口腔黏膜真菌鉴定方法的比较

比较常见用于黏膜真菌菌种鉴别的多种方法,探寻最佳的鉴别方法。采集230例普通人群口腔黏膜样本,分别用玉米吐温-80培养观察厚膜孢子法、糖发酵生化反应法、CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法、ITS基因的PCR-RFLP(聚合酶链反应-限制性片段长度多态性)法、ITS测序菌种鉴定法,鉴别真菌各菌株。结果显示:有56例菌株至少通过1种方法检出真菌;玉米吐温-80分离培养假丝酵母菌37株;50例菌株ITS基因测序共鉴定出8个菌种,白假丝酵母菌(C.albicans)29株,近平滑假丝酵母菌(C.parapsilosis)10株,热带假丝酵母菌(C.tropicalis)5株,Candida metapsilosis 1株,Lodderomyces elongisporus 1株,克柔假丝酵母菌(Candida krusei)1株,乙醇假丝酵母菌(C.ethanolica)1株,季也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii)2株;CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法鉴定出3种菌株,分别是白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌;PCR-RFLP法检出5种菌株,分别是白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、季也蒙毕赤酵母菌、克柔假丝酵母菌,与基因的测序鉴定一致率为91%;糖发酵生化反应法阳性标本占被检出真菌例数的46.4%(26/56)。结果表明:ITS基因的测序法可以准确鉴定真菌各个菌种;PCR-RFLP法能鉴定常见的菌种,但操作繁琐;CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法能快速准确鉴别3种常见假丝酵母菌菌种;玉米吐温-80可以准确培养鉴别白假丝酵母菌;糖发酵生化反应法,缺乏足够的敏感度和特异性,难以准确鉴别各个菌种。     

深圳市人民医院连续13年真菌血症病原谱分析

目的调查深圳市人民医院真菌血症病原谱。方法收集2004-2016年深圳市人民医院真菌血症患者血液分离的真菌,使用VITEK-2、VITEK-MS系统并结合真菌内转录间隔区(ITS)测序技术进行菌种鉴定。结果 2004-2016年共发生真菌血症295例,分离296株真菌,假丝酵母菌占89.9%(266/296)。最常见前5位真菌依次为白假丝酵母菌(36.1%,107/296)、近平滑假丝酵母菌种复合群(19.3%,57/296)、热带假丝酵母菌(13.9%,41/296)、光滑假丝酵母菌种复合群(11.8%,35/296)和菌膜假丝酵母菌(4.7%,14/296);非白假丝酵母菌占53.7%(159/296)。69.8%(206/295)真菌血症来自重症医学科(ICU)(89例)、新生儿科(33例)、血液科(30例)、胃肠外科(29例)和呼吸科(25例)。结论假丝酵母菌是真菌血症最重要的病原菌,其中非白假丝酵母菌占比过半。     

复发性外阴阴道假丝酵母菌病菌种分型及药敏

目的对RVVC、VVC患者阴道分泌物进行培养、菌种分型及药物敏感试验,探讨RVVC发生的原因。方法用沙保弱琼脂培养基培养阴道分泌物,分离纯化菌株;VITEK 2全自动微生物分析仪鉴定菌种;同时进行药物敏感试验。结果共分离出101株假丝酵母菌,其中RVVC组45株,VVC组51株,健康组5株。101株中白色假丝酵母菌86株,占85.1%(86/101),RVVC组45株中35株为白色假丝酵母菌,占77.8%(35/45);VVC组51株中47株为白色假丝酵母菌,占92.2%(47/51),健康组5株中4株为白色假丝酵母菌,占80%(4/5)。RV-VC组非白色假丝酵母菌比例高,与VVC组比较差异有显著性(P<0.05)。RVVC组假丝酵母菌对唑类药物敏感性低于VVC组。结论VVC、RVVC的主要致病菌仍是白色假丝酵母菌,RVVC组非白色假丝酵母菌比例高于VVC组。RVVC组假丝酵母菌对氟康唑的敏感率明显低于VVC组。     

