北京地区成人呼吸道感染患者中 HCoV-HKU1感染的初步分析与基因型确定

目的:对北京地区成人呼吸道感染患者中人冠状病毒(HCoV)HKU1的感染状况进行初步分析,了解其流行分布、临床特点,并确定流行株的基型别.方法:2011年1月~2012年1月从北京地区成人呼吸道感染患者中收集鼻咽拭子标本559份,利用靶向棘突蛋白 S 与核心蛋白 N 的2种巢式 PCR 方法进行 HCoV-HKU1筛查,并对阳性片段进行序列测定,以确定其基型别;同时,对阳性标本进行常见呼吸道病毒的共感染筛查,进而分析 HCoV-HKU1感染的临床表现和流行病学特点.结果:559份鼻咽拭子标本中检出 HCoV-HKU1阳性9例(1.61%),其中3例合并HCoV-OC43感染;感染患者临床表现为急性呼吸道症状,以发热(88.9%)、咽痛(66.7%)、寒颤(68%)、流涕(55.6%)和咳嗽(44.4%)为主,其中1例有系统性红斑狼疮史;阳性基片段系统进化分析发现这9例感染均为 HCoV-HKU1 B型.结论:北京地区近年成人呼吸道感染患者中 HCoV-HKU1感染率较低(1.61%),其流行株基型为 B 型.     

严重急性呼吸道感染病例中人冠状病毒OC43基因特征分析

人冠状病毒(Human coronavirus,HCoV)是导致人呼吸道感染的重要病原之一。为了从分子水平上探讨严重急性呼吸道感染(Severe acute respiratory infection,SARI)病例中HCoV-OC43的基因特征,本研究应用实时荧光定量(Real-time)PCR方法对2019年河南省374份SARI病例样本进行HCoV-OC43核酸筛查,并对核酸检测阳性样本进行棘突蛋白(Spike,S)、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)三个靶基因扩增和序列测定。结合从GenBank数据库筛选的国内外42条代表序列和本研究所获得的S、RdRp和N三个靶基因全长序列构建基因亲缘性关系树,对本研究所获得的HCoV-OC43样本进行基因型别鉴定和基因特征分析,并对HCoV-OC43重要抗原S蛋白进行氨基酸位点变异分析。结果显示:在374份SARI病例样本中共检测出15份HCoV-OC43核酸阳性样本(15/374,4.01%),并在4份临床样本中获得S、RdRp和N基因全长序列。通过构建基因亲缘性关系树,结果显示有3株属于G基因型,1株属于H基因型。S蛋白氨基酸位点变异分析结果提示,2019年G基因型流行株(包括本研究的3株和美国株USA/MN306041/SC0810/2019)有特异性的3个氨基酸位点变异:L272P、P516S和S902A。2019年H基因型流行株(包括本研究的1株和美国株USA/MN306043/SC0841/2019)特异的氨基酸位点变异为N484D。本研究通过对2019年河南省流行的HCoV-OC43进行基因型别鉴定与基因特征分析,为我国HCoV-OC43的分子变异变迁研究提供了基线数据。     

儿童急性呼吸道博卡病毒感染

了解博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)在我国儿童急性呼吸道疾病中的感染情况。采用PCR扩增的方法对2005年10月~2006年1月收集的72例急性呼吸道感染的住院儿童鼻咽抽吸物(nasopharyngeal aspirates,NPA)进行了HBoV基因检测。将PCR阳性产物进行TA克隆,测序,并将所测序列与GenBank中HBoV序列进行比较分析。72份标本中共检测到6份HBoV阳性扩增产物,阳性率为8.3%(6/72),该6例HBoV阳性患儿临床均有肺炎或支气管肺炎症状。由此可以初步看出HBoV可能也是儿童急性呼吸道感染中较为重要的一个病原,且可能与儿童急性下呼吸道感染存在相关性。     

五株人冠状病毒NL63的基因型鉴定及S1domain基因特征分析

为阐明我国部分地区人冠状病毒(Human coronavirus,HCoV)NL63基因特征,本研究对2013年陕西省、2018年河南省和湖南省送检的5株HCoV-NL63核酸检测阳性的呼吸道样本进行HCoV-NL63基因型别鉴定及S1 do-main基因特征分析。通过对HCoV-NL63棘突蛋白(Spike glycoprotein,S)基因的S1 domain区域进行基因扩增和序列测定,同时结合GenBank数据库下载的1983～2018年其他国家74条HCoV-NL63代表株序列和2007～2010年中国流行的12条HCoV-NL63代表株序列,构建基因亲缘性关系树,并对S蛋白的S1 domain区域进行核苷酸序列比对分析。结果提示全球HCoV-NL63流行株可划分为A和B两个基因型;A基因型可进一步划分为A0,A1,A2和A3四个基因亚型,其中本研究将GenBank中2008年中国流行的2株HCoV-NL63毒株划分为新基因亚型(A3);B基因型可进一步划分为B0,B1和B2三个基因亚型。A和B基因型的HCoV-NL63代表株序列在地域分布上无明显差异,但A基因型不同基因亚型的HCoV-NL63序列在年代分布上呈现出一定的时间进化趋势。在我国A和B基因型HCoV-NL63均已被检测到,但主要以A基因型流行为主,且主要集中在A1和A2基因亚型。不同基因型HCoV-NL63序列在S1 domain区域核苷酸和氨基酸序列上存在特征性差异。本研究通过对五株HCoV-NL63基因型鉴定及S1 domain基因特征分析,初步阐明了我国部分地区流行的HCoV-NL63基因型/基因亚型分布情况及基因特征,丰富了我国本土流行的HCoV-NL63基因数据库,为我国HCoV-NL63分子流行病学研究及分子检测和监测技术的改进和验证提供了基础基因数据。     

