佛波酯(TPA)促进NIH3T3细胞α5β1整合蛋白的合成

佛波酯(TPA)是潜在促肿瘤剂,也是蛋白激酶PKC激活剂.TPA能在极低浓度下替代DG激活PKC,从而导致一系列细胞功能变化.应用100 nmol/L TPA作用于NIH3T3细胞,观察NIH3T3细胞的粘附变化,发现TPA可促进NIH3T3细胞与基质纤连蛋白的粘附,进一步研究Fn的主要受体α₅β₁整合蛋白在细胞表面含量,发现TPA作用24 h使α₅及β₁含量分别增加52.3%和51.6%.应用³H-甘露糖标记N-糖链和凝集素柱层析方法分析TPA作用后细胞N-糖链总量和组分比,结果均与对照组相仿,说明是通过增加细胞合成整合蛋白α₅及β₁亚基含量实现的.在TPA作用于细胞的同时,加入PKC抑制剂Sphingosine,发现α₅、β₁含量和细胞与Fn的粘附均回复至对照组水平,提示TPA增加α₅β₁整合蛋白合成而增加的细胞与Fn粘附作用,是由PKC介导完成的.此外还发现酪氨酸蛋白激酶抑制剂也阻断TPA增加α₅β₁整合蛋白含量的作用.     

佛波酯促进NIH3T3细胞的铺展和聚焦粘附激酶的酪氨酸磷酸化

100nmol/L佛波酯(12-O-tetradecanoylphobol-13-acetate,TPA)能明显促进NIH3T3细胞在纤连蛋白(Fn)上的铺展,该作用能分别被酪氨酸激酶(tyrosinekinase,TK)抑制剂4′,5,7-三羟基异黄酮(genistein)和蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)抑制剂calphostinC和神经鞘氨醇(sphingosine)所抑制.TPA作用于结合到Fn上的NIH3T3细胞,使其聚焦粘附激酶(focaladhe-sionkinase,FAK)的酪氨酸磷酸化程度较未处理细胞升高,于30min时达对照的204.0%,并存在浓度依赖性;该变化分别被上述抑制剂所拮抗;未经TPA处理的NIH3T3细胞和纤连蛋白结合诱导的FAK酪氨酸磷酸化亦分别被上述抑制剂所抑制.细胞松弛素D则无论TPA作用与否,都能完全阻断NIH3T3细胞的铺展和FAK的酪氨酸磷酸化.以上结果提示,TPA促进NIH3T3细胞在Fn上铺展的信号转导机制,与PKC的激活有关,进一步则可能通过影响FAK的酪氨酸磷酸化来实现,同时需要细胞骨架的参与;NIH3T3细胞和Fn结合并诱导FAK酪氨酸磷酸化的过程亦依赖于PKC和完整的细胞骨架.     

N-糖链合成抑制剂对NIH3T3细胞粘附作用和整合蛋白表达的影响

研究了Ｎ－糖链合成抑制剂——Ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ（ＤＭＭ）和衣霉素（ＴＭ）对ＮＩＨ３Ｔ３细胞粘附作用和细胞表面α５β１整合蛋白含量的影响．研究结果发现甘露糖苷酶Ⅰ抑制剂－ＤＭＭ处理ＮＩＨ３Ｔ３细胞后,３Ｈ－甘露糖（３Ｈ－Ｍａｎ）参入ＮＩＨ３Ｔ３细胞较对照细胞增加一倍,多天线复杂型糖链增加１８％,而细胞表面α５β１整合蛋白与纤连蛋白粘附能力却下降１７％,但对膜整合蛋白α５和β１亚基表达量无明显影响,提示不成熟的糖链对整合蛋白参与的细胞粘附功能有一定影响,但不影响糖蛋白运输及整合到膜上．十四糖二磷酸长萜醇合成抑制剂——ＴＭ为０．５μｇ／ｍｌ时,Ｎ－糖链合成显著抑制,３Ｈ－Ｍａｎ参入减少了５２％,细胞粘附能力下降了３７％,细胞表面膜整合蛋白α５亚基下降了２２％,而β１亚基无明显变化,提示ＴＭ的脱糖基化作用可引起α５亚基转运至细胞膜表面下降,以至影响了细胞的粘附能力．此外,脱糖整合蛋白与纤连蛋白（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ,Ｆｎ）的结合力下降也是原因之一．     

