枯草芽孢杆菌壳聚糖酶水解制备低脱乙酰度壳寡糖及其组分分析

对来源于枯草芽孢杆菌菌株168(Bacillus subtilis 168)的壳聚糖酶编码基因进行了序列优化及全合成,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)中实现了分泌表达,表达产物的蛋白质浓度达到0.30mg/ml。表达的壳聚糖酶最适p H为5.6,最适温度为55℃,比酶活达84.54U/ml。该酶在50℃及以下较稳定。利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖并使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF MS)对产物的组分进行了分离及鉴定。根据一级质谱信息,推测酶解产物中包含至少37种聚合度2~18,不同脱乙酰度的壳寡糖组分。综上,利用毕赤酵母分泌表达了来源于枯草芽孢杆菌菌株168的壳聚糖酶基因,利用表达产物水解制备了低脱乙酰度壳寡糖并对其组分进行了分析,可为后续壳寡糖结构与功能关系的研究提供参考。     

高活性壳聚糖酶制剂的制备及其对壳聚糖降解作用的研究

对系列壳聚糖酶高产菌株的产酶性能及产酶发酵液的壳聚糖酶活性进行了比较,从中筛选出一株优良芽孢杆菌菌株,其产酶发酵液的壳聚糖酶活力高达5000U/mL(以单位时间内底物壳聚糖的减少量确定酶活力)。利用此粗制壳聚糖酶制剂对壳聚糖进行酶解产糖的研究表明:壳聚糖的转化率及壳寡糖的产率在适合的酶解条件下,短时间内即可接近100%。     

烟曲霉菌壳聚糖酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中发布的烟曲霉菌壳聚糖酶（Aspergillus fumigatus chitosanase,EC3.2.1.132）基因序列人工合成8条DNA长链及4条引物链。DNA链的设计上在不改变壳聚糖酶氨基酸组成的前提下选择大肠杆菌使用频率高的密码子。PCR拼接法扩增壳聚糖酶基因并克隆入pGEM_T easy载体进行序列分析,进一步亚克隆入表达载体pGEX_3X。重组质粒pGEX_Csn转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达,亲和层析及Factor Xa酶解纯化重组Csn。所得重组壳聚糖酶具有降解壳聚糖的生物活性,其活性受温度及pH值的影响。     

人Nek2蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备

目的:通过原核表达系统表达人Nek2蛋白,优化表达条件并纯化Nek2蛋白,制备抗Nek2多克隆抗体。方法:将Nek2基因片段构建到原核表达载体pET30a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3);加入诱导剂IPTG诱导表达,对诱导温度、诱导剂IPTG终浓度、诱导时间等条件进行优化;利用12%SDS-PAGE后250mmol/L KCl染色切胶纯化蛋白质,将纯化后的Nek2蛋白进行质谱鉴定;纯化Nek2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用ELISA、Western blot和免疫荧光实验检测多克隆抗体效价和特异性。结果:构建了pET30a(+)-Nek2重组原核表达质粒,诱导的重组人Nek2蛋白主要以包涵体的形式存在;蛋白质的最适诱导表达条件为28℃,180r/min条件下加入终浓度为0. 2mmol/L IPTG诱导32h;质谱分析纯化后的蛋白质为Nek2蛋白,最终获得浓度为1. 35mg/ml纯化后的Nek2蛋白;纯化蛋白免疫小鼠,多克隆抗体效价大于1∶243 000,且具有良好的抗原特异性;免疫荧光实验显示Nek2主要定位于细胞质和细胞核。结论:利用重组人Nek2蛋白获得具有良好抗原特异性的抗Nek2多克隆抗体。     

来自拟青霉属真菌的壳聚糖酶的分离纯化、理化性质及降解产物的分析(英文)

从来自拟青霉属真菌Paecilomyces sp.CS-Z的发酵液中获得一种壳聚糖酶,该酶被纯化了9.4倍,产率为48.2%。经SDS-PAGE分析确定为单一条带,分子量为29kDa,其最适pH为6.0–6.5,最适温度为55℃,在80℃处理60min后,能保持较好的热稳定性,Hg2+完全抑制了酶活,对脱乙酰度85%–95%的壳聚糖具有较高的水解活性,而对几丁质和羧甲基纤维素无活性。薄层层析和质谱分析表明该酶是一种内切酶,其水解产物为聚合度大于6的壳寡糖,其理化性质与至今报道的壳聚糖酶有所不同,为壳聚糖酶的开发提供了重要的实验依据。     

腐皮镰孢菌壳聚糖酶的酶学性质研究及其在酿酒酵母工业菌株中的表达

摘要：【目的】本研究旨在了解腐皮镰孢菌（Fusarium solani）壳聚糖酶的基本酶学性质及其在壳寡糖生产中的应用,构建能高效分泌表达壳聚糖酶的酿酒酵母工业菌株。【方法】采用RT-PCR扩增腐皮镰孢菌壳聚糖酶的cDNA序列;通过组氨酸标签,纯化得到E. coli表达的重组壳聚糖酶,并进行基本酶学性质研究;以薄层层析、高效液相色谱等技术对该酶的酶解产物进行分析;通过马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）菊粉酶信号肽（INU1A）实现壳聚糖酶在酿酒酵母工业菌株N-27中的分泌表     

