双萤光素酶共表达载体构建及特性研究

利用来源于TaV的自剪切多肽2A的编码序列构建一种分泌型萤光素酶Gluc和非分泌型萤光素酶Fluc共表达的载体,对其体内外表达及活体成像特点进行研究。采用重叠PCR技术获得Gluc-2A-Fluc片段,克隆入表达质粒pAAV2neoCAG中,获得重组质粒pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc。将重组质粒瞬时转染BHK-21细胞,24h后在细胞上清液和细胞裂解液中均能检测到Gluc和Fluc的表达,其中Gluc98%以上分布在上清液中,而Fluc98%以上存在于细胞中,随时间延长Gluc活性在上清液中逐步增加,而细胞内Fluc活性则保持相对平稳。用水动力法经小鼠尾静脉注射pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒DNA,通过尾静脉微量采血(2.5μl/次)即可实时地监测体内Gluc的表达情况。活体成像结果显示,注射Gluc的底物腔肠素时小鼠明显表现为全身显像,显像在10min内迅速衰减;而注射Fluc的底物D-Luciferin时显像主要集中在肝脏,显像在30min内都比较稳定。本研究设计和构建的pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒实现了分泌型和非分泌型萤光素酶的共表达,既可以在不裂解细胞或处死动物的情况下直接在细胞培养上清或血液中动态检测Gluc的活性,又可以利用活体成像技术准确定位Fluc表达部位,比单一的萤光素酶报告载体在细胞标记和体内示踪研究方面更具优越性。     

含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒载体的制备与表达分析

目的:制备含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒载体,为慢病毒载体的进一步广泛应用奠定基础。方法:克隆构建含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的转基因载体pCS-gluc-2A-eGFP,酶切与序列分析鉴定其正确后,与包装质粒pCMVHR’Δ8.2、包膜质粒pVSV-G共转染293FT细胞,获得含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的重组慢病毒载体;重组慢病毒载体感染A549、Huh7细胞后,用荧光显微镜直接观察报告基因GFP的表达,或取细胞上清实时检测分泌型萤光素酶的表达。结果:制备了含双报告基因的重组慢病毒载体,感染细胞后可以活体观察绿色荧光蛋白的表达,也可以快速灵敏地检测到分泌型萤光素酶的表达。结论:所获含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的重组慢病毒载体感染效率高,表达易于活体实时检测,灵敏度高。本研究为慢病毒载体的广泛应用奠定了基础。     

慢病毒介导荧光素酶表达的人鼻咽癌细胞小鼠模型的建立

目的：建立荧光素酶标记的人鼻咽癌细胞裸鼠模型,活体成像系统监测肿瘤的生长并与肿瘤的体积进行对比。方法：构建表达荧光素酶基因2（1uc2）的慢病毒载体,与辅助质粒共转染293T细胞以制备慢病毒,感染人鼻咽癌SUNEl细胞后经嘌呤霉素筛选获得表达luc2的细胞株。活体成像设备体外检测不同数量细胞的发光强度,最后以5×10 6个细胞皮下接种BALB／cnu／nu裸鼠,活体成像系统动态记录接种后肿瘤的信号并与肿瘤的体积对比。结果：成功构建慢病毒表达质粒pLenti．1uc2并包装出慢病毒颗粒,病毒感染后嘌呤霉素筛选6天得到鼻咽癌细胞株SUNEl一luc2。细胞株传代后有稳定的发光强度,且经活体检测的每秒光子数与细胞数成正相关（R2=0．96）;活体成像观察发现裸鼠接种第2天接种部位的发光强度就达到3-2×10^8,而且成瘤过程中发光强度的变化与肿瘤大小一致。结论：成功构建适用于活体成像的人鼻咽癌SUNEl细胞的裸鼠成瘤模型,该模型从细胞接种开始即可有效动态监测鼻咽癌皮下瘤的生长及转移,从而为鼻咽癌的成瘤机制及药物干预研究提供一个新的手段。     