TGF-β1短时处理降低肝癌细胞与Fn的粘附及FAK的磷酸化

为了研究TGF-β1对α5β1整合蛋白所介导的信号转导通路是否有快速的信号调节作用,本文用TGF-β1短时(10min)处理SMMC7721细胞,发现当经TGFβ1预处理的细胞与Fn粘附时,细胞与Fn的粘附力下降,由Fn与整合蛋白的结合而诱导发生的FAK的酪氨酸磷酸化随着TGF-β1浓度的增加而降低。而TGF-β1短时处理并未改变整合蛋白α5、β1亚基的表达。此外,贴壁生长于培养皿的细胞的FAK磷酸化程度在TGF-β1短时处理后也下降,甚至检测不出。提示TGF-β1可能通过某种信号通路快速调节了整合蛋白与配体的亲和力以及下游信号分子FAK的磷酸化。从而影响了细胞内骨架蛋白结构的完整性,使细胞发生去极性化,有利于细胞在迁移早期的松脱。     

N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V过表达对人肝癌细胞迁移及粘附分子表达的影响

为了探讨转染N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ(GnT-V)正义cDNA后对7721细胞迁移影响及其机制,我们研究了GnT-V/7721和pcDNA3/7721(对照组)两株细胞的迁移力及其与侵袭转移能力密切相关的细胞表面重要粘附分子整合蛋白和E-钙粘蛋白的表达情况.通过琼脂滴法检测两株细胞的迁移力;间接免疫荧光法测定细胞表面整合蛋白α5和β1的含量及用RT-PCR方法检测细胞整合蛋白α5和β1的mRNA水平;免疫细胞化学ABC法检测了细胞E-钙粘蛋白表达水平;Western杂交方法检测β-连环蛋白含量.结果发现,7721细胞经转染GnT-V cDNA后,迁移力明显增高;整合蛋白α5亚基的含量比对照组增加2.9倍;β1亚基未见明显变化.α5亚基mRNA水平为对照细胞的2.1倍,β1亚基的mRNA含量无明显改变.GnT-V/7721细胞E-钙粘蛋白及β-连环蛋白表达也有不同程度的升高.本文结果提示与N-糖链加工有关的GnT-V过表达,可促进7721细胞表面整合蛋白的表达以及E-钙粘蛋白β-连环蛋白的表达,从而增加肿瘤细胞的迁移能力.     

N─糖链在细胞粘附中的作用

参与细胞与细胞,细胞与基质相互作用的细胞粘附分子均为含N─糖链的糖蛋白,N─糖链在细胞的识别、粘附过程中起一定的作用。本文就纤连蛋白、层粘连蛋白、整合蛋白、选择蛋白和凝集素受体等分子中N─糖链与细胞识别和粘附关系加以讨论。     

氯化钴对小鼠NIH3T3细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察氯化钴(Cocl2)对体外培养的小鼠NIH3T3细胞增殖和凋亡的影响.方法:首先利用MTT法和流式细胞术检测不同浓度Cocl2对小鼠NIH3T3细胞增殖及凋亡的影响.然后利用免疫印迹检测HIF-1α和凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达.结果:(1)MTT结果显示,低于250μ mol/L的Cocl2作用NIH3T3细胞24 h对细胞的增殖活力影响不大,当浓度增加到500μ mol/L以上时会明显抑制细胞的增殖活力.(2)流式细胞仪检测结果显示低浓度Cocl2(≤ 250μ mol/L)并不会引起NIH3T3细胞明显的凋亡和坏死,增加浓度(≥500μmol/L)会导致细胞早期凋亡和坏死增加.3)不同浓度Cocl2作用NIH3T3细胞24 h均可诱导细胞中HIF-1α表达上调,同时Bax/Bcl-2的比值增高.结论:高浓度Cocl2可以抑制小鼠NIH3T3细胞增殖,促进凋亡发生.     

G蛋白与整合素αⅡbβ3的双向信号转导

整合素是一类细胞表面受体家族分子,通过双向信号转导参与细胞与细胞外基质、细胞与细胞的粘附以及细胞的迁移.整合素αⅡbβ3(GPⅡb-Ⅲa)特异表达于巨核/血小板系,并且是其含量最多的膜糖蛋白,介导血小板的粘附、伸展、聚集等.G蛋白在整合素αⅡbβ3双向信号转导中发挥重要作用,其中较受关注的是:异源三聚体G蛋白和小G蛋白Rap1参与整合素αⅡbβ3的内向外信号转导;小G蛋白(Rho A、Rac等)和Gα13参与整合素αⅡbβ3的外向内信号转导.在蛋白质结构与功能关系的层面,本文总结了G蛋白的结构、分类、功能以及近年来G蛋白在整合素αⅡbβ3双向信号转导中作用的研究进展.     

