))和PEG6000(5%)的耐受性明显高于对照菌株Transetta(pET-32a)。研究表明,过表达ApSPI蛋白增强了大肠杆菌对盐、干旱胁迫的抗性,为进一步研究ApSPI在植物抗逆中的作用奠定了基础。     

茶树CsCBF1基因克隆和转录活性分析

采用RACE技术克隆了一个受冷诱导的茶树CBF基因全长cDNA,命名为CsCBF1(GenBank登录号为EU563238)。CsCBF1cDNA全长序列为1 211bp,开放阅读框编码259个氨基酸。氨基酸序列分析表明,CsCBF1具有CBF家族典型的保守结构域,与其他植物的CBF具有较高的相似性;与拟南芥、辣椒和橡胶树编码的CBF相似性分别为56%、63%和56%。亚细胞定位结果表明,CsCBF1位于细胞核内。分别将10个CsCBF1缺失突变体与GAL4DNA结合域融合的结果显示,CsCBF1的羧基末端酸性结构域(第137位氨基酸至259位氨基酸)在酵母中具有转录激活活性。实时定量RT-PCR分析表明,CsCBF1基因受低温的快速诱导表达。     

小黑杨PnGRAS47基因克隆及氮素诱导下的表达模式分析

GRAS转录因子是一种植物特有且广泛分布的转录因子,参与调控植物生长发育及在植物响应环境胁迫中发挥重要的功能。本研究通过克隆小黑杨(Populus simonii×P.nigra)Pn GRAS47基因序列,分析其基因及蛋白序列的基本特征;通过实时定量PCR技术检测在不同形态和不同浓度的氮素处理下小黑杨Pn GRAS47基因的组织表达模式。研究结果显示:Pn GRAS47基因全长1 528 bp,编码452个氨基酸。Pn GRAS47蛋白分子质量为50 812.19 Da,理论等电点为5.41,为不稳定蛋白,不存在信号肽,有2段跨膜区域。氨态氮(NH_4~+-N)和硝态氮(NO_3~--N)处理下,小黑杨Pn GRAS47基因呈现组织特异性表达。0.1和10 mmol·L~(-1) NO_3~--N诱导了Pn GRAS47基因在叶和根中的表达,0.1和10 mmol·L~(-1)的NH_4~+-N处理诱导了Pn GRAS47基因在叶和茎中的表达,但抑制了其在根中表达。因此,小黑杨Pn GRAS47基因受不同氮素的诱导,在不同组织中存在差异,GRAS基因可能在小黑杨对氮素的吸收与利用中发挥作用。     

线果芥CpNSP5基因的克隆及表达分析

以该实验室前期从线果芥(Conringia planisiliqua L.)中通过mRNA差异显示技术筛选到的414bp干旱响应相关核心片段为基础,采用RACE技术对该片段进行全长克隆,序列比对分析发现,该片段与拟南芥的AtNSP5基因相似性较高,命名为CpNSP5。CpNSP5基因全长1 228bp,开放阅读框966bp,编码321个氨基酸。推测蛋白分子量为35.034 5kD,等电点为5.41。蛋白二级结构预测包含26个β-折叠,具有典型的Kelch repeat结构。系统进化分析发现,CpNSP5与白菜亲缘关系最近。实时荧光定量PCR检测发现,CpNSP5基因在20%PEG-6000和200mmol·L~(-1) NaCl胁迫下均受到不同程度诱导,说明CpNSP5基因可能与线果芥响应逆境胁迫有关。该研究结果为作物的抗旱育种提供了候选基因。     

海岛棉GbCBF6基因克隆及其在逆境胁迫下的表达分析

该研究根据棉花生物信息数据库,采用PCR方法从棉花(Gossypium barbadense L.)中克隆了1个CBF/DREB转录因子基因,命名为GbCBF6(GenBank登录号为KR233255)。GbCBF6基因开放阅读框为753bp,编码251个氨基酸,预测分子量为27.82kD,等电点为7.68。氨基酸多重序列比对结果表明,GbCBF6基因编码的蛋白与其他植物冷胁迫相关的CBF蛋白具有高度的同源性,含有1个AP2功能结构域和2个特征序列基序;与棉花已经克隆的4个GhCBF基因的氨基酸序列差异较大,是1个新的棉花CBF基因。系统进化树分析表明,GbCBF6基因属于DREB亚家族中的A-1亚组。RT-PCR分析表明,GbCBF6基因表达受干旱胁迫下调,而受4℃低温上调,在高盐(200mmol/L NaCl)处理下其表达量先下降,后增加。推测GbCBF6基因在棉花非生物胁迫的调控中起重要作用。     