携带荧光素酶基因肝癌细胞株的构建及在肝癌原位移植瘤模型中应用

[目的]构建稳定表达荧光素酶基因的人肝癌细胞株,建立可实时观察的肝癌原位移植瘤模型。[方法]构建含有萤光素酶基因的慢病毒载体,利用慢病毒三质粒系统磷酸钙共转染HEK 293T细胞,收集纯化病毒感染肝癌细胞SMMC7721,嘌呤霉素(puromycin)结合有限稀释法筛选稳定转导细胞株,将细胞原位注射裸鼠肝组织,建立原位肝癌动物模型。[结果]包装纯化的慢病毒悬液的滴度为8.4×106TU/m L,感染肝癌细胞后成功筛选到稳定表达的肝癌细胞株。利用该细胞株成功建立原位注射肝癌裸鼠模型,经活体荧光成像系统观察到肝癌细胞在活体动物体内的分布情况。[结论]荧光素酶肝癌细胞株的成功构建及利用该细胞株建立的原位移植瘤肝癌动物模型为肝癌的治疗研究奠定了基础。     

过表达miR-153非小细胞肺癌细胞稳转株的构建及鉴定

目的:构建过表达miR-153的非小细胞肺癌的稳转细胞株,为进一步探讨miR-153在肺癌发生发展中的作用奠定基础。方法:构建具有嘌呤霉素抗性的miR-153慢病毒载体;体外培养非小细胞肺癌细胞系SPC-A-1和A549,加入浓度梯度的嘌呤霉素溶液,筛选出最佳浓度;使用慢病毒转染细胞株,并在转染72 h后用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,评价转染效率;体外实验使用PCR检测miR-153在稳转株的表达;稳转株移植裸鼠体内成瘤,取出瘤体后检测瘤体内EGFP和miR-153的表达。结果:完成过表达miR-153慢病毒载体及阴性对照载体的构建;确定嘌呤霉素最佳筛选浓度:在SPC-A-1细胞中的浓度为2.0 g/mL,A549细胞中的浓度为3.0 g/mL;目的基因miR-153被慢病毒成功导入SPC-A-1细胞和A549细胞中,荧光显微镜下能直接观察到EGFP。转染miR-153组和阴性对照组的PCR实验结果显示:在SPC-A-1细胞中,miR-153的表达量为92.9±20.6,明显高于阴性对照组(P=0.016);在A549细胞中,miR-153的表达量为2624.6±153.4,显著高于阴性对照组(P0.001)。稳转株能在裸鼠体内形成移植瘤,瘤体内明显有EGFP的表达;与阴性对照组的瘤体相比,移植瘤组miR-153的表达量为显著上调(P=0.048)。结论:成功构建过表达miR-153的非小细胞肺癌的稳转细胞株。     

RNA干扰NUP88基因对人乳腺癌MCF-7细胞生长及侵袭力的影响

目的： 构建重组慢病毒介导的NUP88-shRNA载体,通过RNAi技术分别观察沉默NUP88后对MCF-7增殖,粘附,侵袭和转移情况的影响,为乳腺癌的临床基因治疗寻找新的靶点。方法： 构建NUP88重组慢病毒表达载体,包装后检测滴度,以最佳复感染指数转染乳腺癌MCF-7细胞,利用RT-PCR和Western blot检测各组MCF-7细胞中mRNA和蛋白的表达效率;MTT法和流式细胞仪检测法,检测NUP88基因被干扰后对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响;细胞侵袭实验检测NUP88基因被干扰后对MCF-7侵袭力的影响。结果 四组病毒及一组阴性对照均构建成功,滴度均为4E+8TU/ml;RT-PCR和Western blot检测,结果表明：经NUP88-shRNA转染的MCF-7细胞组NUP88 mRNA和蛋白质的表达与经阴性转染组和空白MCF-7细胞组相比,差异明显具有统计学意义（P<0.01）;测定NUP88-shRNA1组沉默效率最高,沉默率可达到86%;MTT法结果表明：实验组经NUP88-shRNA1慢病毒转染后细胞增殖程度显著减少,与空白组和对照组相比有显著性差异（P<0.05）。流式细胞仪检测三组MCF-7细胞凋亡结果表明：实验组经慢病毒转染后细胞凋亡率显著增加,与对照组和空白组相比有显著性差异（P<0.05）;细胞侵袭实验表明：在肿瘤细胞常规培养24h后,实验组与空白组和阴性对照组比较,穿膜细胞数量明显减少,具有显著性差异（P<0.05） 结论： NUP88重组慢病毒可以通过RNAi成功抑制MCF-7中NUP88基因的表达,并能显著抑制其增殖及远处的侵袭能力。     

