应用微卫星标记分析圈养大熊猫遗传多样性

以来源于成都大熊猫繁育研究基地和中国保护大熊猫研究中心的34只圈养大熊猫(分为a群体和b群体)和7只圈养野生大熊猫(圈养野生群)作为研究对象,利用AY161177～AY161218、Ame-μ5～Ame-μ70和g001～g905等30个微卫星标记对其遗传多样性现状进行分析,并探讨保持圈养大熊猫遗传多样性的方法.微卫星数据表明,30个微卫星标记多态性好(PIC=0.621～0.640),圈养大熊猫遗传多样性水平(a群体:A=5.48,Ho=0.475,He=0.696;b群体:A=5.24,Ho=0.453,He=0.719;圈养野生群:A=3.80,Ho=0.514,He=0.725)高于6个濒危物种(Ho=0.210～0.390,He=0.150～0.430)但低于3个非濒危物种(Ho=0.620～0.710),圈养大熊猫遗传多样性水平都保持在较高水平,但圈养群遗传多样性水平与圈养野生群相比有所降低.F统计量及基因流Nm分析结果证明,a、b两群体间遗传分化程度不高(Nm=2.610,Fst=0.0874,Fit=0.4116),存在个体交换和一定程度的近交,b群体近交程度高于a群体(a群体Fis=0.3221,b群体Fis=0.3983).因此,现阶段圈养大熊猫的管理重点是避免近交和遗传多样性丧失,将圈养大熊猫种群作为同一管理单元,把纠正大熊猫系谱中的错误、科学选择大熊猫个体进行群体间交流作为关键点,利用微卫星技术保持和提高大熊猫种群的遗传多样性水平.     

微卫星标记在大熊猫研究中的应用进展

大熊猫是我国保护最为成功、研究最为深入的珍稀动物之一,可以为其它珍稀濒危物种的保护研究工作提供参考。20世纪70年代末期借助无线电颈圈,大熊猫的生态学研究工作取得了突破性进展,近20年来微卫星标记和非损伤性遗传取样技术的联合使用,将大熊猫的保护研究工作提升到一个崭新的高度。本文在综合所有已发表大熊猫微卫星标记的基础上,梳理了微卫星标记在圈养大熊猫亲子鉴定与遗传管理,野生大熊猫个体识别与种群数量调查、遗传多样性评估、扩散和种群遗传结构研究中的应用情况,并着重介绍了其中29个重要的微卫星标记。同时指出目前微卫星标记的使用存在标记选择不统一、等位基因读数无统一规程等问题,并对应用前景进行了前瞻。     

大熊猫野化放归中的遗传学分析

大熊猫为我国特有的濒危物种,由于人类活动的影响,其生境遭到破碎化以致孤立小种群间基因流受限制,严重威胁野生孤立小种群的续存。野化放归以复壮并建立能自我维持的野生种群是物种保护的一种有效措施,这在国内外已有成功先例。野化放归圈养大熊猫以复壮野生种群是大熊猫保护的重要策略之一。然而,破碎化生境阻碍了小种群间的基因交流,加剧了因近交和遗传漂变带来生存力下降的危机。因此大熊猫的放归必须首先考虑其遗传背景,以改善种群基因库为目的。综合微卫星与线粒体等分子标记分析显示,现存野生大熊猫种群和圈养种群仍具有中等或以上的遗传水平,具有较大的进化潜力,这为大熊猫野化放归提供了遗传学支持。另外,小相岭和大相岭种群的遗传水平最低,应首先考虑这些种群的复壮,并且对秦岭种群进行特殊管理与保护。大熊猫的野化放归应着重于野放个体亲缘度的合理选择、基因丰富度的优先选择和有害基因的反向选择等三个遗传因素。本文旨在综合分析大熊猫现存种群遗传现状及其在野化放归中的决策性,以期为大熊猫野化放归提供参考依据。     

