核糖开关的研究及应用

核糖开关是一类自然界中天然存在的适配子,通过结合小分子代谢物调控基因的表达。它位于特定的mRNA非编码区,可以不依赖任何蛋白质因子而直接结合代谢物并发生构象变化,在转录和翻译水平上参与调控生物的基本代谢途径。目前已知核糖开关不仅广泛存在于细菌的代谢相关基因中,还存在于某些真菌和植物中。对核糖开关的深入研究将为基因功能研究、生物传感器研发以及新型抗菌药物开发等提供新的途径。     

核糖开关与基因表达调控

核糖开关(riboswitch)是近几年基因表达调控研究的一个热点.核糖开关位于mRNA的非翻译区(untranslated regions, UTR),能够直接感受胞内外信号并引起自身二级结构的变化,在转录或后转录（翻译和mRNA稳定性）水平实现对下游相关基因的表达调控,该过程不依赖于包括蛋白质在内的其它任何因子的作用. 根据现已发现的核糖开关所能识别的信号因子类型,可以将其分为4类,即小分子代谢物、金属离子、环境因素及空载tRNA敏感的核糖开关;其中,小分子代谢物敏感的核糖开关是发现和研究最多且最深入的一类. 随着研究的深入,将会有更多的核糖开关被发现,这不仅有助于理解生物进化与环境适应性,而且在生物学基础研究,新型药物的开发以及工业生产领域都将发挥重要作用.     

核糖开关的结构和调控机理

一种新发现的RNA分子——核糖开关,通过感知代谢物浓度的变化调控目标基因的表达。它可以调整自身的结构直接结合代谢物小分子,而不需要蛋白因子的参与。在原核生物中发现了大量的核糖开关,在真核生物如植物和真菌中也发现了核糖开关。核糖开关由适体域和表达平台两个功能域组成,能在不同水平调控基因的表达,如转录终止、翻译起始、mRNA剪辑和加工。核糖开关不需要蛋白因子的参与,因此人们认为它可能是古代RNA世界的遗留物。核糖开关作为RNA传感器可以设计成一种基因控制元件,在未来的基因治疗方面可能具有很大的应用前景。     

细菌中黄素单核苷酸核糖开关研究进展

核糖开关(Riboswitch)具有RNA结构,是位于mRNA 5′非编码区的RNA传感器。在无任何蛋白质因子参与下,可特异性地直接结合代谢产物,使自身构象发生相应变化,启动或阻断mRNA的转录、翻译、拼接等过程来调控基因的表达。某些Riboswitch可应用于抗菌药物研发。本文综述了Flavin mononucleotide riboswitch(FMN riboswitch)三维结构、基因表达调控的机制及热力学、动力学的研究进展,为基于FMN riboswitch的合理药物设计奠定了基础,并对开发新一代抗菌药物进行了展望。     

新型基因表达调控元件——人工核糖开关的构建及筛选

核糖开关作为一种新发现的RNA元件,可以高效、准确、快速地执行基因调控任务,且免疫原性低,有可能在将来以顺式模块的方式应用于未来的基因治疗。近年来已经成功构建了多种人造核糖开关,构建方法主要是利用人工适体元件与基因表达调控元件组装,或者是在天然核糖开关基础上进行改造。文中全面综述了涉及人工核糖开关设计及筛选的技术,讨论了可以用于哺乳细胞、响应非天然配体信号、调控特征为热力学和动力学控制的核糖开关的设计新策略,并对核糖开关的筛选构建策略及其在基因治疗及新型药物开发领域的应用前景进行了展望。尽管目前将核糖开关设计成为功能强大的新型基因调控系统还面临很大的困难,但通过构效关系的研究、计算机辅助设计、体外筛选及细胞内筛选技术、高通量优化筛选等技术的综合应用,核糖开关一定可以成为有力的基因调控工具,如能成功应用则可大大促进基因治疗临床化的进程。     

核糖开关的结构和配体结合规律

核糖开关是一种RNA固有的基因表达调控系统。近年来,核糖开关的应用受到科研工作者的广泛关注,其结构与功能的研究也越来越受到重视。核糖开关具有哪些结构特征和调控机制,它是如何识别目的配体,又怎样与目的配体紧密结合,全面了解这些机制将为探索新型核糖开关,设计人工高效核糖开关提供重要思路。本文对核糖开关结构特征和调节机制、适体筛选、配体结合规律进行简要介绍。     