PKC对小鼠受精卵发育的调控作用

为研究 TPA及 PKC的反义寡核苷酸对 1 -细胞期鼠受精卵发育的影响 ,采用免疫细胞化学法标记 PKC(α及 β亚型 ) ,并用激光扫描共聚焦显微镜测定卵内 PKC荧光强度 ;同时利用显微注射法注射 PKC的反义寡核苷酸 ,观察其对受精卵分裂的影响 . 1 0 0 μg/ L TPA对 1 -细胞期受精卵的发育具有完全抑制作用 .TPA处理 1 2 h后 ,对照组受精卵停留在 1 -细胞期 ,而未经 TPA处理的1 -细胞期卵可以分裂到 2 -细胞期 .共焦激光显示实验组与对照组相比 ,PKC(α、β亚型 )荧光强度均有下降 (P<0 .0 1 ) .显微注射 PKC antisenseα及 antisenseβ的受精卵 ,分别只有 1 4 .2 %和 3.33%的卵可以发育到 2 -细胞期 .与对照组 (注射 M2培养液 )差异显著 (P<0 .0 1 ) .结果表明 ,(1 ) TPA长期处理 1 -细胞期受精卵 ,抑制 1 -细胞期卵分裂到 2 -细胞期 ;(2 ) PKC的反义寡核苷酸 (α及β亚型 )可以抑制小鼠 1 -细胞期卵的发育     

PKCα 由线粒体向细胞核转运与胃癌细胞凋亡诱导密切相关

PKC在细胞生长、分化、凋亡和信号转导调节中具有重要作用.通过激光扫描共聚焦显微镜证实:在胃癌BGC-823细胞中,一部分PKCα 定位于线粒体,一部分定位在胞浆,细胞经TPA处理后,位于线粒体和胞浆的PKCα 向细胞核转运;Western blot检测则发现PKCα 蛋白表达水平在TPA处理前后没有发生变化.此外,应用凋亡诱导剂和特异性PKC抑制剂的实验结果进一步证实:胃癌细胞内PKCα由线粒体和胞浆向细胞核转运与细胞凋亡的诱导密切相关.提示PKCα在细胞内的定向转运可能是与细胞凋亡过程相关联的重要事件之一.     

神经节苷脂GM_3对人白血病J6-2细胞PKC转位及DAG含量的影响

应用SDS PAGE及Western印迹技术检测神经节苷脂GM3 处理前后人白血病J6 2细胞不同类型PKC在细胞内的转位情况 ,同时利用高效薄板层析技术观察了细胞内DAG含量的变化 ,从而探讨GM3 抑制PKC活性的机制 .实验发现 ,GM3 处理后胞液PKCα明显增加 ,而颗粒结合PKCα则相对减少 ;GM3 对其它亚型PKC在细胞内分布无显著影响 .同时还发现 ,GM3 处理后细胞内DAG含量降低 (P <0 0 5 ) .结果表明 ,GM3 抑制PKCα由胞浆向质膜转位 ,对其它亚型PKC在细胞内转位无影响 .提示GM3 抑制的PKC亚型可能是PKCα .同时GM3 降低细胞内DAG含量 ,这可能与GM3抑制PKCα活性机制有关     

地榆成分3,3'-二甲氧基逆没食子酸-4-木糖苷对NIH3T3细胞促增殖作用及其机制研究

本文探讨地榆成分3,3'-二甲氧基逆没食子酸-4-木糖苷(3,3'-dimethyl ellagic acid-4-xylycoside,DEAX)促进NIH3T3细胞增殖和迁移的作用及其分子机制。实验采用UPLC-DAD-TOF-MS对受试样品DEAX进行纯度分析和结构验证,然后采用MTS法考察不同DEAX浓度和作用时间对NIH3T3细胞增殖的影响;应用划痕法检测不同浓度的DEAX对NIH3T3细胞迁移能力的影响,并分别使用ELISA和qRT-PCR检测DEAX处理NIH3T3细胞的TGF-β1和I型胶原蛋白的蛋白表达和mRNA表达水平。结果表明DEAX能显著促进NIH3T3细胞的增殖和迁移,提高TGF-β1和I型胶原蛋白mRNA表达及蛋白表达水平。提示DEAX可通过调控TGF-β1和I型胶原蛋白mRNA及蛋白表达水平,以促进NIH3T3细胞增殖和迁移,为阐明地榆促创面愈合的物质基础及其机理提供了实验依据。     

