抗Trx单克隆抗体用于血吸虫病诊断的研究

目的：建立双抗体夹心ELISA 法检测日本血吸虫硫氧还蛋白（Thioredoxin,Trx）。方法：用重组日本血吸虫Trx（rTrx）蛋白免疫BALB/c 小鼠,筛选高滴度、高特异性的单克隆抗体建立双抗体夹心ELISA法。通过检测日本血吸虫排泄- 分泌物（excretorysecretions,ES）与rTrx的浓度评价该方法的敏感性;通过对健康人血清的检测确定其特异性;通过对布氏姜片吸虫病、华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、囊虫病患者血清进行交叉反应试验,评价该方法的特异性。结果：获得2 株稳定分泌抗rTrx 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为McTrx1 和McTrx2。以McTrx1 为包被抗体,HRP-McTrx2 为酶标抗体,建立的双抗体夹心ELISA 可检测出ES的最低浓度为4.8 μg/ml,检测出rTrx 的最低浓度为1.2 滋g/ml。该方法的特异性为96 %。结论：以抗rTrx 蛋白单克隆抗体McTrx1 与McTrx2为基础建立的双抗体夹心ELISA 法具有较高的特异性。     

HIV感染早期病毒p24蛋白的检测

目的:建立敏感、特异的检测血清中HIV-p24蛋白的方法,作为HIV感染早期即窗口期的监测手段。方法:用纯化的p24蛋白免疫小鼠及家兔,获得单克隆及多克隆抗体,经DEAE-52阴离子交换柱纯化后,标记辣根过氧化物酶,建立ELISA双抗体夹心及间接双抗体夹心方法,检测HIV-p24蛋白。结果:包被单抗、标记多抗或包被多抗、标记单抗,均能特异地检出系列稀释的p24蛋白,包被混合单抗较包被多抗更敏感;经标记的抗种属抗体放大可明显提高检测的敏感性。结论:建立了敏感、特异的检测p24蛋白的双抗体夹心法,间接放大方法可检出50pg/mL的HIV-p24蛋白,检测敏感性与国际同类产品相似。     

抗 Trx 单克隆抗体用于血吸虫病诊断的研究 *

摘要 目的： 建立双抗体夹心 ELISA 法检测日本血吸虫硫氧还蛋白 （Thioredoxin,Trx ）。方法： 用重组日本血吸虫 Trx （rTrx ） 蛋白免 疫 BALB/c 小鼠, 筛选高滴度、 高特异性的单克隆抗体建立双抗体夹心 ELISA 法。通过检测日本血吸虫排泄 - 分泌物 （ excretorysecretions,ES ） 与 rTrx 的浓度评价该方法的敏感性; 通过对健康人血清的检测确定其特异性; 通过对布氏姜片吸虫病、 华支睾吸虫 病、 卫氏并殖吸虫病、 囊虫病患者血清进行交叉反应试验, 评价该方法的特异性。 结果： 获得 2 株稳定分泌抗 rTrx 蛋白单克隆抗体 的杂交瘤细胞株, 命名为 McTrx1 和 McTrx2。以 McTrx1 为包被抗体, HRP-McTrx2 为酶标抗体, 建立的双抗体夹心 ELISA 可检 测出 ES 的最低浓度为 4.8 μg/ml, 检测出 rTrx 的最低浓度为 1.2 μg/ml。 该方法的特异性为 96%。 结论： 以抗 rTrx 蛋白单克隆抗体 McTrx1 与 McTrx2 为基础建立的双抗体夹心 ELISA 法具有较高的特异性。     

