烙铁头蛇毒纤维蛋白原溶酶研究——Ⅱ.对纤维蛋白原及凝血酶的作用

烙铁头(T.mucrosquamatus)蛇毒纤维蛋白原溶酶TMVFg能水解三肽底物Bz-Phe-Val-Arg-PNA,但对凝血酶的良好底物Cbz-Gly-Pro-Arg-PNA却活性甚低。TMVFS显著延长血浆凝血酶时间。血浆复钙时间及纤维蛋白原溶液凝血酶时间。同时,TMVFg体外也能延长全血凝固时间,表明具有抗凝作用。纤维蛋白原-纤维蛋白转换实验表明:TMVFg水解纤维蛋白原产生的纤维蛋白原断片(FDP)除具有抗凝血酶,抑制纤维蛋白聚合活性外,还能促进纤维蛋白的聚合。 进一步用FPLC分离TMVFg水解人纤维蛋白原混合液,得两个FDP断片功能峰,FDP组分Ⅰ和FDP组分Ⅱ。其中FDP组分Ⅰ能抑制纤维蛋白凝块形成;FDP组分Ⅱ能促进纤维蛋白凝块形成,抑制TMVA(烙铁头蛇毒血小板活化素,它可不通过ADP、花生四烯酸途径而诱导血小板聚集),但对ADP诱导的家兔血小板聚集无影响。TMVFg对凝血酶水解三肽底物Cbz-Gly-Pro-Arg-PNA及凝固纤维蛋白原的活性也有一定抑制作用。 实验证明,TMVFg抗凝的主要作用机理是其水解纤维蛋白原产生的断片对纤维蛋白原凝固的抑制作用、FDP断片抗凝血酶作用及TMVFg本身对凝血酶活性的抑制所引起的,但在二者之间,前者是主要的。 从研究结果发现:TMVFg水解纤维蛋白原所产生的断片有一类能加速凝血酶凝固纤维蛋白原的过程,这就发现了FDP断片的     

烙铁头蛇毒素纤维蛋白原溶酶研究:Ⅱ.对纤维蛋白原及凝血酶的作用

烙铁头（T.mucrosquamatus）蛇毒纤维蛋白原溶酶TMVFg能水解三肽底物Bz-Phe-Val-Arg-PNA，但对凝血酶的良好底物Cbz-Gly-Pro-Arg-PNA却活性甚低。TMVFg显著延长血浆凝血酶时间、血浆复钙时间及纤维蛋白原溶液凝血酶时间。同时，TMVFg体外也能延长全血凝固时间，表明具有抗凝作用。纤维蛋白原-纤维蛋白转换实验表明：TMVFg水解纤维蛋白原产生的纤维蛋白原断片（FDP）除具有抗凝血酶，抑制纤维蛋白聚合活性外，还能促进纤维蛋白的聚合。进一步用FPLC分离TMVFg水解人纤维蛋白原混合液，得两个FDP断片功能峰，FDP组分Ⅰ和FDP组分Ⅱ。其中FDP组分Ⅰ能抑制纤维蛋白凝块形成；FDP组分Ⅱ能促进纤维蛋白凝块形成，抑制TMVA（烙铁头蛇毒血小板活化素，它可不通过ADP、花生四烯酸途径而诱导血小板聚集），但对ADP诱导的家兔血小板聚集无影响。TMVFg对凝血酶水解三肽底物Cbz-Gly-Pro-Arg-PNA及凝固纤维蛋白原的活性也有一定抑制作用。实验证明，TMVFg抗凝的主要作用机理是其水解纤维蛋白原产生的断片对纤维蛋白原凝固的抑制作用、FDP断片抗凝血酶作用及TMVFg本身对凝血酶活性的抑制所引起的，但在二者之间，前者是主要的。从研究结果发现：TMVFg水解纤维蛋白原所产生的断片有一类能加速凝血酶凝固纤维蛋白原的过程，这就发现了FDP断片的新功能。它证明了FDP断片作为血液凝固、纤溶正反馈调节因子的功能。这一类FDP断片还能抑制TMVA诱导的血小板聚集，因此，烙铁头蛇毒纤维蛋白原溶酶TMVFg将成为研究血液凝固调节系统及血小板聚集第三条途径的强有力试剂。     