N—糖链在细胞粘附中的作用

参与细胞与细胞,细胞与基质相互作用的细胞粘附分子均为含Ｎ－糖链的蛋白,Ｎ－糖链在细胞的识别、粘附过程中起一定的作用。本文就纤维蛋白、层粘连蛋白、整合蛋白、选择蛋白和凝集素受体等分子中Ｎ－糖链与细胞识别和粘附关系加以讨论。     

佛波酯对SMMC-7721人肝癌细胞粘附及整合蛋白基因表达的调控作用

用促癌剂佛波酯（ＰＭＡ）作用于ＳＭＭＣ－７７２１人肝癌细胞,研究细胞表面的主要粘附分子α５β１整合蛋白基因表达及相应细胞粘附行为的改变．用１００ｎｍｏｌ／ＬＰＭＡ作用ＳＭＭＣ－７７２１人肝癌细胞,发现其作用因时间的长短而异,作用３０、６０、１２０ｍｉｎ分别增加细胞与纤连蛋白（Ｆｎ）粘附１８．８％、３８．７％和５６．６％,作用６、１２ｈ分别降低４４．０％、３７．４％,而不影响与多聚赖氨酸的粘附．使用足量的抗α５和／或抗β１单抗预先封闭细胞与Ｆｎ的结合点,再将细胞与Ｆｎ粘附,发现α５单抗单独使用可将ＳＭＭＣ－７７２１细胞与Ｆｎ的粘附抑制２０％左右,β１单抗则抑制１４％,两者联合使用时可封闭４０％左右的粘附,提示该细胞表面存在除α５β１外的其它整合蛋白在介导着细胞与Ｆｎ的粘附．进一步应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ方法,分析整合蛋白基因表达,发现１００ｎｍｏｌ／ＬＰＭＡ抑制α５亚基转录,以３０ｍｉｎ最明显,抑制达８３．１％,作用６、１２ｈ抑制率仍为４６．６％、４３．６％．还就ＰＭＡ影响细胞粘附和整合蛋白基因表达的可能机理作了讨论．     

视黄酸促进NIH3T3细胞与纤连蛋白粘附的机制研究

视黄酸（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ,ＲＡ）是细胞的分化诱导剂。近年来发现ＲＡ能广泛作用于细胞,引起一系列生理功能改变,并能使多种肿瘤细胞向正常细胞分化。ＲＡ对细胞基本生物学行为－细胞粘附的影响了解甚少。我们发现３２μｍｏｌ／Ｌ ＲＡ能使ＮＩＨ３Ｔ３细胞与纤维蛋白（ＦＺｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ,Ｆｎ）的粘附能力增加２０％。但并不促进细胞与多聚赖氨到的粘附。采用抗整合蛋白α５亚基单抗和抗整合蛋白β１亚基单     

大鼠海马内注射β淀粉样蛋白诱导外周血T细胞MIP-1α过表达及其穿过血脑屏障

为观察脑内β淀粉样蛋白(amyloidbeta,Aβ)沉积对外周血T细胞穿过血脑屏障的影响,通过立体定位仪将Aβ1～42肽注射到大鼠双侧海马(以Aβ42～1反序列肽为对照),实时定量PCR(RT-qPCR)检测发现,Aβ1～42上调了外周血T细胞中巨嗜细胞炎症蛋白(macrophageinflammatoryprotein-1α,MIP-1α)的表达,同时免疫荧光分析显示,脑内的Aβ1～42也引起了脑微血管内皮上MIP-1α受体(CCR5)的表达增加,以及伴随的脑实质内T细胞数量的增加.然而,大鼠腹腔内注射抗MIP-1α中和抗体则阻断了Aβ1～42所致的脑内T细胞数量的增加.提示脑内Aβ沉积能诱导外周血T细胞MIP-1α依赖性迁移入脑.     