定量检测囊性纤维化跨膜传导调节因子BA-ELISA方法的建立与评价

目的:建立一种定量检测囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的生物素-亲和素ELISA(BA-ELISA)方法并评价其可靠性。方法:优选设计CFTR三个表位的大肠杆菌表达抗原,免疫新西兰白兔获得CFTR多克隆抗体,用纯化后的抗体包被酶标板,并用生物素对其标记,从人精子提取CFTR作为抗原,用辣根过氧化物酶偶联的亲和素检测,优化两种抗体浓度及实验参数,建立可定量检测CFTR蛋白的双抗体夹心BA-ELISA方法;用临床精子标本评估所建立方法的重复性、特异性等。结果:CFTR包被抗体和生物素化CFTR抗体最适浓度分别为4μg/ml和10μg/ml,最佳封闭液为1%BSA-PBST,抗原与包被抗体最佳反应时间60 min,底物显色最佳时间15 min。批内、批间变异系数分别为2.16%~9.23%和2.29%~11.71%,包被的CFTR抗体与精子胞浆蛋白无交叉反应,最低检出下限为0.15 ng/ml,标准反应曲线具有良好的线性关系R2=0.962。结论:成功创建了定量检测CFTR蛋白的ELISA方法,具有特异性强、灵敏度高等特点。     

牛血清蛋白酶联免疫检测试剂盒的研制及验证

为研制酶联免疫试剂盒以检测病毒性疫苗中残余牛血清蛋白(BSP)含量,制备高效价高纯度的兔抗BSP多克隆抗体作为包被抗体和酶标抗体,建立了ELISA双抗体夹心法并组建试剂盒,通过标准剂量曲线可对样品中所含BSP、BSA及B-IgG进行定量,经验证该方法标准曲线线性范围内r≥0.98,对BSP的检测限量为3ng/ml;分别检测5、10、20ng/ml含量的BSP时,试验内(n=12)和试验间(n=3)测定的变异系数在3.71%到7.29%之间,回收率在93.4%~106.3%,未见该方法与人血清白蛋白、卵清蛋白以及疫苗复合保护剂之间有交叉反应。该法敏感度高,准确性、重复性和稳定性好,可用于疫苗牛血清残余蛋白的质量控制。     

双抗体夹心ELISA定量检测IFNβ-HSA融合蛋白方法的建立

为了建立β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白(IFNβ-HSA)的酶联免疫定量分析方法,以抗IFNβ单克隆抗体为包被抗体,IFNβ-HSA融合蛋白为夹心抗原,辣根过氧化酶(HRP)标记抗HSA单克隆抗体为检测抗体,建立了一种定量测定IFNβ-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法.并进行了检测限、精密度、准确度和稳定性等方法学考核.结果表明,包被抗体和检测抗体的最佳工作浓度均为2μg/ml,抗原浓度在51.88-3320 ng/ml范围内呈良好线性关系,相关系数R2>0.99.检测限为10ng/m1.经方法学考核,批内、批间变异系数分别为4.86%和8.08%,回收率为91.9%～110.4%,与IFN-B、IFN-α、HSA、IFNα2b-HSA基本无交叉反应.健全性分析表明发酵液稀释倍数对该方法无影响,8 d连续检测标准曲线表明稳定性良好.这种定量检测IFNβ-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法,灵敏度高,重复性好,为当前融合蛋白发酵优化、分离纯化研究提供了定量检测的方法,并为后期药代动力学、临床研究提供了思路和备选方法.     