体外实时动态监测水动力注射分泌型荧光素酶基因的表达

为了建立体外实时动态监测转导基因的体内表达,本研究选择分泌型的荧光素酶基因Gluc作为报告基因,对其体内外表达特性和检测方法进行了研究。首先构建了Gluc表达质粒pAAV2neo-Gluc。将pAAV2neo-Gluc转染体外培养的Huh7、HepG2细胞后,细胞培养上清和细胞裂解液中分别检测到Gluc的活性,而上清比细胞中的含量高约100倍。表明表达的Gluc以分泌形式为主。用水动力法经小鼠尾静脉注射pAAV2neo-Gluc质粒,活体成像表明Gluc在小鼠体内呈全身分布,而注射了萤火虫荧光素酶质粒pAAV2neo-Fluc的对照小鼠则主要在肝脏显像。将剂量分别为0.1、1、10、50μg每只的pAAV2neo-GlucDNA用水动力法尾静脉注射小鼠,不同时间点连续尾静脉采血测定其中的Gluc酶活性,观察其Gluc体内表达和分泌的动态变化。结果显示,各剂量组的Gluc表达变化规律高度一致:注射后2h即可检测到Gluc表达,10h后达到高峰,之后逐渐下降;Gluc的表达水平与注射质粒DNA的量呈正相关;为了进一步观察Gluc检测的灵敏性,本研究又比较了注射更低的质粒剂量(包括0.001、0.01和0.1μg每...     

干扰素γ诱导蛋白16(IFI16)在多发性骨髓瘤中的功能研究

目的：探究干扰素γ诱导蛋白16(IFI16)在多发性骨髓瘤（MM）中的生物学功能。方法：将人多发性骨髓瘤细胞（RPMI-8266）分为Control组（未转染的细胞）、NC-sh组（转染阴性对照shRNA慢病毒的细胞）、IFI16-sh组（转染IFI16 shRNA慢病毒的细胞）、NC-OE组（转染阴性对照过表达慢病毒的细胞）和IFI16-OE组（转染IFI16过表达慢病毒的细胞）。使用Lipofectamine 2000进行细胞转染,培养48 h后收集细胞。通过MTT法和集落形成实验检测细胞增殖。通过Annexin V-FITC和PI染色法检测细胞凋亡。通过Transwell检测细胞侵袭。通过qRT-PCR检测IFI16、Bcl-2、Bax、成纤维细胞生长因子（FGF）1、FGF2的m RNA水平。通过Western blot检测IFI16的蛋白表达水平。将裸鼠随机分为NC-sh组和IFI16-sh组,每组6只。NC-sh组和IFI16-sh组裸鼠分别皮下注射转染NC-sh和IFI16-sh的RPMI-8266细胞悬液。35 d后测量肿瘤体积和肿瘤重量。采用ELISA法检测Th1细胞...     

CD31启动子表达载体的构建与功能鉴定

目的:构建CD31启动子的绿色荧光蛋白和萤光素酶真核表达载体,转染至内皮细胞系HUVEC和BEND3细胞中,对其生物学功能和活性进行初步检测,作为鉴定内皮细胞的新方法。方法:从基因组中钓取CD31启动子的核酸序列,将其插入pGL4.0萤光素酶载体和慢病毒表达载体pCDH-copGFP,经限制性内切酶酶切和测序验证后瞬时转染HUVEC和BEND3内皮细胞系及对照MCF7乳腺癌细胞,通过双萤光素酶实验检测其启动子活性,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果:双酶切与测序结果表明表达载体中正确插入了CD31启动子序列;双萤光素酶实验和荧光显微镜检测发现CD31启动子特异性在内皮细胞中表达。结论:CD31启动子的萤光素酶和绿色荧光表达载体构建成功,可作为鉴定内皮细胞的新型技术手段。     

