反义RNA抑制猪传染性胃肠炎病毒复制的研究

根据反义RNA作用原理,设计一条互补猪传染性胃肠炎病毒基因(26888—27184)区的反义RNA序列。将该序列与逆转录病毒表达载体构建成质粒PLXSN—N5’,并与质脂体共转染PA317细胞,经G418(500μg／ml)筛选出稳定的产毒细胞克隆。取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,测定细胞克隆产生的假病毒滴度,用高滴度假病毒感染IBRS2细胞。提取被感染的IBRS2细胞总DNA和RNA,通过PCR和RT_PCR证明PL,XSN—N5’整合到IBRS2细胞基因组。病毒感染细胞病变表明,反义RNA有明显抑制TGEV复制的作用。     

人IL-12重组逆转录病毒载体在HeLa细胞中的表达

目的:包装携带人白细胞介素12(IL-12)的逆转录病毒,用于宫颈癌的治疗研究.方法:携带IL-12的逆转录病毒重组质粒pL35P40SN经PA317细胞包装,G418筛选.在NIH3T3细胞进行病毒滴度测定.然后用病毒感染人宫颈癌细胞HeLa.PCR、RT-PCR方法检测IL-12基因在HeLa中的整合和表达情况.结果:重组质粒pL35P40SN经PA317细胞包装后收获病毒上清,感染HeLa细胞,检测发现IL-12基因整合到细胞基因组DNA中,并且能有效的转录.结论:成功包装了携带IL-12基因的逆转录病毒,该病毒能有效感染HeLa细胞,并使携带的基因IL-12在细胞中表达,为今后IL-12基因治疗宫颈癌的研究奠定基础.     

反义RNA抑制猪传染性胃肠炎病毒复制的研究

根据反义RNA作用原理,设计一条互补猪传染性胃肠炎病毒基因(26888-27184)区的反义RNA序列.将该序列与逆转录病毒表达载体构建成质粒PLXSN-N5',并与质脂体共转染PA317细胞,经G418(500μg/ml)筛选出稳定的产毒细胞克隆.取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,测定细胞克隆产生的假病毒滴度,用高滴度假病毒感染IBRS2细胞.提取被感染的IBRS2细胞总DNA和RNA,通过PCR和RT-PCR证明PLXSN-N5'整合到IBRS2细胞基因组.病毒感染细胞病变表明,反义RNA有明显抑制TGEV复制的作用.     

携带猪γ干扰素基因逆转录病毒载体的构建及其在猪肾细胞(PK-15)中的表达

将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系PA317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的PA317细胞系。从细胞培养上清中提取RNA,进行RT-PCR检测,扩增到目的片段;将上清感染猪肾细胞(PK-15),经含G418(400μg/mL、600μg/mL和800μg/mL)的DMEM筛选一周,间接免疫荧光表明表达的猪γ干扰素主要锚定于细胞膜。收取PK-15细胞上清,在牛肾细胞(MDBK)上进行干扰素抗病毒活性检测,结果显示重组病毒表达的猪γ干扰素抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性为1200IU/106cells.48h。以表达的干扰素处理PK-15细胞后,经细胞病变抑制法测定,重组猪γ干扰素可以抵抗口蹄疫病毒(FMDV)感染。试验结果表明猪γ干扰素基因已成功插入逆转录病毒基因组并在PK-15细胞中表达,表达的重组猪γ干扰素具有较强的抗病毒生物活性。     

人神经营养因子-3重组逆转录病毒的包装与鉴定

在逆转录病毒载体pLXSN中引入人神经营养因子-3(hNT-3),构建成重组质粒pLXSN-NT3,转染包装细胞PA317后经G418筛选得到几个稳定产毒的细胞克隆.测定这几个克隆的病毒滴度,最高达到1.60×105,且产毒细胞株不产生复制型病毒.PCR和大乳鼠背根神经节活性检测证明hNT-3已整合到宿主细胞基因组并能稳定表达.     