泌尿系感染真菌菌种分布及耐药性分析

目的 了解引起泌尿系感染真菌菌种分布及其耐药特点。方法 用沙保弱培养基进行真菌分离培养,鉴定用API20CAUX生化系列,药敏用ATBFUNGUS药敏板。结果427株真菌中前5位为白色假丝酵母菌215株、热带假丝酵母菌69株、伪热带假丝酵母菌38株、克柔假丝酵母菌27株、光滑球拟酵母菌23株。5-氟胞嘧啶、两性霉索B、制霉菌素、咪康唑、益康唑、酮康唑的敏感性分别为90．2％、90．2％、89．2％、73．8％、71．4％和62．9％。临床感染真菌种类及其耐药性有逐年上升趋势。结论 引起泌尿系感染的真菌广泛存在,但仍以白色假丝酵母菌为主。对5-氟胞嘧啶、两性霉索B、制霉菌素敏感率较高;唑类抗真菌药的敏感性呈明显下降趋势。     

医院内假丝酵母菌感染菌种的分布及耐药分析

目的了解医院内假丝酵母菌感染菌种的分布及抗真菌药物的耐药谱,为临床抗真菌治疗提供正确数据。方法采用VITEK-32微生物自动鉴定仪进行假丝酵母菌菌种的鉴定,同时用ATB FUNGUS真菌药敏条作药敏试验。结果从住院患者的血液、痰、尿、分泌物、胆汁等标本中共检出真菌505株。其中白假丝酵母菌281株,热带假丝酵母菌124株,光滑假丝酵母菌21株,季也蒙假丝酵母菌17株,近平滑假丝酵母菌16株,克柔假丝酵母菌10株,皱折假丝酵母菌8株,异常汉逊假丝酵母菌6株,5氟-胞嘧啶和两性霉素抑菌效果最好,其耐药率分别为2.8%和3.4%。其他4种抗真菌药物制霉菌素、氟康唑、伊曲康唑和酮康唑的耐药率分别为6.1%、13.7%、9.3%和28.3%。结论医院假丝酵母菌感染耐药率逐年上升,非白假丝酵母菌感染明显增加。氟康唑对白假丝酵母菌有很强的抗菌活性且毒副作用小。假丝酵母菌感染的迅速增加同广泛应用超广谱抗菌药物、激素及免疫抑制剂等有关。假丝酵母菌感染死亡率高,因此早期诊断及有效性治疗是减少死亡率的关键。     

沈阳和抚顺地区上消化道疾病患者胃黏膜念珠菌感染状况

目的调查分析沈阳和抚顺地区上消化道疾病患者胃黏膜念珠菌感染状况。方法胃镜下钳取沈阳和抚顺地区214例上消化道疾病患者胃黏膜,快速尿素酶法检测幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori);采用CHROMagar培养基显色培养念珠菌,对分离到的各病患组念珠菌菌株进行内转录间隔区(internal transcribed spacer region,ITS)测序并申请Gen Bank登录序列号,与正常人群组口腔黏膜的念珠菌菌株共同建立进化树,观察进化情况,比对分析序列同源性。结果胃黏膜寄居念珠菌阳性率为40.65%(87/214),各组间念珠菌阳性率比较差异有统计学意义(χ2=8.785,P0.05)。消化性溃疡患者H.pylori与念珠菌同时感染的阳性率(44.44%,24/54)高于慢性胃炎患者(13.46%,29/156)。ITS测序鉴定出6种念珠菌,分别为白色念珠菌71株(80.46%),光滑念珠菌8株(9.20%),热带念珠菌1株(1.15%),克柔念珠菌1株(1.15%),C.caribbica 1株(1.15%),葡萄牙念珠菌7株(8.05%)。慢性胃炎组、溃疡组、正常人群组白色念珠菌菌株的进化树分支方向明显不同。结论沈阳及周边地区上消化道疾病患者胃黏膜感染的念珠菌中白色念珠菌为优势菌种;念珠菌与H.pylori同时感染者有胃黏膜损伤程度加重现象。     

健康人群口腔酵母菌的分离及菌种分布

目的调查健康人群口腔酵母菌的分布。方法将来源于健康人的口腔拭子接种于改良SDA培养基,37℃培养14d,分到的酵母菌通过菌落形态、革兰染色作初步鉴定．芽管形成试验、厚膜孢子生成及假菌丝产生试验、YBC酵母鉴定卡作菌种鉴定。结果酵母菌在健康人口腔中总分离率为8．78％(86／979),其中较多的为白色假丝酵母菌37株,占43．02％,近平滑假丝酵母菌和季也蒙假丝酵母菌各9株,各占10．47％,葡萄牙假丝酵母菌6株,占6．98％,其他25株。结论健康人口腔中有多种条件致病酵母菌的寄生。     