扁桃CBF1转录因子的克隆及原核表达分析

为了探明CBF转录因子在扁桃中的抗寒分子机理,以新疆栽培扁桃‘矮丰’叶片为材料,通过PCR技术从扁桃基因组DNA中获得CBF1转录因子,命名为AF-Pd CBF1,Gen Bank登录号为KM245570。序列分析表明,该基因开放阅读框为729bp,编码242个氨基酸,推测蛋白质分子量为27.405 k D,并且该蛋白没有信号肽。进化树分析表明,AF-Pd CBF1与甜樱桃和中国梅的亲缘关系最近。将该基因片段连接到原核表达载体p ET-32a(+)中,构建融合表达质粒p ET-Pd CBF1,转化到E.coli Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期大小一致,分子量大小约为47.8 k D。对重组蛋白的诱导条件进行优化后结果表明,重组蛋白p ET-Pd CBF1在IPTG浓度为0.2 mmol/L、诱导4 h时,其表达量最佳。试验结果可为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定基础。     

盐穗木HcDmc1基因的克隆和表达分析

根据盐穗木盐胁迫下响应的转录组测序结果,克隆获得盐穗木DNA损伤修复基因的cDNA序列,其开放阅读框1 035bp,编码344个氨基酸,命名为HcDmc1。保守结构域分析显示,该基因编码的蛋白具有RecA蛋白家族典型的保守结构域;统进化树分析显示HcDmc1为独立的分支;亚细胞定位于细胞质,为无信号肽、不跨膜的稳定亲水性蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,盐穗木在100mmol/L NaCl胁迫7d后,同化枝中HcDmc1基因表达迅速上调并达到最大值,约为对照组的6.58倍;在700mmol/L NaCl胁迫14d后根中HcDmc1基因表达最高,约为对照的1.79倍。研究表明,HcDmc1基因表达受盐胁迫诱导。     

拟南芥非生物胁迫应答基因表达的调节子研究概况

分子生物学研究表明,植物中由诸如干旱、高盐和低温等环境胁迫因子诱导的几个基因具有多种功能。大多数干旱应答基因是由植物激素脱落酸（ABA）诱导的,但也有少数基因例外。对模式植物拟南芥基因表达中的干旱应答基因的分析表明,至少存在4个独立调节系统（调节子）。对典型胁迫诱导表达的一些基因中启动子的顺势作用元件和影响这些基因表达的转录子也已进行了分析。已经分离出与脱水效应元件/C重复序列（DRE/CRT）顺势作用元件结合的转录因子,并命名为DRE结合蛋白1/C重复序列结合因子（DREB1/CBF）和DRE结合蛋白2（DREB2）。在转基因拟南芥植株中,DREB1/CBF过量表达可增加其抗寒、抗旱和抗盐碱的能力。DREB1/CBF基因已成功地在许多不同作物中得到应用,从而提高作物对非生物胁迫的耐受性。与胁迫反应相关的其他转录因子的研究也正在取得进展。     