小分子靶标的核糖开关生物传感器研究进展

小分子化合物种类繁多,在众多生化过程中发挥关键作用,具有重要的检测意义与价值,其快速灵敏可视化检测技术的开发是当前的研究热点。基于核糖开关的生物传感器因具有识别特性高、操作简便、成本低等优势,为小分子检测提供了一条新途径。对核糖开关的来源、构成、调控机制、体内外筛选,特别是对基于小分子靶标的核糖开关生物传感器分类进行了介绍,并从核糖开关的筛选、裁剪、理性设计、核糖开关无细胞传感器的应用等几个方向提出了展望,以期为小分子靶标的核糖开关生物传感器的发展和应用提供理论依据。     

一种新发现的基因表达调控机制——核糖开关

最近发现 ,某些依赖代谢物调节的基因转录产物的 5′UTR存在特征性结构———核糖开关(riboswitch) .核糖开关可以特异性结合代谢物 ,通过构象变化 ,在转录或翻译水平上调节基因表达 .核糖开关广泛存在于G+ 及G-细菌的代谢相关基因中 ,在真菌、植物中也有发现 .核糖开关调节维生素、氨基酸、核苷酸等基础代谢过程 ,其调节基因表达不需要任何蛋白因子作为中介 ,在进化上可能是RNA世界遗留的分子化石 .核糖开关可用于研究基因功能 ,开发新型药物及基因治疗 .     

Biofilm与c-di-GMP专刊序言——微生物的社会性、c-di-GMP调控及研究新技术

生物被膜(Biofilm)是微生物生存的主要形式。它是一种或多种微生物通过胞外多糖、胞外DNA、蛋白质等组成的基质聚集在一起形成的细胞多聚体。生物被膜中的微生物细胞之间存在密切的信号通讯,并且表现出与浮游生活时完全不同的生理代谢特征,其发育过程受到环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)等细胞第二信使的控制。由于生物被膜在基础生命科学和医疗、工业、农业、环境治理等应用科学中的重要性,相关研究是微生物学领域的前沿之一。本期专刊从生物工程、研究技术、感染与免疫、环境生物学和植物病理学等角度,较系统地对生物被膜的形成机制、调控分子机理、理化特性和应用技术等进行了综述或研究,展示了我国在本领域的研究水平,同时也对本领域未来发展趋势进行了有益的讨论。     

New insights into Legionella pneumophila biofilm regulation by c-di-GMP signaling

The waterborne pathogen Legionella pneumophila grows as a biofilm, freely or inside amoebae. Cyclic-di-GMP (c-di-GMP), a bacterial second messenger frequently implicated in biofilm formation, is synthesized and degraded by diguanylate cyclases (DGCs) and phosphodiesterases (PDEs), respectively. To characterize the c-di-GMP-metabolizing enzymes involved in L. pneumophila biofilm regulation, the consequences on biofilm formation and the c-di-GMP concentration of each corresponding gene inactivation were assessed in the Lens strain. The results showed that one DGC and two PDEs enhance different aspects of biofilm formation, while two proteins with dual activity (DGC/PDE) inhibit biofilm growth. Surprisingly, only two mutants exhibited a change in global c-di-GMP concentration. This study highlights that specific c-di-GMP pathways control L. pneumophila biofilm formation, most likely via temporary and/or local modulation of c-di-GMP concentration. Furthermore, Lpl1054 DGC is required to enable the formation a dense biofilm in response to nitric oxide, a signal for biofilm dispersion in many other species.     

c-di-GMP对大肠杆菌生物膜调控的研究进展

大肠杆菌生物膜是由聚集于特定介质上的大肠杆菌菌体细胞相互黏附并分泌胞外基质聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)而产生的一种结构复杂的膜状聚集物。感染宿主后的致病性大肠杆菌在形成生物膜后会极大地逃避免疫系统以及环境中各种有害因素对其的影响,对宿主造成持续甚至致命的伤害。环二鸟苷酸(cyclic diguanosine monophosphate,c-di-GMP)是广泛存在于细菌中的第二信使,在调节生物膜形成过程中起到至关重要的作用。基于此,本文对近些年来有关c-di-GMP对大肠杆菌生物膜形成过程中菌体的运动、黏附以及EPS产生机制的研究进行了综述,以期为从c-di-GMP角度抑制大肠杆菌生物膜提供依据和思路。     

All-atom simulations of structures and energetics of c-di-GMP-bound and free PleD

