抑制RANKL诱导破骨细胞分化的DNA适配子的筛选

目的:筛选能高特异性、高亲和力结合RANKL蛋白并有效抑制RANKL对破骨细胞诱导分化作用的DNA适配子。方法:首先,采用原核系统表达并纯化RANKL蛋白,通过SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential)技术从人工合成的单链随机寡核苷酸文库中筛选能高特异性、高亲和力结合RANKL蛋白的DNA适配子。然后,用RNAfolding sever software分析适配子空间结构,以ELISA检测DNA适配子和RANKL亲和力大小并筛选出亲和力最高的一组DNA适配子用以验证DNA适配子对RANKL诱导破骨细胞分化的抑制作用。结果:(1)成功在原核系统表达并纯化RANKL蛋白;(2)筛选出能高特异性、高亲和力结合RANKL蛋白的12个DNA适配子。(3)与对照组相比,不同浓度DNA适配子能明显抑制TRAP阳性破骨细胞数量(P0.05),且浓度越高抑制效果越明显。结论:成功筛选出的DNA适配子能特异性结合RANKL蛋白并有效抑制RANKL对破骨细胞的诱导分化功能。     

与细胞因子特异结合的寡聚核苷酸适配子及其在诊断和治疗中的应用

寡聚核苷酸适配子（Aptamer）是用指数富集式配基系统进化方法（SELEX）筛选出的寡聚核苷酸,它能与靶分子特异性结合,具有识别和抑制靶物质生物学活性的作用。将体外筛选到的寡聚核苷酸适配子作为在动物或人体内应用的药剂,还需要进行化学修饰来提高它的生物利用度和在血浆中的稳定性。2氟、2′烷氧基或2′氨基修饰可以提高适配子的稳定性,使适配子的体外半衰期延长;5′端交联一个高分子量的PEG分子或脂质体分子,可以使它的血浆清除率由1小时提高到几小时至1天。修饰后仍保持生物学活性的适配子可用于治疗相应靶细胞因子引起的疾病。目前,国内外已经筛选到了十几种细胞因子的适配子,其中血管内皮生长因子已经用于临床疾病的治疗。除了用于临床治疗外,适配子还可以用于细胞因子的诊断,凡是涉及抗体的诊断领域,几乎都可以用寡聚核苷酸适配子代替。应用大规模机械化筛选技术,可以在短期内筛选到大量的高特异性、高亲和力适配子,这将有力推动临床诊断和治疗的发展。     

体外筛选炭疽芽孢适配子

用SELEX技术 ,寻获炭疽芽孢适配子 ,研究其亲和功能及是否作为炭疽芽孢的检测分子。化学合成长度为 35mer的随机DNA库 ,以炭疽杆菌疫苗株A .16R芽孢为靶标进行 18轮的筛选 ,筛选产物克隆、测序 ,利用生物素 亲和素 辣根过氧化物酶显色系统判断适配子与芽孢的结合活性 ;计算机软件分析测序适配子保守序列和二级结构 ;以兔抗炭疽芽孢抗体为捕获分子 ,适配子为检测分子混合夹心法检测炭疽芽孢。第 18轮筛选的适配子与芽孢结合后A值比第 1轮的提高了 3733 .33 %以上 ;测序 79个序列中 ,A值最高为 1.2 0 ,最低为 0 .2 0 ;混合夹心法检测表明 ,适配子量为 16 μg ,芽孢为 4× 10 7个时 ,显色信号强度最强。结果提示 ,其 5′端茎环及发夹结构是与芽孢结合的基础 ,远程高级结构对其结合功能有一定的影响 ;寡核苷酸适配子可以作为炭疽芽孢的检测分子     