玉米芯木聚糖硫酸酯抗凝血活性及其机制的研究

采用活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和凝血酶原时间(PT)检测了玉米芯木聚糖硫酸酯(wisX-SB)的抗凝活性,结果表明wisX-SB能明显延长APTT和TT,而不影响PT,提示wisX-SB是通过内源性和/或共同途径发挥抗凝血作用的。采用发色底物法及纤维蛋白原转化实验分别考察了wisX-SB对凝血酶及纤维蛋白原的作用,结果提示wisX-SB的抗凝机制包括:直接抑制纤维蛋白原的转化;通过增强抗凝血酶III(AT-III)的活性,抑制凝血酶活性,从而达到抗凝目的。较低浓度时以前者为主,较高浓度下两者皆起作用。     

血液凝固机制

经典的凝血机制早在1892年已由Schmidt提出,以后Morawitz及Mellanby等进一步确定了这个学说,他们认定,血液的凝固需要以下诸物质的存在:1.凝血酶元、2.凝血致活酶、3.钙游子、4.纤维蛋白元、5.血小板。而且已经确定,血液凝固是个自动的链式过程,可表示如下:凝血酶元+凝血致活酶+Ca~(++)→凝血酶凝血酶+纤维蛋白元→纤维蛋白由于水溶性的纤维蛋白元变成了非水溶性的纤维蛋白,血液乃由液态转为固态,而形成血块。     

浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒抗凝血活酶组份抗凝机理的研究

应用三次离子交换柱层析和一次凝胶过滤从浙江产蝮蛇毒中分离纯化了抗凝血活酶组份。测定出该组份由119个氨基酸残基组成,分子量为15,000道尔顿,等电点为9.4,N—末端为组氨酸。 纯化的抗凝血活酶组份在体外对血浆重钙化时间有显著影响,但不延长血浆凝血酶原时间和凝血酶时间,对纤维蛋白也无溶解作用,极低浓度（0.5微克/毫升）的抗凝组份就能抑制血液凝血活酶的生成。家兔静脉注射抗凝血活酶组份后十分钟,全血凝固时间和血浆重钙化时间均明显延长,但血浆凝血酶原时间、纤维蛋白含量和全血凝块溶解时间却不受影响。 蝮蛇毒抗凝血活酶组份具有磷脂酶A_2活性,但血浆中磷脂的水解似乎并不是血浆凝固延迟的主要原因,很可能是抗凝血活酶组份能够同血浆中凝血活酶组份（磷脂部份）可逆地结合,从而干扰了凝血酶原的活化。     

乙醇酸氧化酶必需精氨酸残基的化学修饰

丁二酮能使GAO迅速失活,其失活速度受介质pH和硼酸浓度的显著影响;其修饰反应具可逆性,当透析除去修饰剂和硼酸时,活性得到恢复。失活进程表现为假一级动力学。而计算表明,酶的每一活性中心单位与一分子丁二酮结合便可引起酶的失活。底物和竞争性抑制剂均能有效地保护酶免于失活。氨基酸分析表明,酶的失活是因为丁二酮修饰了精氨酸残基。丁二酮修饰GAO后使酶的K_m增大,而V_m没有变化。     

浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒抗凝血活酶组份对凝血系统的作用

通过二乙氨基乙基葡聚糖A-50柱层析,从浙江产蝮蛇毒中得到一个抗凝血活酶组份。这一组份在体外显著地延长血浆复钙时间和凝血酶原时间,但不延长凝血酶时间,对纤维蛋白也无溶解作用。低浓度的抗凝组份就能干扰血液凝血活酶生成和抗组织凝血活酶。家兔静脉注射抗凝组份,全血凝固时间、血浆复钙时间、凝血酶原时间和凝血酶时间均显著而短暂地延长,纤维蛋白原浓度也会突然下降至原来的20％,而优球蛋白溶解时间始终大于24小时,没有缩短现象。     

法尼醇X受体(FXR)通过诱导肝脏抗凝血酶Ⅲ的表达抑制小鼠凝血过程(英文)