茶树CsGIF1基因的克隆及其对非生物胁迫的响应分析

GRF-INTERACTING FACTOR(GIF)基因是植物叶发育相关的一类重要调控因子,调节植物叶器官的发育。该研究采用RT-PCR方法从茶树‘龙井43’的叶片cDNA中克隆得到CsGIF1基因,并利用荧光定量PCR分析了高温(38℃)、低温(4℃)、干旱(200g·L-1 PEG)、盐胁迫(200mmol·L-1 NaCl)下CsGIF1基因的表达水平,以明确CsGIF1基因对非生物胁迫的应答特性,为茶树CsGIF1基因的逆境调控以及功能研究奠定基础。结果表明:(1)CsGIF1基因长666bp,编码221个氨基酸,具有高度保守的SNH结构域;CsGIF1蛋白为亲水性蛋白,理论相对分子质量为23 380,理论等电点为6.30;酸性氨基酸、碱性氨基酸、芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸所占比例分别为7%、9%、5%和13%;蛋白质二级结构显示,茶树CsGIF1蛋白由38.01%的α-螺旋、10.41%的β-折叠、12.22%的延伸主链和39.37%的随机卷曲组成。(2)qRT-PCR分析显示,茶树CsGIF1基因对于4种非生物胁迫均有响应,但不同处理响应不同。其中在胁迫2h时,高温和低温胁迫下,CsGIF1基因相对表达量显著增加,分别为对照的3.54和5.69倍,且高低温胁迫下,CsGIF1基因响应明显大于干旱和盐胁迫。在高温、低温、干旱、盐等不同胁迫处理下,茶树‘龙井43’中CsGIF1基因的表达水平与对照相比均差异明显。     

新疆野苹果AP2/ERF转录因子家族鉴定与响应腐烂病的表达分析北大核心CSCD

AP2/ERF转录因子家族参与了植物生长发育、抵抗胁迫以及植物激素响应等诸多生物过程,是植物中最重要的转录因子家族之一。该研究基于腐烂病菌侵染后的新疆野苹果(Malus sieversii)全长转录组,使用AP2保守结构域的隐马可夫模型PF00847,鉴定新疆野苹果的AP2/ERF家族成员。利用MEGA6、NCBI CDD-batch、MEME、EXPASY、BUSCA对MsAP2/ERF家族成员进行鉴定、分类和结构分析、理化性质和亚细胞定位分析。通过RNA-seq数据和qRT-PCR实验对差异表达的MsAP2/ERFs基因的表达水平进行分析和验证,旨在鉴定新疆野苹果中潜在具有腐烂病抗性的AP2/ERF家族基因资源。结果显示:(1)在新疆野苹果中共鉴定获得106个AP2/ERF基因,涵盖全部AP2(17个)、ERF(57个)、DREB(25个)、RAV(5个)和Soloist(2个)5个亚家族。(2)进一步的细化分类发现MsERF亚家族包括B1-B6 6个组,而MsDREB亚家族中只有A2、A4、A5、A6共4个组,缺少A1和A3组的基因成员。(3)RNA-seq表达模式分析结果表明,29个MsAP2/ERF基因在腐烂病感染过程中差异表达,其中MsERF亚家族中差异表达基因数量最多(19个)。(4)12个MsAP2/ERF代表基因的qRT-PCR结果表明:8个ERF亚家族基因均受腐烂病病菌诱导显著上调表达,其中B4类ERF成员基因(MsERF40)在腐烂病病菌侵染后5 d表达量上调表达倍数最高;4个MsDREB基因中,3个受到腐烂病病原菌诱导显著上调,1个下调表达;此外,含有TIR保守结构域的MsERF05在腐烂病病菌侵染1 d后上调表达69倍,表明ERF亚家族的MsERF40和MsERF05在新疆野苹果抗腐烂病过程中发挥重要作用。该研究结果为新疆野苹果AP2/ERF基因响应腐烂病的功能和机理研究奠定了基础。     

稻瘟菌诱导的水稻 WRKY 基因OsWRKY52 的分离和鉴定

WRKY 蛋白参与植物对生物或非生物胁迫反应和一些发育、代谢过程,在植物中组成一个转录因子大家族 . 从水稻 cDNA 文库中分离到一个新的 WRKY 基因——— OsWRKY52 cDNA ,包括一个 1 719 bp 的开放读码框,推测编码一个由 572 个氨基酸组成的蛋白质,与燕麦 (Avena sativa) AsWRKY1 具有 54 ％的氨基酸一致性 . 该基因被非亲和性稻瘟菌快速诱导 . 凝胶阻滞实验结果表明,原核表达的 OsWRKY52 能与水稻 PR1a 启动子上的 W 盒元件特异结合 . 采用酵母单杂交体系的方法证明了 OsWRKY52 具有转录激活活性 , 其丝氨酸岛、苏氨酸岛和 C 端的富酸性氨基酸区是负责转录激活的区域 . 这些结果提示 OsWRKY52 作为一个转录激活子,可能参与植物对稻瘟菌的应答反应 .