肝癌细胞67kD层粘连蛋白受体N-糖链结构与功能的变化

探讨肝癌细胞与正常肝细胞 6 7kD层粘连蛋白受体 (6 7LR)N 糖链结构与功能的差异 .采用流式细胞术检测SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞膜表面 6 7LR的表达 ,并分别从这 2株细胞分离纯化到高亲和力的 6 7LR ,利用凝集素结合分析其糖链结构 ,并用肽 N 糖苷酶水解N 糖链 ,观察糖链在与层粘连蛋白结合过程中的作用 .结果发现 ,L 0 2细胞膜表面 6 7LR表达的阳性率为5 5 3% ,而SMMC 772 1细胞为 34.7% ,这两株细胞 6 7LR与伴刀豆素 (ConA)的结合能力无显著差异 ,但SMMC 772 1细胞的 6 7LR与麦胚凝集素的结合能力明显高于L 0 2细胞的 6 7LR ,说明 2株细胞 6 7LR的糖链结构存在显著差异 .当N 糖链被切除后 ,SMMC 772 1细胞的 6 7LR与层粘连蛋白的结合能力明显下降 ,而L 0 2细胞则没有变化 .这些资料表明 ,SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞与层粘连蛋白结合能力的差别 ,以及两株细胞的 6 7LR与层粘连蛋白结合能力的不同 ,很可能是由于这两株细胞的层粘连蛋白受体的N 糖链结构不同所引起     

整合蛋白α5β1过表达诱导人肝癌细胞SMMC-7721“失巢凋亡”机理

为了进一步阐明整合蛋白α5 β1过表达诱导非粘着状态的人肝癌细胞SMMC 772 1失巢凋亡的机理 ,利用poly HEME阻断细胞贴壁 ,诱导失巢凋亡 ,在poly HEME包被的 96孔板中检测细胞生存率 .利用Western印迹法检测了与细胞信号转导密切相关的粘着斑激酶 (FAK)、蛋白激酶B(PKB)及生存蛋白survivin的表达水平 .α5 β1过表达细胞株在去粘附状态下的生存率明显低于对照细胞 .在生长 8d时 ,以整合蛋白不同亚单位转染的α5 β1 772 1、β1 772 1和α5 772 1细胞 ,活细胞数分别降至对照组的 4 0 %、4 5 %和 83% .这说明整合蛋白α5 β1过表达细胞株 ,特别是α5 β1 772 1和 β1 772 1细胞的失巢凋亡明显加快 .细胞悬浮生长 2 4h后 ,α5 β1过表达细胞株都有不同程度的凋亡发生 ;同时粘着斑激酶 (FAK)和蛋白激酶B(PKB)表达量及其磷酸化水平均低于对照细胞 ,而survivin表达水平在α5 β1 772 1中最高 ,在 β1 772 1中最低 .在给予天然细胞外基质纤粘连蛋白的条件下 ,α5 β1 772 1和 β1 772 1细胞的FAK和PKB的磷酸化水平却呈升高趋势 .结果说明 ,FAK和PKB的变化与细胞的粘附状态密切相关 ,并且参与整合蛋白α5 β1过表达细胞在去粘附状态下失巢凋亡的发生 .     

胃癌细胞中视黄酸受体抑制AP-1活性的不同方式

 研究胃癌细胞中视黄酸受体RARα和RARβ抑制活化蛋白 1(activatorprotein 1,AP 1)活性的不同方式及其与全反式视黄酸 (ATRA)作用的相关性 .瞬时转染RARβ表达载体到MKN 4 5细胞后 ,佛波脂 (TPA)诱导的AP 1活性受到明显抑制 ,且与RARβ浓度正相关 ,与ATRA存在与否无关 ;相反 ,RARα转染细胞后 ,对TPA诱导的AP 1活性的抑制不仅与RARα的浓度相关 ,而且依赖于AT RA .凝胶阻抑测定表明 ,TPA可以显著加强AP 1结合活性 ,当ATRA处理不表达RARβ和低表达RARα的MKN 4 5细胞后 ,AP 1结合活性不受影响 ;然而 ,表达RARα和RARβ的BGC 82 3细胞经AT RA处理后 ,TPA诱导的AP 1结合活性则受到抑制 .另外 ,分析与抗AP 1活性相关的RARβ功能区表明 ,DNA结合区的缺失导致RARβ抑制AP 1活性作用的丧失 ,而配体结合区对于RARβ抑制AP 1活性则是非必需的 .以上结果证实 ,有胃癌细胞中 ,RARβ可能是AP 1活性的抑制因子 ,RARα则可能是ATRA作用的靶向 .尽管它们的作用方式有所不同 ,但最终都可以通过抑制AP 1活性来抑制胃癌细胞生长