651株深部真菌感染菌种分布及耐药性分析

目的了解真菌耐药性变化趋势,探讨预防措施。方法对疑为深部真菌感染患者采样,用沙保罗培养基进行真菌分离,用ATB鉴定卡作菌种鉴定,用ATBFUNGUS板进行药敏试验。结果真菌感染中以白色假丝酵母菌感染为主,占57.6%。真菌对两性霉素-B、5-氟胞嘧啶保持较高的体外抗真菌活性,敏感率分别为94.99%和98.99%。结论深部真菌感染主要由白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌引起,对两性霉素-B、5-氟胞嘧啶保持较高的体外活性,两者仍是治疗真菌的有效药物。     

慢性前列腺炎患者假丝酵母菌感染及耐药性分析

目的 了解慢性前列腺炎与假丝酵母菌感染的相关性及假丝酵母菌的耐药性。方法 采用常规沙堡平板分离360例慢性前列腺炎患者的前列腺液标本中的假丝酵母菌,疑似菌落用ATB Expression鉴定仪进行鉴定。采用ATB-Fungus真菌药敏板,对假丝酵母菌株进行药敏试验。结果 11．7％前列腺液标本（42／360）似丝酵母菌阳性,其中自假丝酵母菌23例（54．7％）,近平滑假丝酵母菌13例（30．9％）,其它6例（14．3％）。假丝酵母菌菌株对两性霉素B和制霉菌素敏感率均为100％,其次为酮康唑,敏感率为97．0％;对5-氟胞嘧啶耐药性最强,其耐药率为56．5％。结论 白假丝酵母菌和近平滑假丝酵母菌是慢性前列腺炎假丝酵母菌感染的优势菌种,假丝酵母菌株最敏感的药物是两性霉素B和制霉菌素。     

福建地区94例女性阴道念珠菌感染分离株分型研究

目的 对福建地区临床阴道分泌物分离出的（94株）念珠菌菌株进行分类鉴定,并通过分子生物学及API试验分析传统科玛嘉分类方法的准确性.方法 ①通过科玛嘉显色培养基鉴定菌种,并观察菌株显微镜下形态学表现.②通过ITS区段分子生物学序列分析进行菌种鉴定.③将科玛嘉试验与ITS区段序列分析结果与化验室检验报告结果对比,将鉴定差别菌株进一步行API试验及LSU区段序列分析.结果 ①94株念珠菌经鉴定结果为白念珠菌78株、光滑念珠菌10株、近平滑念珠菌3株、热带念珠菌1株、酿酒假丝酵母菌1株及其中1株为光滑念珠菌及近平滑念珠菌混合感染.②科玛嘉试验可良好的鉴定念珠菌,但对于少见菌种（如酿酒假丝酵母菌）仍缺乏特异性.③一般化验室通过简单菌落形态学及简易科玛嘉检测鉴定仍存在一定误差率（10/94）.④分子生物学方法鉴定菌种准确性高,且可从基因序列分析中鉴定包含C.parapsilosis sensu strico,Candida metapsilosis以及Candida orthopsilosis的近平滑念珠菌复合体菌种.结论 福建地区女性外阴感染的菌种仍以白念珠菌为主,但非白念珠菌的感染也占据相当的比例（16/94）,而在检测方法上,分子生物学技术较科玛嘉试验更能准确的鉴定念珠菌菌种.     

口腔念珠菌基因多态性检测

目的检测正常人群口腔念珠菌基因型,以了解口腔念珠菌基因多态性。方法采集162例正常人群口腔样本,用念珠菌显色培养基(CHROM agar)进行菌种分离培养鉴定,用玉米Tween80培养基进行真菌孢子形态学检查鉴定,随机抽取45个菌株样本进行内含子转录间隔区(internal transcribed spacer region,ITS)序列检测,并比对同源性,建立进化树,观察菌株进化分支情况。结果分离培养出念珠菌菌株57株(57/162,35.2%),其中白色念珠菌(Candida albicans)36株(36/57,63.1%)。进行ITS序列检测的45个菌株申请GenBank序列注册号为FJ697166-GQ280292。结论正常人群口腔念珠菌基因具有多态性。     