法尼醇X受体(farnesoid X receptor, FXR)已被发现可在凝血系统中发挥重要作用,包括抑制血小板功能、促进纤维蛋白原表达等。然而至今,FXR在凝血系统中的调节机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨FXR对抗凝血酶Ⅲ (antithrombin Ⅲ,AT Ⅲ)的调节作用。用FXR特异性激动剂GW4064 (每天30 mg/kg)处理野生型(WT)和FXR基因敲除(FXR KO) C57BL/6小鼠1和3天,结果显示,在WT小鼠上,FXR激动可显著延长凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间,降低活化凝血因子X (activated factor X, FXa)活性,降低活化凝血因子Ⅱ (activated factor Ⅱ, FⅡa)和凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex,TAT)浓度,升高血浆AT Ⅲ浓度,使血液处于低凝状态;当FXR敲除时,以上指标全部逆转,血液处于高凝状态。激动FXR后,WT小鼠肝脏AT Ⅲ表达增加;而FXR KO小鼠肝脏中AT Ⅲ表达较WT小鼠明显降低。体外研究结果显示,GW4064和FXR过表达腺病毒均可显著上调小鼠原代肝细胞中AT Ⅲ的表达,相反,siRNA敲减FXR可明显抑制AT Ⅲ表达。AT Ⅲ启动子区含有FXR结合位点,GW4064可显著上调Luc-AT Ⅲ荧光素酶活性并增加FXR与AT Ⅲ启动子区的结合。以上结果提示,FXR可通过直接转录调控AT Ⅲ的表达而抑制凝血过程。本研究揭示了FXR在凝血平衡中的新作用,提示FXR可能成为血液高凝状态相关疾病的潜在治疗靶点。     

浙江蝮蛇毒磷脂酶A抗凝作用的研究

本文研究分析了从浙江产蝮蛇毒提纯的三种磷脂酶A(PLA)的抗凝活性,结果只有碱性PLA具有抗凝作用,而酸性PLA与中性PLA(Agkistrodotoxin)均无此作用。碱性PLA能显著延长血浆复钙时间和凝血酶原时间,影响血液凝血活酶的生成,抑制血小板磷脂与红细胞磷脂的促凝活性,但对凝血酶时间及纤维蛋白平板溶解试验无影响。这些结果表明,碱性PLA可能通过对膜磷脂的作用而干扰凝血酶原酶的形成。碱性PLA明显改变了血小板和红细胞的电泳速率,而酸性及中性PLA则影响较小,提示碱性PLA抗凝活性可能与膜磷脂特异活性部位的结合反应有关。     

蛇毒降纤酶的主要药理作用

蛇毒中 “凝血酶样酶”（ Ｔｈｒｏｍ ｂｉｎｌｉｋｅ Ｅｎｚｙｍ ｅ, Ｔ Ｌ Ｅ） 由中国卫生部定名为降纤酶 （ Ｄｅｆｉｂｒａｓｅ, Ｄｆ）。类同生理凝血酶 （ Ｔｈｒｏｍ ｂｉｎ, Ｔｂ） 能降解血浆纤维蛋白原 （ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ, Ｆｇ）, 但只解离 Ｆｇ 结构的肽链 Ａ, 而不象生理凝血酶能同时解离肽链 Ａ 和肽链 Ｂ; 经 Ｄｆ降解的 “脱肽链 Ａ 纤维蛋白”是可溶性单体, 不接受血中稳定因子 （第十三因子, ⅩⅢ Ｆ） 的催化交联, 易被血中溶纤酶 （ Ｐｌａｓｍ ｉｎ, Ｐ１） 迅速消溶并被吞噬细胞所消除, 不产生 Ｄ Ｉ Ｃ现象; 蛇毒 Ｄｆ的直接效果是降低血浆纤维蛋白原在血中的含量, 从而降低血液粘度, 得以疏畅血流, 用于防治血液高粘滞伴发的血管闭塞性疾病; 蛇毒 Ｄｆ能激发组织溶纤酶原激活物 （ｔ Ｐ Ａ） 的释放, 促使溶纤酶原转变为有活性的溶纤酶, 能使纤维蛋白降解产物 （ Ｆ Ｄ Ｐ） 得以消除, 使血栓崩解。蛇毒 Ｄｆ能阻抑血小板的聚集从而延缓血栓的形成。     

浙江蝮蛇蛇毒凝血酶在家兔体内的抗凝作用的研究

浙江产蝮蛇（Agkistrodon halys Pallas）毒类凝血酶经静脉注射家兔（0.25毫克/公斤）可使血浆凝血酶时间显著延长,这是由于血浆纤维蛋白原的水平下降及其性质上的变化引起的。表现在对Ristocetin的亲合力显著降低。此凝血酶时间之延长可被甲苯胺兰部分纠正。葡萄球菌猬集试验表明体内有大量纤维蛋白降解产物（FDP）产生。体外实验表明该酶不激活FXⅢ。 上述结果说明,类凝血酶的体内抗凝作用除由于纤维蛋白原含量降低及性质上有变化外,还与给药后体内大量纤维蛋白降解产物的形成有关。     