抗体-适配子混合夹心法检测炭疽芽孢杆菌芽孢的研究

通过SELEX(SystemEvolutionofLigandsbyEXponentialenrichment)体外筛选技术寻获的能与炭疽芽孢杆菌芽孢特异结合的DNA适配子(aptamer)考察其作为检测分子的能力。利用抗体-适配子混合夹心法,根据显色反应强度,评价适配子检测炭疽芽孢杆菌芽孢的能力。结果表明,适配子可以作为检测分子检测靶物质的存在。适配子检测范围在2-16μg,芽孢的检测范围在4×104-4×107,当适配子16μg,芽孢量为4×107显色的指示强度最强。说明适配子作为检测用分子,具有潜在的实用价值。     

应用核酸适配子检测细胞因子的新方法-ELONA法

以人肿瘤坏死因子 (Humantumornecrosisfactor,hTNF α)特异性的核酸适配子为检测分子建立了酶联寡聚核苷酸吸附试验 (Enzyme linkedOligonucleotideassay ,ELONA)方法 ,用于hTNF α的检测。通过SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)方法从随机RNA库中筛选到与hTNF-α特异结合的RNA适配子。根据其序列 ,用体外转录方法合成生物素标记的RNA适配子 ,并对其进行了氨基修饰以增加其稳定性。以hTNF-α的单克隆抗体为捕获分子 ,生物素标记的hTNF-α特异性RNA适配子为检测分子建立了ELONA方法 ,并对这种检测方法的灵敏度、精密度和准确度等进行了分析。同时用ELONA和ELISA方法检测了正常人血清中的hTNF-α水平 ,并对检测结果进行比较。结果显示 ,ELONA方法的灵敏度为 100pg/mL ,具有较好的精密度和准确度。ELONA法的检测结果与ELISA法检测结果基本一致。该方法适用于血清、细胞培养上清等多种生物标本中各种细胞因子及其它蛋白的检测。     

应用核酸适配子检测细胞因子的新方法—ELONA法

以人肿瘤坏死因子(Human tumor necrosis factor,hTNF—α)特异性的核酸适配子为检测分子建立了酶联寡聚核苷酸吸附试验(Enzyme—linked Oligonucleotide assay,ELONA)方法,用于hTNF—α的检测。通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)方法从随机RNA库中筛选到与hTNF—α特异结合的RNA适配子。根据其序列,用体外转录方法合成生物素标记的RNA适配子,并对其进行了氨基修饰以增加其稳定性。以hTNF—α的单克隆抗体为捕获分子,生物素标记的hTNF—α特异性RNA适配子为检测分子建立了ELONA方法,并对这种检测方法的灵敏度、精密度和准确度等进行了分析。同时用ELONA和ELISA方法检测了正常人血清中的hTNF—α水平,并对检测结果进行比较。结果显示,ELONA方法的灵敏度为100pg／mL,具有较好的精密度和准确度。ELONA法的检测结果与ELISA法检测结果基本一致。该方法适用于血清、细胞培养上清等多种生物标本中各种细胞因子及其它蛋白的检测。     

SELEX技术筛选纤维蛋白适配子的研究

目的:用纤维蛋白作为靶物质对ss DNA随机序列文库进行筛选,旨在获得高亲和力的纤维蛋白适配子。方法:在体外人工合成长度为99个核苷酸的ss DNA随机序列文库,文库中间区域为63个核苷酸的随机序列,两端为18个核苷酸的固定的引物序列;然后以羧基磁珠为介质包被纤维蛋白,利用指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)对ss DNA随机序列文库进行反复筛选,当结合率不再提高时对筛选出的适配子进行连接、转化及测序分析。结果:羧基磁珠成功地包被了纤维蛋白,包被效率为87.65%,经15轮逐步递增压力的筛选,获得了纤维蛋白适配子群,经测序分析比对发现适配子有很好的多样性。结论:应用SELEX技术初步筛选出了亲和力较高的纤维蛋白适配子群,为下一步的鉴定及功能研究奠定了良好基础。     