胃溃疡、胃癌组织中幽门螺杆菌及真菌基因片段的扩增分析

探讨胃溃疡、胃癌组织中幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)、真菌(Fungi)单纯感染及混合感染的可能性并进行验证。应用聚合酶链反应(PCR)技术,分别自4例胃溃疡和4例胃癌并伴单纯幽门螺杆菌、真菌及其混合感染病例石蜡包埋组织(FFPE)中扩增Hp及fungi基因特异片段并进行测序分析。成功提取了FF-PE胃组织基因组DNA,并扩增出Hp 16S rRNA及真菌内转录间隔区18S rDNA基因和28S rDNA之间的基因特异条带,测序大小分别为114 bp和357 bp,经在线BLAST比对分析表明所扩增基因与Hp及真菌核苷酸具有高度同源性。胃溃疡、胃癌组织中存在Hp和真菌单纯感染及混合感染。推测Hp与真菌混合感染可能是加重胃溃疡发展和诱发胃癌发生的又一致病因素。积极治疗Hp与真菌混合感染有助于提高胃溃疡的治愈率和减少胃癌的发生。     

297例浅部真菌病临床及病原菌菌种分析

目的 探讨皮肤浅部真菌病致病真菌菌种的构成.方法 对297例真菌涂片阳性和培养阳性的浅部真菌病患者,取标本进行分离培养及菌种鉴定,培养阳性标本在形态学上不能准确鉴定的,进行梅里埃API 20C AUX酵母菌鉴定试剂盒或核糖体DNA （rDNA） ITS区序列测定,确切鉴定菌种.使用SPSS 17.0统计软件对于结果进行统计分析.结果 共分离培养出致病菌13种,其中红色毛癣菌86株（29.0％）,须癣毛癣菌68株（22.9％）,念珠菌属59株（19.9％）,暗色真菌属13株（4.4％）,曲霉菌属13株（4.4％）,红酵母菌12株（4.0％）,青霉菌属9株（3.0％）,毛霉菌9株（3.0％）,犬小孢子菌5株（1.7％）,浅白隐球菌3株（1.0％）,毛孢子菌属2株（0.7％）,絮状表皮癣菌1株（0.3％）,混合感染17株（5.7％）.结论 本地区浅部真菌病以甲癣为主,主要致病真菌是红色毛癣菌,但其他种类真菌感染尤其是念珠菌属有明显上升趋势.     

深部真菌感染临床特点分析

目的了解深部真菌感染患者的性别、年龄、感染部位、住院科室、菌种分布及真菌耐药情况,为临床防治真菌感染提供研究依据。方法收集荆州市中心医院2009年1月至2009年12月微生物实验室分离的真菌446株,采用科马嘉显色琼脂及API220C Aux鉴定系统鉴定,并使用ATMTMFUNGUS3真菌药敏卡进行体外药敏试验。结果临床真菌感染男性占72%,以老年患者为主,大于60岁者占54.9%;感染的真菌主要分布于呼吸内科和ICU,分别占35.5%、24.9%;主要感染部位为呼吸道,占91.3%;主要菌种为白假丝酵母菌、热带念株菌、近平滑假丝酵母菌、光滑念株菌和克柔念株菌,分别占64.2%、13.2%、9.6%、7.6%和5.4%;合并细菌感染的感染真菌100株,占22.2%,细菌中以革兰阴杆性菌为主,占96%;药敏试验结果显示真菌对各抗真菌药具有较好的敏感性。结论临床真菌感染已日益突出,以呼吸科及ICU患者老年男性为主,儿童真菌感染亦不容忽视,感染菌种以白假丝酵母菌和热带念株菌为主,临床应加强对这些真菌感染的预防和监测,防止真菌感染。     

千层塔内生真菌的分离与鉴定

目的：为从千层塔中分离具有药用价值的内生真菌奠定基础。方法：新鲜千层塔茎段,经酒精和升汞消毒后,接种于PDA平板培养基上进行内生真菌的分离、纯化;根据菌落形态和孢子等形态特征,结合核糖体基因居间序列（ITS序列）进行菌株鉴定。结果：从千层塔的茎中分离出4株内生真菌。内生真菌I菌落形态和孢子特征与枝状枝孢霉属的特征相符合,ITS序列与GenBank中多条属于枝状枝孢霉的ITS序列相似,鉴定该菌株属于枝状枝孢霉;内生真菌II菌落形态和孢子特征与黄青霉的特征相符合,鉴定该菌株属于黄青霉;内生真菌III菌落形态和孢子特征与尖孢镰刀菌的特征相符合,ITS序列与GenBank中多条属于尖孢镰刀菌的ITS序列相似程度高,鉴定该菌株属于尖孢镰刀菌;内生真菌Ⅳ菌落形态与盾壳霉相似,ITS序列与GenBank中6条属于盾壳霉的ITS序列具有较高的相似性,鉴定该菌株属于盾壳霉。结论：从千层塔中分离和鉴定出4株内生真菌,分别属于枝状枝孢霉、黄青霉、尖孢镰刀茵和盾壳霉。     

