西方许旺酵母α-淀粉酶的基因克隆及其在啤酒酵母中的高效表达与分泌

以E .coli/yeast穿梭质粒YCEp1为载体构建许旺酵母部分基因组文库 ,在大肠杆菌中扩增后提取混合质粒DNA ,经电转化非缺陷标志啤酒酵母AS .2 1 36 4 ,在YPDS平板 ( 1 %葡萄糖和 1 %可溶性淀粉 )上用淀粉水解活力筛选含水解淀粉能力的阳性转化子 .从阳性转化子中分离融合质粒证实含 5 0kb的插入片段 .用α 淀粉酶基因两端序列设计的引物PCR扩增及扩增片段序列分析证实该片段中含有α 淀粉酶全部编码序列 .该片段能在啤酒酵母中表达α 淀粉酶 ,说明该片段带有α 淀粉酶基因 5′ 上游序列和 3′ 下游序列 .该转化子在YPDS平板 30℃培养 48h形成清晰可见的水解淀粉圈 .发酵液 (YPDS) 48℃可获得 740～ 780mU/mL产酶活力和高的生物量 .PAGE证实发酵液有α 淀粉酶蛋白带 ,占胞外总蛋白含量的 1 2 %以上 .说明在载体YCEp1上许旺酵母α 淀粉酶基因自身启动子 ( promoter)和终止子(terminator)在啤酒酵母AS .2 .1 36 4中同样被识别且高效表达 .有工业应用前景的水解淀粉酵母菌株构建成功 .     

酵母菌中质粒DNA的快速检测

随着基因工程研究的发展,近年来酵母质粒作为基因工程载体的研究已获得明显进展。因此,开展酵母质粒DNA快速检测方法的研究,将是很有意义的。目前质粒在啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中研究较多。1982年龚启蕙等报道了啤酒酵母7209—1A及1984     

α淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌

将地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶cDNA重组进大肠杆菌-酵母穿梭质粒,转化酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母工程菌。酶活力测定和酶学性质分析的结果显示:在酵母MF-α1因子及磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止信号的调控下,α-淀粉酶和糖化酶基因在酵母中获得高表达并向胞外分泌这两种酶。构建的酵母工程菌在含10％淀粉的培养基中6天内能水解97％的淀粉,重组质粒能在酵母中较稳定地存在。     

具有a-淀粉酶分泌活性以及低双乙酰产量的啤酒酵母工程菌的构建

扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)因具有较强的a-淀粉酶以及葡聚糖酶活性, 使其在以淀粉为唯一碳源的培养基上能够良好的生长。从其基因组中克隆了a-淀粉酶的编码区, 构建了由酵母磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子、酿酒酵母a-因子信号序列以及扣囊复膜酵母a-淀粉酶基因编码序列组成的基因表达盒。将该表达盒插入到质粒pPLZ-2的ILV2基因序列内部, 使其两翼具有ILV2基因的同源区。将该表达盒通过同源重组的方式整合到啤酒酵母工业菌株YSF-5的a-乙酰乳酸合成酶(AHAS)基因ILV2内部。在以淀粉为唯一碳源的培养基上进行转化子的筛选。通过多对引物PCR、a-淀粉酶活性以及AHAS活性分析对转化子进行鉴定, 得到一株具有a-淀粉酶分泌表达活性、较低AHAS活性, 并且发酵液中双乙酰产量也相对较低的啤酒酵母工程菌。该菌株在非选择压力条件下连续培养50代后仍然保持其遗传稳定性。还对pH、温度以及金属离子对该转化菌株的a-淀粉酶活性的影响进行了研究。由于所构建的菌株不含有非酵母来源的DNA, 所以生物安全性相对较高, 对酵母育种以及啤酒生产工业都具有较为重要的意义。     