Cyclic diguanosine monophosphate is a bacterial second messenger involved in a lifestyle switch from single cells to biofilm formation. Atomistic simulations are used to characterize inhibited diguanylate cyclase (DGC) PleD with emphasis on the feedback inhibition mechanism. Normal-mode calculations show a rigidification particularly in both the inhibition site and the active site of the protein upon ligand binding. Extensive molecular dynamics simulations in explicit solvent and analysis of the dynamical cross-correlation maps suggest two distinct coupling pathways between the active and the inhibition site: direct information transfer either through the β-strands β2 and β3 of the DGC domain (pathway I) or via the disordered regions connecting domains D2 and DGC (pathway II). In addition, dynamical cross-correlation maps show differences in the correlation between neighboring domains upon ligand binding and upon the point mutation R390A. The correlated motions between domains D1 and D2, which form the dimerization interface, are stronger for free PleD. Complementary to the experimentally observed short-range interactions in ligated PleD, the present work also characterizes the long-range, delocalized interactions between domains that are important for understanding activation and allosteric control of the protein. Based on the results, experimental characterization of the point mutant R353 and of the double mutant N357/H394 is proposed to differentiate between pathways I and II.     

茶碱激活型RNA分子开关的构建及在枯草芽胞杆菌中调节外源基因表达的性能

枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis在工业生物技术以及合成生物学领域作为一种重要的微生物可广泛用作代谢工程、重组蛋白表达以及新型基因电路的底盘。在B. subtilis中构建基于非编码RNA的高精准调节元件,能够实现不依赖蛋白质因子的基因表达调控,丰富B.subtilis基因表达通用工具。通过基因工程手段,设计了基于茶碱适体域的核糖开关E和适体核酶AZ调节元件,并与不同的B.subtilis内源组成型启动子适配,构建出茶碱激活型基因表达控制元件。测定这两种调节元件与6种组成型启动子组合匹配下报告基因GFP的荧光强度,鉴定并分析各调控元件的工作性能。并进一步以红色荧光蛋白mCherry和普鲁兰酶两种不同的异源蛋白验证核糖开关或适体核酶与启动子的最优组合。结果表明,同一种RNA调节元件与不同启动子组合呈现不同水平的调控效率。在核糖开关与启动子的组合中,启动子PsigW和核糖开关E组合(sigWE)对GFP表达的诱导率最高,达到16.8。在适体核酶与启动子的组合中,AZ与启动子P43、PrpoB组合(P43AZ和rpoBAZ)的诱导率最高,分别达到了6.1和6.2。进一步验证结果显示,sigWE调控mCherry的诱导率最高(9.2),而P43E调控普鲁兰酶的诱导率最高(32.8),产酶水平达到了81U/mL。核糖开关和适体核酶对GFP、mCherry、普鲁兰酶均能实现调控,但是不同元件组合的调控性能有所差异,对不同基因的调控效果也不尽相同。     

Ligand-dependent folding of the three-way junction in the purine riboswitch

Riboswitches are highly structured cis-acting elements located in the 5'-untranslated region of messenger RNAs that directly bind small molecule metabolites to regulate gene expression. Structural and biochemical studies have revealed riboswitches experience significant ligand-dependent conformational changes that are coupled to regulation. To monitor the coupling of ligand binding and RNA folding within the aptamer domain of the purine riboswitch, we have chemically probed the RNA with N-methylisatoic anhydride (NMIA) over a broad temperature range. Analysis of the temperature-dependent reactivity of the RNA in the presence and absence of hypoxanthine reveals that a limited set of nucleotides within the binding pocket change their conformation in response to ligand binding. Our data demonstrate that a distal loop-loop interaction serves to restrict the conformational freedom of a significant portion of the three-way junction, thereby promoting ligand binding under physiological conditions.     

核开关结构、机制及应用新进展

核开关(riboswitch)是Breaker等在2002年发现的一种全新的转录后调节机制．它可以通过小分子与mRNA结合来直接调控基因的表达,不需要任何蛋白质的参与．与常见的经由蛋白质的调控方式相比,riboswitch响应更迅速,对细胞内代谢物的变化更敏感．它的发现为RNA研究展示了新的领域． 目前在这个领域,既有基础研究,如riboswitch晶体结构解析、作用机制和动力学研究,又有前沿应用研究,如基于riboswitch的生物传感器和药物设计．Topp等通过设计riboswitch成功地改变了大肠杆菌的趋化性,这为合成生物学和人工生物网络的设计提供了新思路．目前对于riboswitch结构、机制及动力学的研究为基于riboswitch的合理药物设计奠定了基础,有望针对这一新的机制开发新一代抗菌药物．