白木香内生真菌的分离及分子鉴定

对采自广东省信宜市的白木香进行了内生真菌分离培养,共获得50个菌株,通过rDNA中内转录间隔区(ITS)序列鉴定其为20个种,其中确定至种名的有7属8种,仅确定至属名的有8种,不能确定种属的有4种,其中A20菌株(Fimetariella rabenhorstii)为国内首次报道。刺盘孢菌(Colletotrichum)共分离到17株,占分离总数的34%,为白木香优势种群;镰刀菌(Fusarium)共分离到11株,是结香部位的优势种群。白木香内生真菌分布部位的专一性不明显,茎中分离的数量及种类最多,叶中最少;5年龄内生真菌的多样性较好,10月龄的多样性较低。     

Direct Species Identification of Common Pathogenic Dermatophyte Fungi in Clinical Specimens by Semi-nested PCR and Restriction Fragment Length Polymorphism

OBJECTIVE: To seek a rapid and reliable molecular biology method to identify the common pathogenic dermatophyte fungi from clinical samples. METHOD: The genome DNA was extracted from cultured strains of seven common dermatophyte fungi species and part of each positive clinical specimen by microscopy. Intergenic spacer regions of ribosomal DNA (ITS) were amplified by semi-nested PCR (snPCR) with three universal primers (NS5, ITS1, and ITS4) for fungi. The amplified products were digested with two restriction endonucleases (BciT130 I, Dde I), the Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP). The rest of each clinical specimen was cultured in Sabouraud's Agar medium. Then the results of RFLP were compared with the traditional culture results. RESULTS: The digestion of seven common dermatophyte fungi produced seven different restriction profiles. Restriction profiles of 17 clinical specimens matched, respectively, to that of the cultured strains, and 14 profiles of the 17 ones matched the culture result completely. The coincidence was 100.0%. CONCLUSIONS: snPCR-RFLP analysis of intergenic spacer regions of ribosomal DNA is a valuable method of exactness and clarity for species identification of common dermatophyte fungi from clinical specimens.     

Fungi associated with hair roots of Rhododendron lochiae (Ericaceae) in an Australian tropical cloud forest revealed by culturing and culture-independent molecular methods

The culturable fungal assemblage associated with hair roots of Rhododendron lochiae (Ericaceae) from a tropical cloud forest in Queensland, Australia was investigated using rDNA internal transcribed spacer (ITS) restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) and sequence analysis, and the abilities of the fungi to form ericoid mycorrhizas were tested. DNA was further extracted directly from hair roots and partial fungal ITS products compared with those from the cultured isolate assemblage using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). A range of ericoid mycorrhizal and non-mycorrhizal fungi was identified using both approaches, with ericoid mycorrhizal fungi found to be taxonomically similar to those associated with Ericaceae in temperate habitats worldwide. Both approaches identified several unique fungi and, although most of the abundant RFLP types identified in the cultured fungal assemblage were also present in DGGE profiles of DNA extracted directly from roots, one the most commonly isolated RFLP types, a putative Xylariaceae taxon, was absent. The data suggest that a combination of culturing and culture-independent approaches may be more efficacious than either method individually.     

一种适用于PCR反应的酵母菌、无绿藻及丝状真菌DNA提取方法

目的 介绍一种从酵母、无绿藻及丝状真菌中提取DNA以用于PCR反应的方法。方法 所用菌种包括临床分离的未知菌株和保藏菌株共23株：未知酵母菌（5株）、真皮毛孢子菌（1株）、糠秕马拉色菌（1株）、季也蒙念珠菌（5株）、未知丝状真菌（6株）、无绿藻（1株）、烟曲霉（2株）、拟青霉菌（1株）、茎点霉（1株）。用溶细胞酶（lyticase）结合Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,A260／A280检测纯度并计算质量浓度,用真菌通用引物ITS1／ITS4扩增真菌核糖体基因（rDNA）内转录间区ITS基因,经PCR扩增检验所提取的DNA质量。结果 成功提取所有23株真菌基因组DNA,其纯度及质量浓度能满足PCR反应的要求。结论 用溶细胞酶结合Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒从酵母菌、无绿藻及丝状真菌提取的DNA可用于PCR反应。