基于线粒体12S对中国两大山系大熊猫西氏贝蛔虫种群遗传多样性的分析

大熊猫是中国特有的珍稀濒危物种,而西氏贝蛔虫是大熊猫体内最为常见的肠道寄生虫,对野生和圈养大熊猫危害极大。考虑到大熊猫因分布区域的差异而形成了不同的亚种以及寄生虫与宿主间广泛的协同进化关系,西氏贝蛔虫是否也存在与大熊猫相适应的亚种分化一直是野生动物学家极其关注和热议的话题。为此,本文选择中国两大山系（岷山和邛崃）大熊猫种群体内共计34株西氏贝蛔虫虫体样本进行种群遗传多态性研究。利用PCR技术扩增出了岷山（14株）和邛崃（20株）西氏贝蛔虫的线粒体12S基因全序列并对其做了遗传多样性分析。结果表明：（1）34个样本包含9个单倍型,呈现出一个高单倍性多样性和低核苷酸多样性的特点;（2）负的Tajima's D和Fu's Fs中性检验值及“多峰型”的种群歧点分布图暗示种群不久前曾经历过突增长的现象;（3）低的种群间的分化系数和高的基因流表明两个地理种群间未形成显著的遗传分化;（4）系统发育树和单倍型网络图表明两山系种群分布无区域特异性。因此,岷山和邛崃山系的大熊猫体内的西氏贝蛔虫种群遗传变异性较低,分化不明显。该发现不仅暗示了西氏贝蛔虫与其宿主（大熊猫）的进化不同步,而且还为不同区域大熊猫西氏贝蛔虫病的监控提供了理论依据。     

圈养大熊猫冷冻精液对其种群遗传多样性的作用

在过去34年的圈养大熊猫种群保护工作中,我们成功建立了全球最大的大熊猫精子库,目前已保存50只大熊猫个体总计7 000余支细管冷冻精液(冻精)。冷冻精液一方面可以使物种的遗传资源得到长久保存,另一方面可以通过人工授精的方式促进种群繁育。但是,圈养大熊猫冷冻精液对其种群遗传多样性的作用尚未有明确报道。本研究首先根据成都大熊猫繁育研究基地2000—2014年冷冻精液人工授精数据,对比分析了冻精人工授精个体和圈养种群的遗传多样性。结果显示,冻精人工授精个体遗传多样性均高于同年圈养种群的平均遗传多样性,表明在繁殖年份中冻精人工授精可以显著提高圈养大熊猫种群的遗传多样性。统计精子库中所有冻精个体的平均血缘系数并与圈养种群进行对比分析,探究冷冻精液对圈养种群遗传多样性的潜在作用。结果显示,精子库中有21只已死亡个体的精液,其中有66.67%的个体平均血缘系数低于圈养种群;有14只20岁以上个体的精液,其中有50.00%的个体平均血缘系数低于圈养种群;另有15只20岁以下个体的精液,其中有53.33%的个体平均血缘系数低于圈养种群,表明冷冻精液对圈养种群遗传多样性的保护具有重要价值。综上所述,冷冻精液不但有效保存了大熊猫遗传资源,而且在保护圈养种群遗传多样性方面具有积极的促进作用。     

圈养繁殖在大熊猫保护生物学中的作用

栖息地的日益恶化、片段化和种群孤岛化已成为保护大熊猫的严重障碍。尽管就地保护濒危物种是最有希望的措施,但对于大熊猫而言,研究表明圈养繁殖也是保护这一极危物和中的有效手段之一,对保护遗传多样性起以了重要作用,是延缓绝灭速率的保证。本文阐述了大圈养繁殖的必要性及其在保护生物学中的作用。     