一株马冠状病毒的分离鉴定及遗传演化分析

马冠状病毒病是由马冠状病毒(equine coronavirus, ECoV)引起的一种马新发胃肠道病毒病,成年马感染后主要出现发烧、腹痛和腹泻等症状。1975年,马冠状病毒感染首次在美国出现,此后在多个国家和地区均有流行,此前我国仅从山东腹泻驴的小肠样品中分离得到了一株重组马冠状病毒。【目的】了解ECoV中国毒株的基因组成、亲缘关系以及生物学特性,可以为我国ECoV流行现状和遗传演化趋势提供依据,为ECoV防控产品的研发提供材料。【方法】对湖北省武汉市黄陂区腹泻马匹的粪便样品进行RT-PCR检测,对检测阳性样品进行病毒分离,并利用靶向ECoV S1蛋白的单克隆抗体通过间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)对分离的病毒进行验证。根据ECoV-JL株全基因组测序结果,对全基因组、N基因和NS2基因进行了基因组系统发育分析和同源性比较。【结果】成功分离到一株ECoV,并命名为ECoV-JL。透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)观察分离到的病毒颗粒呈球状,且具有囊膜和冠状病毒典型的纤突结构。该分离株感染HRT-18细胞72 h后病毒滴度可到达峰值,半数组织培养感染剂量(tissue culture infectious dose 50%, TCID₅₀)约为10^6.16 TCID₅₀/mL。ECoV-JL毒株可以在人回盲肠癌(human ileocecal cancer-18, HRT-18)细胞、人结直肠腺癌(human colorectal adenocarcinoma-2, Caco-2)细胞和人肝癌(human liver cancer cells, Huh7)细胞上稳定传代。ECoV-JL株与GenBank中现有的ECoV全基因组序列相似性为97.9%-99.0%,系统发育分析发现ECoV-JL株属于单独的演化分支,与其他毒株的亲缘关系较远,说明ECoV-JL株可能是重组变异而来,其中NS2基因突变较多,NS2基因编码的差异是造成ECoV-JL株与其他毒株同源性较差的主要原因。【结论】本研究从腹泻马的粪便样品中成功分离并鉴定了一株ECoV,将其命名为ECoV-JL株,对该毒株生物学特性和亲缘关系的研究反映了湖北地区流行毒株的特点,为我国ECoV流行现状和演化趋势提供重要依据。     

普通冠状病毒229E株的分子流行病学分析

目的明确哈尔滨地区普通冠状病毒229E(Human Coronavirus-229E,HCOV-229E)株的流行和变异情况及其与SARS-CoV的异同,为进一步掌握该地区常见上呼吸道病毒的流行规律及预防,乃至疫苗的制备打下基础。方法利用RT—PCR法对2003年上半年采集的部分发热病人血清及血细胞进行筛选,同时采用基因测序、序列分析等手段对扩增的HCOV-229E N gene片断进行蛋白和基因分析。结果55例标本中HCOV-229E RNA阳性病例5例,占9．09％;测序结果看出哈尔滨地区检出229E株N基因的序列与已公布的HCOV-229E Ngene(295—802)序列完全相同,所测片断为HCOV-229E N gene的部分序列。该基因与猪流行性腹泻病毒、犬冠状病毒、TGEV及猫感染性腹膜炎病毒有一定同源性;但与已公布的SARS-CoV N gene序列比较,相似性小于1％。结论(1)该地区发热病人普通冠状病毒229E株阳性率为9．09％;(2)哈尔滨地区流行的HCOVN基因无变异发生;(3)HCOV-229E与猪流行性腹泻病毒、犬冠状病毒、TGEV和猫感染性腹膜炎病毒有一定的同源性;(4)哈尔滨地区HCOV-229E N gene与SARS-CoV N gene相似性小于1％。     