人Nek2蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备 *

目的通过原核表达系统表达人Nek2蛋白,优化表达条件并纯化Nek2蛋白,制备抗Nek2多克隆抗体.方法 将Nek2基因片段构建到原核表达载体pET30a(+)上,转化大肠杆菌BL21 (DE3);加入诱导剂IPTG诱导表达,对诱导温度,诱导剂IPTG终浓度,诱导时间等条件进行优化;利用12% SDS-PAGE后250mmol/L KCl染色切胶纯化蛋白质,将纯化后的Nek2蛋白进行质谱鉴定;纯化Nek2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用ELISA,Western blot和免疫荧光实验检测多克隆抗体效价和特异性.结果 构建了pET30a(+)-Nek2重组原核表达质粒,诱导的重组人Nek2蛋白主要以包涵体的形式存在;蛋白质的最适诱导表达条件为28℃,180r/min条件下加入终浓度为0.2mmol/L IPTG诱导32h;质谱分析纯化后的蛋白质为Nek2蛋白,最终获得浓度为1.35mg/ml纯化后的Nek2蛋白;纯化蛋白免疫小鼠,多克隆抗体效价大于1∶243 000,且具有良好的抗原特异性;免疫荧光实验显示Nek2主要定位于细胞质和细胞核.结论: 利用重组人Nek2蛋白获得具有良好抗原特异性的抗Nek2多克隆抗体.     

沙门菌外膜蛋白D的原核表达及多克隆抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达沙门菌外膜蛋白(OMP)D,纯化后制备兔抗OMPD抗体。方法:用PCR方法从鼠伤寒沙门菌中扩增出ompD基因,并插入融合表达载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET28a(+)-ompD;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,经IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化;以表达的OMPD蛋白免疫家兔,制备抗OMPD的多克隆抗体并进行鉴定。结果:扩增了ompD基因,测序证实正确后亚克隆于表达载体pET-28a(+)中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量为40×103的目的蛋白并进行纯化;纯化的OMPD免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶10000以上,且具有良好的特异性。结论:构建ompD基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗OMPD抗体,效价及特异性均良好,为进一步制备肠黏膜高亲和力疫苗奠定了基础。     

壳聚糖酶结构与功能的研究进展

壳聚糖酶是一类对壳聚糖具有较高催化活性而几乎不水解几丁质的糖苷水解酶,其可将高分子量的壳聚糖转化为低分子量的功能性壳寡糖。近年来,对壳聚糖酶的相关研究取得了显著进展,因此,本文对其生化性质、晶体结构、催化机制和蛋白质工程改造进行总结和探讨,并对酶法制备壳寡糖纯品进行展望,这将加深研究者对壳聚糖酶作用机制的认识,推动壳聚糖酶的工业应用。     

β-脱卤酶的基因克隆表达及其酶学性质

根据GenBank中的序列设计引物,克隆芽孢杆菌中的β-脱卤酶基因(命名为bhd)。以pET30a(+)为载体、Escherichia coli BL21(DE3)-CondonPlus为宿主菌,实现了bhd的高效表达。使用HisTrapTMFF亲和层析柱纯化重组β-脱卤酶,分子量约为23.1 kD。酶学性质研究表明,纯化的重组β-脱卤酶水解3-氯丙酸制备3-羟基丙酸的最适反应体系为30°C,100 mmol/L,pH 7.0的磷酸钠缓冲液。在最适反应条件下,重组β-脱卤酶的比活为16.2 U/mg,Km和Vmax分别为3.26μmol/L和17.86 mmol/(min.g protein)。在最适反应条件下,以10 mmol/L 3-氯丙酸为底物,反应36 h的转化率在93%以上。     

牛分枝杆菌MPB83基因的原核表达及免疫活性分析

利用PCR技术,以牛型分枝杆菌(M.bovis)Vallee菌株的全基因组DNA为模板,扩增出了一条600bp的MPB83基因片段,将其克隆至pMD18T载体中,经核苷酸序列测定确证后,KpnI/EcoRI双酶切,然后亚克隆到原核表达载体pET30a的相同酶切位点,构建表达质粒pETMPB83,将鉴定的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后SDSPAGE检测表达情况,重组质粒pETMPB83在30kDa处有一特异表达带,与预计大小相符。经Ni柱纯化后,Westernblot检测纯化蛋白具有免疫活性,用纯化的该蛋白进行动物(兔)接种制备抗血清,用Westernblot和ELISA检测该抗血清的效价和特异性,结果表明特异性较好。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的重组表达及膜定位研究

从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出ESAT-6基因,克隆入pET21a(+)载体.将成功构建的pET21a(+)-ESAT-6重组质粒转化入感受态BL21(DE3)中,经诱导表达后,使用SDS.PAGE和Western blot鉴定.超声破碎后发现目的蛋白以可溶性表达形式存在,经过Ni-NTA柱和DEAE-Seph...     