人神经营养因子-3重组逆转录病毒的包装与鉴定

逆转录病毒载体pLXSN中引入人神经营养因子-3(hNT-3),构建成重组质粒pLXSN-NT3,转染包装细胞PA317后经G418筛选得到几个稳定产毒的细胞克隆。测定这几个克隆的病毒滴度,最高达到1.60×10⁵,且产毒细胞株不产生复制型病毒。PCR和大乳鼠背根神经节活性检测证明hNT-3已整合到宿主细胞基因组并能稳定表达。     

正义、反义MCP-1基因逆转录病毒载体重组质粒的构建和包装

为构建含单核细胞趋化蛋白-1(Monocytechemoattractantprotein-1,MCP-1)基因的重组逆转录病毒pLXSN/MCP-1质粒.用RT-PCR技术从大鼠系膜细胞中扩增出MCP-1全长DNA,将其与Pgem-TE连接,用限制性内切酶EcoRⅠ对pTE-MCP-1和逆转录病毒质粒pLXSN分别进行酶切.在T4连接酶的作用下,构建重组逆转录病毒质粒pLXSN/MCP-1.经BglⅡ,XhoⅠ酶切鉴定MCP-1在质粒中的方向,用脂质体介导的方法把重组质粒DNA转染进入包装细胞PA317中,经过G418筛选出抗性克隆.通过NIH3T3细胞测定病毒液的病毒滴度.结果证实经过RT-PCR技术从大鼠系膜细胞中扩增出MCP-1全长DNA与所需的大小一致.重组质粒经酶切分析与预期的结果一致.G418筛选出抗性克隆,能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒.NIH3T3细4胞测定病毒滴度为17×10cfu/mL.     

Anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/zeta转染人T淋巴细胞对原代CLL细胞的作用

目的:将已成功构建表达anti-CD20scFv/CD80/CD28/zeta转染人T淋巴细胞,体外观察该类细胞特异性清除CD20+原代慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞的能力,为肿瘤的过继免疫治疗提供新思路。方法:将本室成功构建的含anti-CD20scFv/IgGFc/CD80片段的PLNCX质粒,转染PA317包装细胞,挑取高滴度的包装细胞株收获逆转录病毒,用收获的病毒感染刺激分裂的人外周血T细胞,经G418筛选后与CD20+原代CLL细胞在体外共同培养,在显微镜下观察CD20+的原代CLL细胞生长状态,ELISA检测试剂盒检测T细胞分泌细胞因子的功能。结果:重组基因修饰的T细胞能在体外杀伤CD20+原代CLL细胞,而对CD20-细胞无杀伤作用;同时靶细胞为CD20+组上清液中IL-2(1301.00pg/ml)和IFN-γ(602.18pg/ml)水平与CD20-组相比明显升高。结论:嵌合锚定T细胞能够成功构建;该类T细胞在体外能特异性杀伤CD20+的原代CLL细胞。     

携带HSV-1TK基因的逆转录病毒载体构建及在HeLa细胞中的表达

目的:构建携带单纯疱疹病毒脱氧胸腺嘧啶激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)的逆转录病毒,用于宫颈癌的治疗研究。方法:用限制性内切酶从质粒pcDNA3.1/HA-myc-His(-)Z-TK切下HSV-1TK cDNA序列,亚克隆入逆转录病毒载体pLXSN得到重组质粒pLXSN-TK,鉴定正确的阳性重组质粒经PA317细胞包装,G418筛选,在NIH3T3细胞进行病毒滴度测定。然后用病毒感染人宫颈癌细胞HeLa。PCR、RT-PCR和Western blotting方法检测HSV-1TK基因在HeLa中的整合和表达情况。结果:重组质粒pLXSN-TK经PA317细胞包装后收获病毒上清,感染HeLa细胞,检测发现HSV-1TK基因整合到细胞基因组DNA中,并且能有效的转录和翻译。结论:成功构建了逆转录病毒pLXSN-TK,该病毒能有效感染HeLa细胞,并使携带的治疗基因HSV-1TK在细胞中表达,为今后HSV-1TK基因治疗宫颈癌的研究奠定基础。     

重组逆转录病毒介导的转蚓激酶基因兔

目的通过重组逆转录病毒介导获得转蚓激酶基因家兔。方法将含有蚓激酶基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLNCL中获得了蚓激酶重组逆转录病毒载体,利用脂质体转染PA317包装细胞,G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清直接注射雄性兔的睾丸组织转染精原干细胞。结果病毒上清经NIH3T3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×104CFU/mL。病毒注射3月龄兔睾丸组织,过1.5个月取其睾丸、肾、脾、肝、肺进行组织切片观察,结果正常。提取交配所得F0、F1代仔兔基因组,经PCR、Southern检测,转基因阳性率F0代为6.3%(2/32)、F1代为15.3%(2/13)。结论通过重组逆转录病毒直接注射3月龄兔睾丸组织可获得转基因兔,病毒对兔的脏器无损害。