具有a-淀粉酶分泌活性以及低双乙酰产量的啤酒酵母工程菌的构建

扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)因具有较强的a-淀粉酶以及葡聚糖酶活性, 使其在以淀粉为唯一碳源的培养基上能够良好的生长。从其基因组中克隆了a-淀粉酶的编码区, 构建了由酵母磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子、酿酒酵母a-因子信号序列以及扣囊复膜酵母a-淀粉酶基因编码序列组成的基因表达盒。将该表达盒插入到质粒pPLZ-2的ILV2基因序列内部, 使其两翼具有ILV2基因的同源区。将该表达盒通过同源重组的方式整合到啤酒酵母工业菌株YSF-5的a-乙酰乳酸合成酶(AHAS)基因ILV2内部。在以淀粉为唯一碳源的培养基上进行转化子的筛选。通过多对引物PCR、a-淀粉酶活性以及AHAS活性分析对转化子进行鉴定, 得到一株具有a-淀粉酶分泌表达活性、较低AHAS活性, 并且发酵液中双乙酰产量也相对较低的啤酒酵母工程菌。该菌株在非选择压力条件下连续培养50代后仍然保持其遗传稳定性。还对pH、温度以及金属离子对该转化菌株的a-淀粉酶活性的影响进行了研究。由于所构建的菌株不含有非酵母来源的DNA, 所以生物安全性相对较高, 对酵母育种以及啤酒生产工业都具有较为重要的意义。     

利用枯草杆菌α-淀粉酶分泌载体合成和分泌具有生物活性的鼠β干扰素

经BAL31酶消化除去信号序列的鼠β-干扰素(IFN-β)cDNA,引入到用枯草杆菌α-淀粉酶基因的启动子和信号序列所构造的一个枯草杆菌分泌载体中。把得到的嵌合质粒转移进枯草杆菌207-25中。采用菌落杂交和一种新的、用于分泌蛋白质的免疫印迹方法选出四株卡那霉素抗性转化株。这些转化株把与羊抗-IFN-β血清起交叉 反应的蛋白分泌到培养基中去。用L细胞和水泡性口膜炎病毒系统检测,其中一株表达一种高IFN-β活性,而其它三株表现弱的或没有IFN-β活性。基于我们先前的研究[Ohmura等人,Nucl.Acids Res.12(1984)5307-5319],认为这种分泌的IFN分子是杂种蛋白,在这分子中,NH_2-末端区域由一部分α-淀粉酶信号肽组成。核苷酸序列分析指出:表达高IFN活性的pTUB502质粒是与来自鼠的成熟蛋白质的密码子位置6的IFN-β基因连接。其它三个质粒,pTUB506、pTUB509和pTUB519分别含有来自密码子位置3,1和5的鼠IFN-β基因。鼠IFN-β的NH_2-未端区域似乎与它的生物活性紧密相关。     

大麦α-淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌

将大麦α 淀粉酶和黑曲霉糖化酶cDNA重组进同一大肠杆菌 酵母穿梭质粒构建含双基因的表达分泌载体 pMAG1 5 .用原生质体转化法将 pMAG1 5引入酿酒酵母 (S .cerevisiae  GRF1 8) ,在酵母PGK基因的启动子和转录终止信号及本身的信号序列的调控下 ,实现大麦α 淀粉酶和糖化酶的高效表达 ,99%以上的酶活力分泌至培养基中 .构建的酿酒酵母菌株GRF1 8( pMAG1 5 )在含 1 5 %可溶性淀粉的培养基中 ,培养 47h能水解 99%的淀粉 ,并能发酵产生酒精     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶基因在工业啤酒酵母中的整合和表达

用PCR合成的瑞氏木霉（T.reesei）β-内切葡聚糖酶Ⅰ（EGⅠ）的cDNA, 构建了由酵母醇脱氢酶 （ADH1）启动子和终止子引导表达、β-内切葡聚糖酶自身信号肽序列引导分泌、由酵母rDNA序列引导同源整合的酵母YIP型β-内切葡聚糖酶表达分泌质粒pA15PET。采用pA15PET与酵母YEP型G418抗性表达质粒的共转化,将EGⅠ表达单元整合到已整合有α-乙酰乳酸脱羧酶（α-ALDC）表达单元的啤酒酵母工程菌BE9711的染色体rDNA序列中,获得同时表达胞内α-ALDC和胞外β-内切葡聚糖酶的啤酒酵母工程菌。     

α－淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌

将地衣芽孢杆菌α－淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶cDNA重组进大肠杆菌．酵母穿梭质粒,转化酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母工程菌。酶活力测定和酶学性质分析的结果显示：在酵母MF—αl因子及磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止信号的调控下,α－淀粉酶和糖化酶基因在酵母中获得高表达并向胞外分泌这两种酶。构建的酵母工程菌在含10％淀粉的培养基中6天内能水解97%的淀粉。重组质粒能在酵母中较稳定地存在。     

黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌

从黑曲霉糖化酶高产株T2l合成的糖化酶cDNA,经5’端和3’端改造后克隆到酵母质粒YFDl8上,转化酿酒酵母。转化子的淀粉培养基平板检测,培养滤液蛋白电泳和糖化酶活力分析都表明,含有糖化酶基因表达质粒的酵母转化子能有效地分泌有功能的糖化酶到细胞外。实验证明酵母a园子启动子和分泌信号序列能促使黑曲霉糖化酶cDNA在酵母中表达和分泌．实验还表明．黑曲霉糖化酶原的翻译后加工序列很可能亦能被酵母识别,加工生成有功能的成熟的糖化酶。以上成功为构建有实用意义的淀粉水解酵母工程菌迈出了重要的一步。     

工程细菌大量生产淀粉酶

据英国专利报导,通过细菌供体劈开的DNA,继之与一种载体DNA片段结合,制备含有淀粉酶基因的重组DNA[注:载体指的是由质粒或λ噬菌体衍生物所组成]。所得含有重组DNA的无性系,可用作α-淀粉酶、β-淀粉酶或支链淀粉酶的生产。作者     

超耐热酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在酵母细胞中的表达

用PCR方法扩增来源于极端嗜热厌氧古菌Pyrococcus furiosus中的超耐热酸性α-淀粉酶的结构基因,将该结构基因引入载体pPIC9K中,将重组质粒pPIC9K-Amy转化大肠杆菌DH5α细胞,测序结果表明,克隆到的α-淀粉酶结构基因为1305bp,其编码的成熟肽为435个氨基酸。将正确构建的重组质粒转化毕赤酵母GS115细胞,得到酵母工程菌株。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,超耐热酸性α-淀粉酶在甲醇酵母中大量表达并分泌到胞外,该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导,随着诱导培养时间的增加,在培养基上清液中的单位体积酶活力相应上升,在诱导培养7d后酶活力达到最大值。该酶最适反应温度为90~100℃,最适反应pH值为4.5~5.5。该酶具有非常好的温度稳定性,在100℃条件下热处理5h,仍具有60%以上的酶活力。该酶的这些优点使其非常适于在工业生产上应用。     

坚强芽孢杆菌β-淀粉酶基因的核苷酸序列分析

淀粉水解酶广泛用于淀粉加工业中,何秉旺等在选育产耐热β-淀粉酶菌株中得到一株坚强芽孢杆菌（Bacillusfirmus）725,该菌株产生的淀粉酶有较好的热稳定性,水解淀粉的主要产物为麦芽糖。自然菌株产生的淀粉酶往往是多种淀粉酶的混合,为进一步研究该菌株产生的淀粉酶的性质和在工业上应用的可能性,分离了三个淀粉酶基因,在大肠杆菌中克隆和表达[1]。其中重组质粒pBA150产生的淀粉酶的淀粉水解产物主要是麦芽糖［1］。Β-淀粉酶（EC.3．2.1．2）水解淀粉的主要产物是麦芽糖,工业上可用于生产高麦芽糖浆,近年来又有β-淀粉酶用于啤酒工业的报道[2]。本文报道重组质粒pBA150的β-淀粉酶基因的序列分析及推导出的氨基酸序列同己知β-淀粉酶的氨基酸序列比较。     

一个从顶头孢霉中筛选具有启动子功能的DNA片段的简便方法*

利用大肠杆菌-酵母穿梭质粒pGBT9构建了一个真菌启动子捕获载体pGBT14,用这个捕获载体构建了含顶头孢霉的0.5-2.0kb片段的染色体DNA文库,并从中筛选到顶头孢霉的24个DNA片段,这些片段能够在啤酒酵母中启动Trp1基因的表达。     