ELISA法检测H3N2亚型流感病毒Vero细胞适应株

目的:流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/1/2005va(H3N2)是一株以Vero细胞为培养基质能高产的病毒株,可用于制备以Vero细胞为基质的流感病毒裂解灭活疫苗;通过在低温下连续传代培养,可选育出流感病毒Vero细胞冷适应株,用于制备Vero细胞流感病毒减毒活疫苗为了便于对Vero细胞冷适应株的进一步研究,建立一个检测该病毒株的ELISA方法.方法:以流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/1/2005Va (H3N2)的纯化抗原为免疫原制备羊抗A/Yunnan/1/2005Va (H3N2)和鸡抗A/Yunnan/1/2005Va (H3N2)的抗血清.将抗血清先后经硫酸铵沉淀法和Protein G亲和层析柱纯化后,以纯化的羊抗A/Yunnan/1/2005Va(H3N2) IgG为包被抗体,鸡抗A/Yunnan/1/2005Va(H3N2) IgG为第二抗体,测定包被抗体、第二抗体和酶标抗体最佳工作浓度,建立双抗体夹心ELISA检测方法.结果:羊抗A/Yunnan/1/2005Va (H3N2) IgG的最佳工作浓度为5μg/mL,鸡抗A/Yunnan/1/2005Va(H3N2) IgG的最适浓度为10 μg/mL,酶标抗体最佳稀释倍数为1∶4000.对已知的阳性样品,经双抗体夹心ELISA法测定的病毒滴度比血凝方法测定病毒滴度灵敏度高.结论:通过测定包被抗体、第二抗体和酶标抗体最佳工作浓度,建立了双抗体夹心ELISA检测流感病毒Vero细胞适应株病毒含量的方法.该方法操作简单、方便快速、敏感性高,可应用于Vero细胞冷适应株选育时对流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/1/2005va(H3N2)的检测,对于研制Vero细胞流感减毒活疫苗有重要意义.     

bar基因表达蛋白单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立

通过原核表达诱导bar基因表达蛋白,通过表达蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、筛选克隆,获得一个杂交瘤细胞株。以兔多抗作为捕获抗体,鼠单抗作为示踪抗体,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG作为检测系统,建立了转基因植物bar基因检测双抗夹心ELISA方法,试验证明利用该抗体建立的ELISA检测方法含有转bar基因的转基因玉米成分具较好的特异性和灵敏度。为转基因成分的检测提供了安全、快速、准确的技术手段。     

MDCK细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的建立检测犬肾细胞(madin-darby canine kidney, MDCK)宿主细胞蛋白(host cell protein, HCP)含量的双抗体夹心ELISA。方法从MDCK细胞中提取细胞总蛋白,免疫新西兰兔制备兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体,抗体经辛酸-硫酸铵沉淀和Protein A层析纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,Western blot检测抗体特异性。用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,并采用改良过碘酸钠标记法制备酶标抗体,建立ELISA并确定包被抗体浓度和辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体稀释度等最适条件。确定该方法较佳的线性范围及检测限,并对该法特异性、准确度、精密性和重复性进行验证。最后,用该方法分别对接种流感病毒的MDCK细胞上清收获液和纯化样品进行MDCK细胞蛋白含量检测,初步验证其在纯化工艺开发中的适用性。结果通过免疫新西兰兔制备了高滴度的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体血清,滴度可达1∶8 000。纯化后的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体纯度>90%,并可与MDCK细胞蛋白特异性结合。建立的双抗体夹心ELISA的理想包被抗体质量浓度为10μg/mL,酶标抗体的工作浓度为1∶500稀释。该方法的线性范围为50~2 500 ng/mL,检测限为50 ng/mL;该方法对Vero细胞、293T细胞和Mrc-5细胞等其他细胞HCP无交叉反应,特异性良好;不同浓度的MDCK细胞HCP回收率在98.5%~111.9%之间,变异系数均<10%。接种流感病毒的MDCK细胞培养上清经多步纯化后MDCK细胞蛋白质量浓度逐渐降低至<900 ng/mL,纯化工艺可有效去除MDCK细胞蛋白残留。结论建立双抗体夹心ELISA检测MDCK细胞残余HCP含量的方法,可用于基于MDCK细胞培养的流感疫苗下游工艺开发中宿主细胞残留HCP含量监测。     

抗HIV-p24单克隆抗体细胞株的建立及初步应用

拟建立抗HIV-P24蛋白的单克隆抗体细胞株及双抗体夹心法,用于检测艾滋病人血清中的P24抗原。用纯化的基因工程表达的HIV-P24蛋白免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤Sp2/0的细胞融合,有限稀释法克隆细胞,ELISA筛选特异性抗体。结果克隆筛选出12株细胞,初步建立了检测HIV-P24抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验。本方法为监控艾滋病病毒感染的窗口期和艾滋病病人临床治疗效果提供了检测手段。