硫酸乙酰肝素在骨折愈合中的作用

硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)是由多个硫酸化结构的二糖基单位重复形成的线型多糖,并以共价键形式连接于核心蛋白质形成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,几乎所有动物细胞均可以合成硫酸乙酰肝素.硫酸乙酰肝素可与许多生物活性分子相结合,其中包括肝素结合性生长因子(heparin-binding growth factor,HSGF),比如成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,FGF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、β-转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)等.这些生长因子可促进骨的形成,但由于容易被蛋白酶降解失活而影响其临床效果,如大量使用可能导致肿瘤形成.硫酸乙酰肝素与生长因子结合可以保护生长因子免受蛋白酶降解并可促进生长因子与其受体结合,从而增强,延长生长因子的活性,并可能同时调控生长因子的信号传递,参与骨细胞的功能及活性的调节.近来在动物骨折模型中使用硫酸乙酰肝素可明显促进骨的愈合,因此硫酸已酰肝素有可能成为治疗骨折不愈合或延迟愈合的有利工具.     

TAFI的延展结构

TAFI（可激活凝血酶的纤维蛋白溶解抑制剂．thrombin-activablefibrinolysis inhibitor）是一种极为重要的药物靶点．目前很多制药公司部在对该靶点进行研究。TAFI是一个成熟蛋白．也是一种不稳定的金属羧化多肽酶，它可以切除凝集的血纤维蛋白C端的赖氨酸．从而使斑凝块得以稳固。此外．TAFI还参与发炎反应，使过敏毒素（炎症多肽衍生的补体）失活。本研究中展示的高分辨率晶体结构以及其他证实性研究结果指出．TAFI酶原本身就是一种活化酶．只是活性较低。这种结构证明，此酶的活性部位易于接近，而且具有活化构型。     

人血浆 α_2-巨球蛋白的分离纯化

α_2-巨球蛋白(α_2-Macroglobulin,简称α_2M)是一种高分子量的糖蛋白,含糖量为8-11％,分子量为725,000,等电点为5.5,已知每克分子α_2M含有4.8克原子锌,占血浆总锌含量的20％.α_2M是血浆中重要的蛋白酶抑制剂.含量约为2毫克/毫升,能抑制四种内肽酶的活性.α_2M使蛋白酶失活的机理尚未彻底弄清,文献报道α_2M与胰蛋白酶、凝血酶、纤溶酶及激肽释放酶反应时,可从α_2M分子上游离出一段多肽(MW:85000),这一裂解作用使α_2M分子     

连续性血液净化对小儿脓毒症患者血清抗凝血酶Ⅲ, IL-6 及D- 二聚体水 平的影响

目的:探究连续性血液净化对小儿脓毒症患者血清抗凝血酶Ⅲ、IL-6及D-二聚体水平的影响。方法:收集我院收治的小儿脓毒症患儿48例,根据随机对照表分为对照组和试验组,每组各24例。两组均实施常规对症治疗,对照组患者予以低分子肝素钙治疗,试验组试验组在对照组的基础上采用床旁血滤机进行连续性血液净化治疗。治疗结束后,对比分析两组患儿临床疗效、血凝四项、T细胞亚群、抗凝血酶Ⅲ、白介素-6、D-二聚体水平以及不良反应的发生情况。结果:治疗后,与对照组相比,试验组的临床总有效率较高(P0.05);两组血清活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、凝血时间、血清白介素6及D-二聚体水平下降(P0.05),纤维蛋白原、抗凝血酶Ⅲ、CD_3~+、CD_4~+、CD_8~+、CD_4~+/CD_8~+水平升高(P0.05);与对照组相比,试验组血清活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、凝血时间、血清白介素6及D-二聚体水平较低(P0.05),纤维蛋白原、抗凝血酶Ⅲ、CD_3~+、CD_4~+、CD_8~+、CD_4~+/CD_8~+水平较高(P0.05);两组组不良反应发生率相比无显著差异(P0.05)。结论:连续性血液净化对小儿脓毒症的临床疗效显著,可能与上调抗凝血酶Ⅲ,下调血清IL-6及D-二聚体水平有关。     

蛋白凝胶基质的制备与基质内的血管生成反应

利用肝素亲和层析从血清中提取玻璃粘连蛋白（vitronectin）,以硫酸铵沉淀法从血浆中粗提含纤维蛋白原的复合蛋白质组分,向血浆蛋白、胎牛血清和DMEM组成的复合成分中加入凝血酶,制成蛋白质凝胶.观察血管内皮细胞在此基质上或在基质中的生长及在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的诱导下形成的血管样结构.结果表明血管内皮细胞可粘附在此凝胶基质表面正常生长,在bFGF的诱导下,内皮细胞向胶内迁移、生长并形成管状结构,多个管状结构连接、融合形成毛细血管网状结构.     