SELEX技术筛选变形链球菌UA159适配子可行性的研究

目的:研究SELEX技术用于筛选口腔致龋菌适配子的可行性。方法:化学合成长度为35mer的随机ssDNA文库,利用SE-LEX技术,分别以变形链球菌UA159(以下简称变链UA159)、乳杆菌和离心管作为靶物质,筛选适配子,不对称PCR扩增筛选产物,所得适配子进行克隆、测序,分析其二级结构,并对其二级结构进行了初步分析。结果:显示各个靶物质的筛选产物在第二轮筛选时就已经表现出具有特征性的二级结构。结论:SELEX技术可以用于口腔致龋菌适配子的筛选。     

大鼠成骨细胞特异单链DNA适配体的筛选与鉴定

目的:筛选能特异识别大鼠成骨细胞的单链DNA(ssDNA)适配体并对其进行鉴定。方法:利用完整细胞为靶标的消减细胞SELEX技术筛选大鼠成骨细胞特异ssDNA适配体,通过荧光显微镜、流式细胞术、基因克隆测序、MEME在线软件和RNA structure分析软件,分析适配体的一、二级结构,并对筛选得到的适配体进行鉴定。结果:经过6轮消减细胞SELEX筛选,荧光显微镜鉴定文库已富集;通过流式细胞术检测及测序分析,得到2条适配体L54和L66与大鼠成骨细胞特异结合,其平衡解离常数分别为494.4±133.3和511.4±160.7 nmol/L。结论:筛选获得特异识别大鼠成骨细胞的ssDNA适配体。     

SELEX技术及近年研究进展

指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)是近20年来出现的一种新型体外筛选技术。该技术将文库技术与筛选技术相结合,从核酸文库中筛选出的一段核酸分子:配基-适配子(aptamer);适配子与抗体类似,可以与相应靶物质特异性结合。SELEX技术筛选适配子的技术有快速的进步,而适配子也被应用到医学生物学等各个方面。在HIV等病毒学研究与治疗方面,SELEX的应用也有了可观的进展,多种病毒的相关适配子被筛选出来,为病毒相关疾病的防治提供了新的方向。本文主要就近三年来的SELEX技术发展状况及在应用上的发展进行简要综述。     

Vasorin蛋白特异单链DNA适配体的筛选与鉴定

目的:筛选能特异识别vasorin(VASN)蛋白的单链DNA(ss DNA)适配体并对其进行鉴定。方法:利用SPRSELEX技术筛选VASN蛋白特异ss DNA适配体,通过基因克隆测序、MEME在线软件和RNA structure软件分析富集文库序列并挑选出候选适配体序列,利用EMSA、ELISA、流式细胞术对候选适配体进行特异性与亲和力鉴定。结果:经过5轮SELEX筛选,获得了与VASN蛋白特异结合的ss DNA适配体富集文库,合成候选适配体,经EMSA和ELISA检测分析,证实适配体V4-2能与VASN蛋白特异结合,而不与无关对照牛血清白蛋白结合,其平衡解离常数为281.3±103.7 nmol/L;流式细胞术证实V4-2能够特异识别高表达VASN蛋白的Hep G2细胞。结论:筛选获得特异识别VASN蛋白的ss DNA适配体V4-2。     

利用大肠杆菌鞭毛展示的随机肽库筛选TNF—α拮抗须

TNF－α是一种在机体抗感染,抗肿瘤过程中发挥重要作用的细胞因子,其对机体具有保护和损伤两方面的作用,为了探讨新的抑制TNF－α所致炎症损伤等反应的手段,构建了细菌鞭毛递呈的随机肽库,利用构建得到的肽库,进行TNF－α特异性结合肽的筛选工作。经过5轮筛选及DNA测序,共得到6条小肽编码序列。其中2条序列中含有－V－－N－WG的相同序列框架。进行6条序列与TNF－α结合力的确证后,选择了其中的4条肽序列进行人工化学合成,纯化及鉴定。利用L929细胞及MTT法对4条小肽进行活性测定,检测其对TNF－α的抑制活性。结果表明,在TNF－α对L929细胞毒性为30％左右,含同源序列框架的2条肽可抑制90％左右的TNF－α活性。     