利用萤光素酶标记的肿瘤细胞建立肝癌原位移植模型及其活体成像

目的：利用生物发光成像技术非侵入性地监测活体裸鼠原位肝癌发展过程。方法：将包含有萤火虫萤光素酶基因的pCI-neo-Luc载体转染人肝癌HepG2细胞系,筛选获得具有高萤光素酶活性的细胞克隆;利用流式细胞仪对萤光素酶表达的稳定性进行初步研究,并分析细胞的生物发光情况;持续表达萤光素酶的肿瘤细胞培养扩增后被植入裸鼠皮下,2周后以形成的异体瘤作为供体瘤,进行肝脏原位移植手术;对建立的肝癌原位移植模型,用影像学资料显示肿瘤部位,用IVIS成像系统动态监测肿瘤生长情况。结果：体外影像的结果显示,表达萤光素酶细胞的数量与发光强度呈正相关;活体成像的结果显示。成功地建立了萤光素酶标记的原位肝癌动物模型。结论：生物发光成像可以监测活体内肝癌演进过程,为抗肿瘤药物的筛选和评价提供了新的手段和工具。     

人结肠腺癌细胞HCT－8绿色荧光标记肿瘤模型的建立

目的筛选表达绿色荧光蛋白基因的人的单克隆结肠腺癌细胞系,为体内监测肿瘤的早期生长建立一种新的肿瘤动物模型。方法以脂质体2000介导chicken β－acfin-GFP—NEO转染人结肠腺癌细胞HCT－8,经梯度浓度G418筛选获得稳定表达绿色荧光蛋白的细胞克隆并扩大培养。BALB／CA－nu裸鼠皮下接种1×10^6个发光细胞使其成瘤,活体荧光成像系统观察肿瘤的生长情况。结果获得了稳定表达GFP的人结肠腺癌细胞株,将其接种到裸鼠体内可成瘤,利用活体成像系统观察了肿瘤的生长过程,肿瘤的发光随着观察时间的延长而增加。结论绿色荧光蛋白能够在人结肠腺癌细胞HCT-8中长期稳定表达,用绿色荧光蛋白标记的人结肠腺癌细胞HCT-8建立的裸鼠肿瘤模型为进一步研究结肠肿瘤和相应的药物筛选提供了一种简便、可行的新方法。     

用于活体成像的小鼠肺癌移植瘤模型的建立

本研究旨在建立可用于活体成像的小鼠肺癌移植瘤模型。利用脂质体将荧光素酶表达载体pGL4.17(luc2/neo)转染至人非小细胞肺癌细胞株A549,经G418筛选获得稳定表达荧光素酶的细胞克隆。根据体外生物发光情况及细胞的生长特性,从中挑选合适克隆,进行裸鼠皮下接种,SCID鼠尾静脉接种,建立肺癌移植瘤模型。利用活体成像系统监测肿瘤的生长转移情况,并用切片HE染色进一步验证小鼠模型移植瘤的原位成瘤和转移能力。实验结果表明:本研究成功地构建了可用于活体成像的小鼠肺癌移植瘤模型,模型稳定可靠、直观、灵敏,为肿瘤生长转移机制的研究及抗肿瘤药物的研发提供了重要工具。     

Successful establishment of an orthotopic hepatoblastoma in vivo model in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice

Investigation of hepatoblastoma in experimental conditions contributes relevantly to a detailed understanding of tumor biology and the investigation of new treatment approaches. Most systematical analyses currently use subcutaneous xenografts. We established a reproducible intrahepatic model with the hepatoblastoma-cell lines HuH6 and HepT1. The cells were stably transfected with a plasmid vector encoding for Gaussia luciferase. HuH6 and HepT1 were injected intrasplenically in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice. Mice were splenectomized in order to avoid intrasplenical tumor growth. Multifocal intrahepatic tumor growth was observed in 85% (11/13) of HuH6 tumors and 55% (5/9) of HepT1 tumors. Serum Alpha-fetoprotein and Gaussia luciferase increased 5 weeks after tumor-cell inoculation. Tumors were detected by MRI at this time point. Immunhistochemical analysis such as vascularity (CD31), proliferation index (Ki-67), cytokeratin 7 and distribution of β-catenin in intrahepatic tumors were different to subcutaneous tumors. We established a reproducible xenograft model for intrahepatic hepatoblastoma growth with a high tumor incidence. Monitoring of tumor cell viability was optimized by measuring GLuc. This model enables further experimental investigations of HB in a more physiological milieu as emphasized by the β-catenin distribution.     