臭腹腺蝗肠道中共存的淀粉和纤维素消化酶的纯化、动力学和抑制研究（英文）

【目的】本研究旨在了解臭腹腺蝗 Zonocerus variegatus 中碳水化合物的消化。【方法】依次通过CM-Sepharose CL-6B 阳离子交换、QAE Sephadex A-50阴离子交换以及Sephadex G-100凝胶过滤,对臭腹腺蝗中肠的酶粗提取液（其中α-淀粉酶和纤维素酶的比活性分别为283±1.72 U/mg和 17±0.83 U/mg）进行了纯化。最后通过层析将共存的酶分离成α-淀粉酶和纤维素酶。【结果】这两种酶都是单体,α-淀粉酶分子量为38 kDa ,纤维素酶分子量为21 kDa。α-淀粉酶对淀粉的K_m 值为 13.8±1.29 mg/mL,V_max为3 883±52.25 U/mg pro;而纤维素酶对羧甲基纤维素底物的 K_m 值为5.03±0.57 mg/mL ,V_max为433.00±5.24 U/mg pro 。臭腹腺蝗α-淀粉酶能以不同的效率水解原淀粉,纤维素酶也能不同程度水解各种纤维材料。α-淀粉酶的水解活性在pH 6和40℃下最高,而纤维素酶的水解高活性在pH 9和45℃下最高。【结论】 从番木瓜 Carica papaya 种子中分离到蛋白类抑制剂,发现它们是这两种酶的有效抑制剂,说明这些蛋白抑制剂(CpAI和 CpCI)如果在害虫取食的作物上过量表达,则可能有利于害虫防治。尽管纤维类和淀粉类物质可能都显著提供该害虫的能量需求,但是动力学分析表明臭腹腺蝗更偏向于淀粉类食物。     

戊型肝炎病毒开放读框2的克隆及表达载体的构建

戊型肝炎病毒（HEV）为单股正链RNA病毒,整个基因组有3个开放性阅读框架（ORF）,ORF2（全长约1.98kb）是主要结构基因编码区。将经过PCR获得的ORF2基因插入非分泌型酵母穿梭质粒pPIC3,构成受醇氧化酶（AOX2）的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,重组质粒经酶切线性化后转化酵母细胞GS115,经过鉴定可挑取与酵母染色体发生交换的重组体,用于进一步的真核表达。     

黑曲霉酸性α-淀粉酶基因和糖化酶基因对工业酒精酵母的整合及其共表达

用PCR合成的黑曲霉 (Aspergillusniger)酸性α 淀粉酶 (Acidα amylase)的cDNA ,构建了由酵母醇脱氢酶(ADH1 )启动子和终止子引导表达 ,酸性α 淀粉酶自身信号肽序列引导分泌的表达元件 ,与黑曲霉糖化酶cDNA的表达元件同时插入由酵母rDNA序列引导同源整合的酵母YIp型表达载体pWHY中 ,构成双基因表达分泌质粒pWAG。采用pWAG与酵母YEp型G4 1 8抗性表达质粒的共转化 ,将两个基因表达元件整合到酒精生产酵母菌株AS2 346的染色体rDNA序列中 ,获得同时表达胞外酸性α 淀粉酶和糖化酶的双功能酒精酵母工程菌     

地衣形芽孢杆菌热稳定α淀粉酶基因的克隆及其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达

利用λ噬菌体作为运载体,在大肠杆菌中从直接鸟枪法分离出编码地衣形芽孢杆菌热稳定α-淀粉酶的基因。将含有α-淀粉酶基因的片段再克隆进pBR322,并测定了它的限制性图谱。头肠杆菌克隆子所产生的α-淀粉酶保留了地衣形芽孢杆菌酶的热稳定性。检定了在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中这二基因产物的表达及性质。     

西方许旺酵母α-淀粉酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的分泌表达

目的:将带有完整自身信号肽的西方许旺酵母α-淀粉酶基因克隆到大肠杆菌中,验证西方许旺酵母α-淀粉酶基因能否在大肠杆菌中有效表达。方法:利用PCR扩增带有完整自身信号肽的西方许旺酵母α-淀粉酶基因,并将其接入Zeocin启动子片段,构建了重组表达载体GapZA,转化大肠杆菌,验证得到的阳性克隆菌株是否表达α-淀粉酶活性。结果:阳性克隆菌株均有α-淀粉酶活性。结论:证明了许旺酵母α-淀粉酶能在自身信号肽引导下分泌到大肠杆菌细胞外,并且表现出明显酶活。     

提高芽孢杆菌蛋白质的产量

α-淀粉酶是淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)分泌的一种蛋白质,人们想从这种菌获得更大的α-淀粉酶,就把编码这类蛋白质的某个基因的多拷贝连接到芽孢杆菌PUB110质粒上。把这个携带基因多拷贝的质粒插入到某个芽孢杆菌中,主要是插入到枯草芽孢杆菌