α-鹅膏[蕈]毒环肽核酸适配体的筛选和结构分析

α-鹅膏[蕈]毒环肽(α-amanitin)是从致命鹅膏毒伞子实体中分离的多肽物质。本文采用配体指数富集系统进化(systemic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术,以α-鹅膏[蕈]毒环肽为靶蛋白,以亲和填料epoxy-activated sepharose 6B为筛选介质,从体外合成的随机单链DNA文库中筛选其核酸适配体。经过12轮筛选,将第12轮筛选产物克隆测序,对获得的12条核酸适配体进行分析。二级结构预测分析表明,茎环和口袋结构为主要的结构形式,提示其可能是核酸适配体与α-鹅膏[蕈]毒环肽特异性结合的基础。对得到的核酸适配体进行特异性和灵敏度检测,其中E06核酸适配体的特异性最好,为核酸适配体检测蘑菇中α-鹅膏[蕈]毒环肽的残留奠定了基础。     

核酸适配体筛选的改良与优化策略

核酸适配体以其类似抗体的功能及诸多优于抗体的特点引起人们的广泛关注,如何利用指数富集的配基系统进化技术(SELEX技术)来高效地筛选核酸适配体是其应用的关键。结合近些年核酸适配体的研究进展,为提高筛选效率及核酸适配体性能,针对适配体筛选三大不同环节所做的尝试及改良进行相关的阐述,包括初始随机寡核苷酸文库的设计与修饰、筛选过程所用方法及次级文库的制备、筛选过程后(Post-SELEX)核酸适配体性能的优化等;特别比较了筛选方法包括毛细管电泳SELEX、细胞SELEX、磁珠SELEX、加尾SELEX、微流控SELEX、微阵列SELEX和高通量SELEX,以及次级文库的制备方法诸如不对称PCR法、λ核酸外切酶法、磁珠法、不等长PCR法、综合性方法等;对核酸适配体发展面临的问题及发展前景进行探讨,以期为相关科研人员的研究提供参考。     

靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖1的DNA适配体筛选

目的:筛选获得特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)的单链DNA适配体。方法:合成全长81 nt,中间含39个随机序列的单链寡核苷酸(ss DNA)文库,运用指数富集配基系统进化(SELEX)技术筛选获得GPC1适配体;酶联免疫吸附分析法(ELISA)实验确定候选适配体与GPC1蛋白的亲和力,流式细胞术确定候选适配体与2种GPC1高表达细胞系(胰腺癌Panc-1细胞和工具细胞Luc-ZR-75-1~(GPC1))的结合特异性。结果:经过10轮SELEX筛选获得#9适配体,ELISA分析其亲和力为44±0.69 nmol/L,流式细胞术结果表明其与胰腺癌Panc-1细胞和Luc-ZR-75-1~(GPC1)细胞的阳性结合率分别为44.69%和51.44%。结论:筛选获得与GPC1蛋白有较高亲和力、与表达GPC1细胞系特异结合的ss DNA适配体。     

SELEX法体外筛选胃癌细胞适配子方法的建立

目的:建立SELEX技术筛选胃癌细胞SGC-7901适配子的方法,并初步鉴定获得的SGC-790 1细胞适配子.方法:体外合成全长88bp中间含52bp随机序列的ssDNA文库 ,通过优化PCR扩 增条件,利用地高辛-抗地高辛抗体-碱性磷酸酶系统测定亲和力,经SELEX反复筛选获得胃 癌SGC-7901细胞的特异性适配子.将最后一轮筛选产物克隆、测序并用相关软件分析适配子 序列的一级结构和二级结构.结果:经12轮SELEX筛选,ssDNA文库与SGC- 7901细胞的亲和力由0.16上升至1.14,表明特异性适配子得到逐步富集.22个克隆子测序, 有4个序列完全一致,二级结构预测茎环可能是适配子与胃癌细胞作用的结构基础.结论:成功建立了SELEX技术体外筛选胃癌细胞SGC-7901高亲和性适配子的方法.     