人EGFR显性负性突变体对胃癌细胞体内成瘤及淋巴结转移的影响

为了研究人表皮生长因子显性负性突变体(dominant negative mutant of EGFR, dnEGFR)对胃癌细胞体内成瘤及淋巴结转移的影响,用目的质粒pEGFPN1 dnEGFR,空质粒载体pEGFP N1分别转染胃癌细胞NCI-N87.筛选出稳定转染株,实验共分3组：NCI-N87细胞未转染组（untreated NCI-N87,UN组）,NCI-N87细胞pEGFP-N1转染组（EN组）;NCI-N87细胞pEGFPN1-dnEGFR转染组（DN组）.将3组细胞接种于裸鼠右后足垫,6周后测量移植瘤大小及对应腹股沟转移淋巴结数目,HE染色验证,real-time PCR和Western 印迹检测3组细胞中AKT1、MAPK3 mRNA和蛋白的表达改变.结果发现,DN组移植瘤较UN、EN组明显缩小（P<0.05）,且右腹股沟转移淋巴结数目较UN、EN组减少（P<0.05）.DN组细胞中,AKT1、MAPK3 mRNA和蛋白水平较UN、EN组降低（P<0.05）.提示pEGFPN1-dnEGFR可抑制裸鼠体内胃癌细胞成瘤及淋巴结转移,AKT1及MAPK3信号通路可能参与其中.     

RNA干涉介导的Plk1沉默对乳腺癌细胞恶性生物表型的影响

目的：研究乳腺癌细胞中丝／苏氨酸蛋白激酶Plk1基因表达下调后对其恶性生物表型的影响。方法：利用pSitencer4．1-CMVneo质粒,分别构建针对Plk1基因的RNA干涉载体（pSilencer4．1-shPlk1）,利用脂质体Lipofectamine2000转染MCF-7细胞,G418筛选稳定的转染细胞系。半定量RT—PCR和Western blot分别检测Plk1基因mRNA和蛋白表达,MTT和克隆形成试验检测细胞增殖活性的变化,流式细胞仪分析细胞周期和凋亡的变化,最后分析MCF-7细胞对紫杉类药物（紫杉醇和多西他赛）化疗敏感性的变化。结果：成功筛选了稳定转染细胞系（MCF-7／shPlk1和MCF-7／shcontro1）。同MCF-7／shPlk1细胞相比,MCF-7／shPtkl细胞中Plk1基因mRNA和蛋白表达水平分别下调65．8％和74．4％（P〈0．05）。同MCF-7／shcontrol,MCF-7tshPlk1细胞增殖速度显著抑制,到第5天时抑制率达到44．9±3．2％（P〈0．05）。同时,MCF-7／shPlk1细胞的克隆形成能力显著降低（P〈0．01）流式细胞仪技术分析细胞周期结果表明：MCF-7／shPlk1细胞的G2／M期细胞比例显著增加了21．1±4．1％,而S期细胞比例则显著降低了（18．5±3．1％;P〈0．05）。流式细胞仪技术分析细胞凋亡结果表明：MCF-7／shPlk1细胞的凋亡率约显著增加了13．1±213％（P〈0．05）,同时还发现：MCF-7／shPlk1细胞中激活的caspase-3蛋白显著增加,Bcl-2蛋白显著降低,而Bax蛋白则显著增加。结论：RNA干涉载体能特异性下调乳腺癌细胞中Plk1基因的表达,从而抑制乳腺癌细胞的增殖和体外克隆形成能力,同时诱导乳腺癌细胞的G2／M期阻滞和细胞凋亡率显著增加。因此,靶向Plk1基因的生物治疗有望成为未来临床乳腺癌的一个重要的辅助治疗策略.