中国濒危兽类保护遗传学研究进展与展望

我国是全球生物多样性大国,拥有包括大熊猫、金丝猴、华南虎、麋鹿、白鱀豚等特有物种和旗舰物种在内的丰富兽类资源。近几十年来,土地利用模式转变、盗猎、环境污染、气候变化等因素使许多兽类物种面临生存威胁,导致物种遗传多样性丧失。而遗传多样性是生物多样性的基本组成部分,决定了物种和种群能否长期生存。保护遗传学作为保护生物学的一大分支学科,旨在通过遗传学分析探明种群遗传变异和物种濒危的遗传学机制。近40年来,随着研究手段和技术的不断发展,我国兽类保护遗传学在遗传多样性和近交水平评估、景观遗传学、生态遗传学和圈养种群遗传管理等方面都取得了重要成果。然而,未来人类社会发展可能为濒危兽类带来的威胁依然存在,高通量测序等新技术的进一步发展则能够帮助我们更加深入地了解濒危物种和种群遗传适应与濒危机制,从而实现对濒危兽类的有效管理与保护。     

圈养小熊猫遗传多样性与种群遗传结构分析

小熊猫是亚洲特有的珍稀濒危动物,目前受到栖息地减少、片断化和人类活动干扰等威胁。中国圈养小熊猫已经有60 多年历史,约55 个机构曾经饲养过小熊猫,现今圈养数量有400 多只,评估小熊猫圈养种群的遗传多样性和遗传结构对科学维持圈养种群和保存遗传种质资源意义重大。本研究利用19 个微卫星座位,对中国境内11 个小熊猫圈养种群的116 只个体进行了遗传多样性评估及遗传结构分析。结果显示11 个种群都具有较高的遗传多样性,平均基因丰富度3.505 ± 1.033 (北京)至4.026 ± 1.219 (冕宁),期望杂合度0.631 ± 0.225(黄山)至0.782 ±0.171 (温岭)。其中福州和无锡种群极显著偏离Hardy-Weinberg 平衡。整个圈养群体内各个种群遗传分化系数为0.055,呈显著分化,表明11 个种群遗传分化水平较高。Bayesian 遗传聚类分析将11 个种群聚为三个遗传簇,与野生种群的遗传聚类结果一致。结论:小熊猫圈养种群与野生种群相比,同样具有较高的遗传多样性。因此,圈养小熊猫遗传管理的重点不再是引进野生个体充实圈养种群,应制订科学的繁殖计划,避免近交,从而维持圈养种群的遗传多样性。     

高原鼠兔四个地理种群的遗传多样性与遗传分化

采用7 个多态微卫星DNA 标记分析了4 个高原鼠兔地理种群(海晏种群、西大滩东种群、西大滩西种群和昆仑山种群)的遗传多样性和遗传分化。采用多态信息含量(PIC)、期望杂合度(H_e )、观测杂合度(H_o)、基因流(N_m )和基因分化系数(F_st )对种群及物种的遗传多样性水平进行分析;计算各种群间的遗传距离(GD)、遗传相似度(GI)以及遗传距离与地理距离的相关系数,并进行UPGMA 聚类分析。研究结果显示,高原鼠兔的遗传多样性在小哺乳动物中处于较高水平, 其H_e 和H_o 的平均值分别为0. 5332 和0. 6003, 其F_st 为0. 0975,即有9. 75% 的变异存在于种群之间,即变异主要存在于种群内部。4 个种群间的杂合度与多态信息含量均无显著差异,说明它们的遗传多样性水平基本相当。海晏种群与其余3 个种群的遗传分化均达到了中度分化水平(F_st = 0.1043),而另3 个种群间几乎没有分化(F_st = 0. 0253)。Mantel test 结果表明地理距离与遗传距离间没有显著的相关性。     