利用大肠杆菌鞭毛展示的随机肽库筛选TNF-α拮抗肽

TNF-α是一种在机体抗感染、抗肿瘤过程中发挥重要作用的细胞因子,其对机体具有保护和损伤两方面的作用,为了探讨新的抑制TNF-α所致炎症损伤等反应的手段,构建了细菌鞭毛递呈的随机肽库,利用构建得到的肽库,进行TNF-α特异性结合肽的筛选工作。经过5轮筛选及DNA测序,共得到6条小肽编码序列。其中2条序列中含有一V-N-WG的相同序列框架。进行6条序列与TNF-α结合力的确证后,选择了其中的4条肽序列进行人工化学合成、纯化及鉴定。利用L929细胞及MTT法对4条小肽进行活性测定,检测其对TNF-α的抑制活性。结果表明,在TNF-α对L929细胞毒性为30％左右时,含同源序列框架的2条肽可抑制90％左右的TNF-α活性。     

核酸适配体的体外筛选方法的最新研究进展

核酸适配体是用配体指数富集系统进化技术(SELEX)在体外筛选得到的一小段寡核苷酸序列,能够选择性的与不同的靶标特异性的结合,包括蛋白质、小分子、有机物、金属离子、药物等,具有高亲和力和高特异性。这项技术的诸多优势,使其迅速得到重视,核酸适配体在生物传感器、基因芯片、新药开发、纳米技术等诸多方面应用广泛。但是传统的SELEX方法操作繁琐,筛选周期长,需要几个月的时间才能筛选出与靶标具有高特异性的核酸适配体。随着SELEX的快速发展,近年来出现了很多新型的筛选方法,这些新的方法大大提高了筛选周期,极大的提高了筛选效率,拓展了核酸适配体的应用。总结介绍了近三年来出现的几种新型的核酸适配体的筛选方法,包括氧化石墨烯SELEX(Multiple GO-SELEX)、单壁碳纳米管辅助细胞SELEX(SWCNTs-assisted cell-SELEX)、基于芯片的细胞SELEX(on-chip Cell-SELEX)、序列构造SELEX(Sequence-constructive SELEX)、高保真SELEX(High-Fidelity SELEX),有助于人们进一步了解、认识核酸适配体筛选技术的发展现状,更好促进核酸适体在各个领域中的应用前景。     

细胞酶联反应法 (cell-ELA) 测定特异结合U87-EGFRvⅢ细胞的适配子的亲和力

通过细胞-指数级富集的配基系统进化(Cell based systematic evolution of ligands by exponentialenrichment,cell-SELEX)方法从随机文库中筛选得到与稳定过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(Epidermal growth factor receptor variantⅢ,EGFRvⅢ)的胶质瘤细胞U87细胞株(U87-EGFRvⅢ)特异结合的DNA适配子。以U87-EGFRvⅢ细胞作为检测对象,筛选到的适配子A15作为检测分子,建立一种细胞酶联反应(Cell enzyme-linked assay,cell-ELA)方法测定适配子的亲和力,并用EGFR抗体作为对照来比较此种DNA适配子的亲和力。结果显示,所测定的DNA适配子A15的解离平衡常数(Equilibrium dissociation constants,Kd)小于100 nmol/L,对U87-EGFRvⅢ细胞的结合能力与抗体相似。Cell-ELA法可较方便地用于cell-SELEX中适配子亲和力的测定。     

用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选的Western印迹-SELEX筛选技术的建立

目的:建立一种基于Western印迹的指数式富集的配体系统进化(SELEX)技术,用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选。方法:将目的蛋白经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上,用生物素标记的ss DNA与PVDF膜上的蛋白共同孵育,获得能与靶蛋白特异结合的适配体,最后通过生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统、基因克隆测序、MEME在线软件和RNAstructure软件分析适配体的一、二级结构,并对筛选得到的适配体进行鉴定。结果:经过4轮筛选,获得了能特异识别靶蛋白而不识别无关蛋白的适配体,原库Gp45则与上述蛋白均没有结合。结论:建立了Western印迹-SELEX技术,可用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选。