蜱源抗凝血因子研究进展

蜱是一种人畜共患体表寄生虫,通过叮咬宿主和吸血,将病原体传播给宿主,引发多种疾病。凝血反应是人和动物的重要生理过程,是生理性止血的重要环节。蜱叮咬和吸食宿主血液周期长,在吸血过程中分泌多种抗凝物质,抑制凝血反应,可帮助蜱长时间保持吸血状态。目前,已知的蜱源抗凝物质依据其功能主要包括蛋白酶抑制剂、纤维蛋白(原)溶解剂、血小板聚集抑制剂和血管活性蛋白4大类。这些抗凝血物质可分别作用于凝血级联反应中内源性通路、外源性通路、共同通路中的关键步骤,以及促进纤蛋白溶解和抑制血小板激活,从而抑制宿主血管中的凝血反应。蛋白酶抑制剂主要通过抑制凝血级联反应共同通路中凝血酶和Xa因子活性;纤维蛋白(原)溶解剂引起纤维蛋白原的水解并延迟纤维蛋白凝块的形成;血小板聚集抑制剂通过降解血小板聚集激动剂,并结合血栓素A2(thromboxane A2, TXA2)和血小板上的αIIbβ3整合素抑制血小板聚集;血管活性蛋白抑制宿主血管收缩以及伤口愈合和血管生成。此外,还有一些蜱分泌的其他蛋白分子可通过不同的通路来实现抗凝血作用。本文对迄今为止各类蜱中发现的具有抗凝血活性的蛋白和小分子及其抗凝血作用机制进行总结阐述,将促进对蜱抗宿主凝血的作用机制和生理意义的理解,也为研制蜱源新型抗凝血药物、开发新的抗血栓疗法提供重要参考。     

肝素生物学功能的研究进展

肝素(heparin)是由肥大细胞产生的内源性分子,是一种高度硫酸化的糖胺聚糖,随着肥大细胞脱颗粒与组胺等物质一起释放到细胞外基质中。因其主要与抗凝血酶III结合而增强其活性,间接发挥抗凝作用,故在临床上作为抗凝剂广泛使用。然而,肝素在体内的主要生物学功能仍不清楚。研究表明,肝素能够结合体内多种蛋白,影响许多生物信息的传递,在肥大细胞活性、炎症反应、细胞增殖分化及多种疾病中发挥重要作用。本文总结肝素研究的重要成果,对肝素的主要的生物学功能进行综述。     

凝血酶对大鼠星形胶质细胞组织因子活性表达的影响及其机制

目的：观察凝血酶对大鼠星形胶质细胞组织因子活性表达的影响及其机制。方法;培养Ｗｉｓｔａｒ乳鼠星形胶质细胞,细胞用抗神经胶质纤维酸性蛋白单克隆抗体确认。细胞冻融液组织因子活性检测采用一期血浆复地。结果：与对照组比较,凝血酶使星形胶质细胞组织因子表达明显增高（Ｐ〈０．０５）。当凝血酶与三氟吡啦嗪或Ｈ７联用时,它对呈形胶质细胞表达组织因子活性的刺激作用受到抑制。与凝血酶组比较,已呵可碱十凝血酶组星形胶质     

人凝血酶原复合物生产过程中凝血因子活化分析

目的通过比较以组分Ⅲ沉淀和血浆为原料制备人凝血酶原复合物(Prothrombin complex concentrates,PCC)过程中凝血因子活化情况,为选择最适PCC制备原料提供数据支持。方法分别对以组分Ⅲ沉淀和血浆为原料制备PCC过程中中间品的活化的凝血因子活性和人凝血酶活性两个项目进行检定,分析凝血因子的活化情况。观察以组分Ⅲ沉淀为原料制备PCC过程中添加肝素能否抑制PCC中凝血因子的活化。结果以组分Ⅲ沉淀为原料制备的PCC中间品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性两个项目均不合格。以组分Ⅲ沉淀为原料制备PCC生产过程中添加肝素后,PCC中间品的活化的凝血因子活性和人凝血酶活性均不合格。以血浆为原料制备的PCC中间品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性两个项目均合格。结论组分Ⅲ沉淀为原料制备PCC会增加凝血因子活化的风险,新鲜冰冻血浆可作为制备PCC的原料。