奠基者效应对海南坡鹿迁地保护种群遗传多样性的影响

在迁地保护中,奠基者效应通常会导致新建种群与源种群的遗传分化,并使新建种群的遗传多样性低于源种群。海南坡鹿(Cervuseldi hainanus)是世界濒危种,野生种群仅分布在中国海南岛。由于栖息地破坏和过度狩猎,至20世纪70年代,这个物种仅剩26只,已经濒临绝灭,被列为国家一级保护动物。自1976年开始对海南坡鹿实施就地保护和迁地保护,该种群的数量从最初的26只增加到1600多只。本文采用10个微卫星位点对一个源种群(大田种群)和5个迁地种群(邦溪、甘什岭、枫木、金牛岭、文昌种群)的遗传多样性进行检测,结果发现6个种群的遗传多样性水平均较低(He≈0·3);5个迁地种群分别有1、3或5个单态位点,大田种群无单态位点;邦溪种群与大田种群遗传分化显著,而甘什岭种群与大田种群的遗传分化不显著。结果表明,奠基者效应导致种群的遗传多样性水平较低,并且对于不同迁地种群,影响也不相同。造成这些差异的因素有建群者数量、引种方式和建群种群的结构。该研究为今后在海南岛建立新的海南坡鹿迁地种群提供建议和参考,同时也为其他濒危物种的迁地保护提供理论指导。     

圈养大熊猫群体间的基因流状况分析

圈养群体的遗传管理一个非常重要的手段就是实现不同群体间的基因交流.为了全面评估大熊猫圈养群体间的基因流状况,本研究以卧龙中国大熊猫保护中心的31只圈养大熊猫(简称卧龙群体)和成都大熊猫繁育研究基地与楼观台陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心的37只圈养大熊猫(简称成都群体,其中楼观台1只)为研究对象,以7个大熊猫微卫星位点为分子标记,发现卧龙群体和成都群体间的遗传分化水平很低(Fst=0.041,P=0.001);尽管整个圈养群体的近交程度较低(Fis=0.026),但是成都群体的近交系数(Fis=0.045)远高于卧龙群体的近交系数(Fis=0.002);谱系分析、贝叶斯分析和系统进化法分析均显示,这两个群体间存在着基因流,但是这种基因流是单向的.此结果提示各个大熊猫饲养单位之间必须实现更多的合作,将大熊猫群体作为一个管理单元进行管理,从而实现更多的基因流.     

Microsatellite variability reveals the necessity for genetic input from wild giant pandas (Ailuropoda melanoleuca) into the captive population

Recent success in breeding giant pandas in captivity has encouraged panda conservationists to believe that the ex situ population is ready to serve as a source for supporting the wild population. In this study, we used 11 microsatellite DNA markers to assess the amount and distribution of genetic variability present in the two largest captive populations (Chengdu Research Base of Giant Panda Breeding, Sichuan Province and the China Research and Conservation Center for the Giant Panda at Wolong, Sichuan Province). The data were compared with those samples from wild pandas living in two key giant panda nature reserves (Baoxing Nature Reserve and Wanglang Nature Reserve). The results show that the captive populations have retained lower levels of allelic diversity and heterozygosity compared to isolated wild populations. However, low inbreeding coefficients indicate that captive populations are under careful genetic management. Excessive heterozygosity suggests that the two captive populations have experienced a genetic bottleneck, presumably caused by founder effects. Moreover, evidence of increased genetic divergence demonstrates restricted breeding options within facilities. Based on these results, we conclude that the genetic diversity in the captive populations is not optimal. Introduction of genetic materials from wild pandas and improved exchange of genetic materials among institutions will be necessary for the captive pandas to be representative of the wild populations.     

Genome-wide survey and analysis of microsatellites in giant panda (Ailuropoda melanoleuca), with a focus on the applications of a novel microsatellite marker system

Background

The giant panda (Ailuropoda melanoleuca) is a critically endangered species endemic to China. Microsatellites have been preferred as the most popular molecular markers and proven effective in estimating population size, paternity test, genetic diversity for the critically endangered species. The availability of the giant panda complete genome sequences provided the opportunity to carry out genome-wide scans for all types of microsatellites markers, which now opens the way for the analysis and development of microsatellites in giant panda.