Hv古细菌SRP19基因的克隆、表达、重组蛋白的纯化及生物学活性的研究

目的：构建Hv古细菌SRP19蛋白的表达载体pET23d-HvSRP19并在大肠杆菌中表达后进行纯化和研究其生物学活性,为研究SRP循环的分子机制奠定基础。方法：用体外合成的重组DNA技术,先合成具有重叠碱基的10个寡核苷酸短序列,通过拼接,获得Hv SRP19基因全长DNA后,克隆到pET23d载体上。重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中的大量表达产物经Q-Sepharose离子交换层析柱纯化后再用蔗糖密度梯度超速离心法分析其生物学活性。结果：正确构建了pET23d-Hv SRP19表达载体,并在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中获得良好的表达;成功地纯化了表达产物,纯度达95%;证明了具有SRP19蛋白的生物学活性,能够与Hv SRP RNA相互作用形成SRP19-SRP RNA的复合物。结论：纯化的Hv SRP19蛋白与Hv SRP RNA相互作用所形成的复合物,被认为是启动SRP颗粒形成和功能发挥的开始。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

牛分枝杆菌mpb64基因的克隆、鉴定及其表达

以牛型分枝杆菌基因组DNA为模板,PCR方法扩增mpb64基因,纯化PCR产物并与pDM18-T载体连接、转化,经酶切及核苷酸序列鉴定为正确后,酶切产物亚克隆到原核表达载体pET30a(+)的KpnI／EcoRI位点,构建重组表达质粒pET30a+-mpb64,转化到大肠杆菌DE3内,以IPTG进行诱导,终浓度为1mmol／L,诱导产物进行SDS-PAGE电泳。结果表明,PCR方法成功扩增出mpb64基因,核苷酸序列测定验证了其正确性,重组表达质粒表达的pET30a+-mpb64融合蛋白相对分子量为30.4kDa,与实测相符。牛分枝杆菌pET30a+-mpb64的成功表达为牛结核病的诊断及新型疫苗的研究奠定了基础。     

Expression, purification and biochemical characterization of a single-stranded DNA binding protein from Herbaspirillum seropedicae

An open reading frame encoding a protein similar in size and sequence to the Escherichia coli single-stranded DNA binding protein (SSB protein) was identified in the Herbaspirillum seropedicae genome. This open reading frame was cloned into the expression plasmid pET14b. The SSB protein from H. seropedicae, named Hs_SSB, was overexpressed in E. coli strain BL21(DE3) and purified to homogeneity. Mass spectrometry data confirmed the identity of this protein. The apparent molecular mass of the native Hs_SSB was estimated by gel filtration, suggesting that the native protein is a tetramer made up of four similar subunits. The purified protein binds to single-stranded DNA (ssDNA) in a similar manner to other SSB proteins. The production of this recombinant protein in good yield opens up the possibility of obtaining its 3D-structure and will help further investigations into DNA metabolism.     

Lys_(10)-PAI-1融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和凝胶阻滞实验

用PCR方法构建 10个赖氨酸与纤溶酶原激活剂抑制物 1的融合基因Lys10 PAI 1,并克隆于pET2 8a(+ )和pET32a(+ )原核表达载体 .将重组表达质粒pET32 PAI和pET2 8 PAI转化大肠杆菌BL2 1(DE3) .IPTG诱导后可获得分子量分别为 6 3kD和 4 3kD的目的蛋白 ,表达蛋白占菌体蛋白2 0 %以上 ,大多数重组蛋白以不溶形式存在 .表达产物经变性、复性、超滤、透析和亲和层析等步骤 ,可以得到纯化的Trx·PAI 1和rPAI 1重组蛋白 .Western印迹结果表明 ,目的蛋白具有人PAI 1的抗原性 .凝胶阻滞实验发现 ,纯化的重组蛋白在一定条件下 ,可以与质粒结合 ,使质粒的迁移率明显改变 .研究结果表明 ,Trx·PAI 1和rPAI 1有希望成为受体介导基因转移的配体     

重组人FOXL2基因的原核表达和纯化研究

目的通过pET32a（＋）原核表达载体,表达重组人叉头框蛋白L2（human forkhead box12,FOXL21）。并且进行纯化和鉴定。方法从正常人血液中提取基因组DNA,利用PCR扩增FOXL21目的基因片段,构建FOXL21原核表达重组质粒[pET32a（＋）-FOXL21]并转化E．coli的BL21（DE3）菌株,IPTG诱导重组蛋白表达,经HisTrap FF亲和层析柱纯化,再通过SDS—PAGE和Western印迹鉴定。结果成功克隆到大小为1131bp的人源FOXL21基因片段并准确插入表达载体pET32a（＋）,0．1mmol／LIPTG诱导转化菌8h可表达大量的FOXL21蛋白,并可经HisTrap FF柱亲和层析得到高度纯化。结论成功获得纯化的66kD重组人FOXL21蛋白,为后续进行FOXL21蛋白的功能研究奠定了基础。