Results

By screening the whole genome sequence of giant panda in silico mining, we identified microsatellites in the genome of giant panda and analyzed their frequency and distribution in different genomic regions. Based on our search criteria, a repertoire of 855,058 SSRs was detected, with mono-nucleotides being the most abundant. SSRs were found in all genomic regions and were more abundant in non-coding regions than coding regions. A total of 160 primer pairs were designed to screen for polymorphic microsatellites using the selected tetranucleotide microsatellite sequences. The 51 novel polymorphic tetranucleotide microsatellite loci were discovered based on genotyping blood DNA from 22 captive giant pandas in this study. Finally, a total of 15 markers, which showed good polymorphism, stability, and repetition in faecal samples, were used to establish the novel microsatellite marker system for giant panda. Meanwhile, a genotyping database for Chengdu captive giant pandas (n = 57) were set up using this standardized system. What’s more, a universal individual identification method was established and the genetic diversity were analysed in this study as the applications of this marker system.

Conclusion

The microsatellite abundance and diversity were characterized in giant panda genomes. A total of 154,677 tetranucleotide microsatellites were identified and 15 of them were discovered as the polymorphic and stable loci. The individual identification method and the genetic diversity analysis method in this study provided adequate material for the future study of giant panda.

Electronic supplementary material

The online version of this article (doi:10.1186/s12864-015-1268-z) contains supplementary material, which is available to authorized users.     

野生大熊猫现状、面临的挑战及展望

截至2003年底,我国野生大熊猫种群数量达1596只,分布在陕西、四川和甘肃3省的45个县境内,总栖息地面积达2304991hm^2。与第2次大熊猫调查相比,野生大熊猫生存状况已得到改善,分布范围扩大、栖息地面积增加、种群数量进一步增长。本文在第3次大熊猫调查的基础上,就野生大熊猫种群及栖息地现状进行了分析,指出未来保护大熊猫所面临的3个方面的挑战,即来自物种自身生物学特性的挑战、栖息地破碎化及隔离小种群未来命运的挑战以及大熊猫保护与社区经济发展需求相冲突的挑战。作者还就我国大熊猫保护前景进行了展望,即自然保护区数量将进一步增加,栖息地状况将进一步改善;种群数量在总体保持稳定的基础上将逐步增长,但局部小种群灭绝风险将加剧;圈养种群将形成能自我维持的种群,圈养个体通过培训将逐步放归到隔离野生小种群中以改变其命运。     

应用微卫星分型进行小熊猫亲子鉴定

小熊猫栖息于喜马拉雅与横断山脉,是亚洲濒危物种。中国的小熊猫谱系已登记圈养小熊猫个体９６８ 只,现有存活个体３５５ 只（２０１３ 年）,然而,现有谱系中存在部分信息不明确的问题。为此,我们选择１９ 对小熊猫特异性引物对４１ 只圈养小熊猫进行微卫星扩增,并分析其亲缘关系。将获取的亲子鉴定结果,结合种群原始记录信息,利用Pedigraph 软件构建福州圈养小熊猫的种群遗传谱系图。结果表明：在母子关系确实的情况下,１９个基因座位的联合父权排除概率为０. ９９９９９９６８;利用６ 个已知双亲的后代检验１９ 个基因座位的可信度,后代与双亲的基因型完全符合孟德尔遗传定律,表明１９个基因座位能有效确认小熊猫的亲权关系。应用１９ 个微卫星标记成功地为１５ 个后代找到了生物学父亲。尽管一些雌性个体在繁殖期有多重交配的行为,亲子鉴定的结果显示同一窝小熊猫均来自单一父权。基因型比对结果表明７ 对双胞胎均属于异卵双生子。福州种群的后代中除＃９２０和＃９２１ 外,其余均源于＃４８７ 或＃８９８ 两只雄性,表明不同个体参与繁殖的机会不均等。因此,利用现代繁殖技术,加强濒危野动物种群管理,科学制定繁殖计划具有积极的现实意义。     

A new oligonucleotide probe for the giant panda

Quantifying genetic diversity in populations is one of the fundamental measures for species conservation. This is far more important for critically endangered species like giant pandas, where there are few individuals remaining in the population. However, previous multilocus probes could not identify homozygous loci resulting from inbreeding of giant pandas, and produced few polymorphic loci. As a result, we have prepared a new oligonucleotide probe, which had the highest paternity probability and succeeded in identifying the homozygous loci and in discriminating giant panda individuals.