圈养小熊猫几种病毒的PCR检测

本文采用巢式PCR/ RT-PCR 方法,对我国10 个动物园中无临床症状的圈养小熊猫的71 个肛拭子和61 个唾液拭子样品,进行犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬腺病毒(CAV)和犬疱疹病毒(CHV)的检测,以评估我国圈养小熊猫是否面临这几种病毒的威胁。对阳性PCR 结果进行测序分析,并与GenBank 上的序列进行比较。结果,在肛拭子样品中检测到3 个CPV 和6 个CCV 阳性结果,经测序后,与GenBank 上序列的同源性分别达99% 和100% 。而在唾液拭子样品中没有检测到任何阳性结果,且CDV、CAV和CCV 的检测结果均为阴性。从阳性CPV 的肛拭子样品中分离到一株细小病毒毒株,表明圈养小熊猫已受到细小病毒和犬冠状病毒的感染,今后应加强这两种病毒的预防工作。本文所采用的PCR 方法检测病毒性疾病,能检测到微量的病毒模板,可对小熊猫病毒性感染进行早期诊断。     

冬季急性下呼吸道感染住院儿童病原学分析及临床流行病学特点

目的了解冬季儿童急性下呼吸道感染病原谱及临床流行病学特征,为临床抗感染及病原检测提供依据。方法对我院2006年12月～2007年2月急性下呼吸道感染住院患儿采用一次性无菌吸痰管经鼻腔插入7～8cm,达到咽部以下负压吸取1～2ml深部鼻咽分泌液送细菌培养,并对呼吸道合胞病毒(RSV),腺病毒(ADV),A、B型流感病毒(IFV),1、2及3型副流感病毒(PIV)等7种常见呼吸道病毒抗原进行检测及运用荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测标本中支原体和衣原体DNA。结果①381份下呼吸道感染儿童痰标本中细菌培养阳性81份,病毒检测阳性133份,支原体和衣原体阳性分别12份与6份,混合感染标本44份,总标本病原学检出率为50.66%(193/381)。②RSV阳性标本112份,为最重要的感染病原,连续3个月RSV检出率均在30%左右,6月龄以下儿童占61.61%,2岁以下儿童占86.61%,阳性标本中78.57%的患儿有喘息表现。③大肠埃希菌(16株)、肺炎链球菌(14株)、肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌(各10株)、卡他莫拉菌布兰汉亚种(8株)、流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌(各6株)表现为主要的致病菌。结论RSV感然仍为儿童冬季急性下呼吸道感染最主要的病原,尤其在2岁以下儿童,且易表现为喘息发作。仍有40%以上感染病原未明,儿童急性下呼吸道感染病原谱需进一步完善。     

猪丁型冠状病毒HB-BD株的分离与鉴定

猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新的引起仔猪腹泻的冠状病毒,目前国内对PDCoV分离的研究较少。为从腹泻仔猪粪便及肠道内容物中分离鉴定PDCoV,本研究将RT-PCR检测为PDCoV病原阳性的腹泻样本,接种到ST细胞,进行病毒的分离传代。通过观察其细胞病变,RT-PCR和间接免疫荧光方法检测鉴定,并对分离株的S、M、N基因进行测序鉴定及序列分析。结果成功分离得到了PDCoV HB-BD株。经序列同源性分析发现,HB-BD分离株S、M和N基因与近年来国内外的流行毒株同源性很高,核苷酸同源性分别为95.8%～99.1%、98.6%～99.4%和97.8%～99.4%。进化树分析表明HB-BD分离株与中国毒株亲缘关系比其他国家近,处于同一分支。结果证实从腹泻仔猪的肠道内容物中分离并鉴定得到了一株猪丁型冠状病毒,本研究为后续分离株的致病性及生物学特性研究奠定了基础。     

新型冠状病毒荧光定量PCR的Ct值与病毒分离的结果分析

为探究利用SARS-CoV-2的ORF1ab基因和N基因作为靶标进行荧光定量检测的Ct值与SARS-CoV-2病毒分离阳性率之间的关系。本研究对广州入境的新型冠状病毒肺炎输入病例临床样本进行荧光定量PCR检测和用Vero细胞进行病毒分离,统计病毒分离率与荧光定量PCR检测Ct值之间的关系,再通过logistics回归模型用Ct值来预测病毒分离率;同时对收集到的临床样本进行三代测序及进化树的构建。结果显示,在160例新型冠状病毒肺炎输入病例临床样本中,分离到74株新型冠状病毒,分离阳性率为46.25%,分离到包括20株Alpha、9株Beta、2株Delta等VOC毒株和2株Epsilon、1株Eta等VOI毒株,其他变异株42株;病例样本荧光定量PCR检测ORF1ab基因Ct值为16.12～39.00,N基因的Ct值为17.82～39.41;病毒分离率与样本荧光定量PCR检测的ORF1ab基因和N基因的Ct值均呈负相关,在Ct值>31时,分离率仅9.10%(6/66),而当Ct值<23.1时,病毒分离阳性率可超过95%,分离到新冠病毒的病例样本荧光定量PCR检测的ORF1a...     

冠状病毒

冠状病毒(coronavirus)是一种常见的单链、非片段化、线性、正链RNA包膜病毒,能感染脊椎动物而引起,特别是呼吸系统疾病。此病毒可分三大类,感染不同动物,其遗传物质RNA表现出一种特殊的、有趣的、目前并不为人们完全所知的策略完成其自身繁殖。最近,科学家发现“非典型肺炎”的病原体为一种新型的冠状病毒,表现出其特别的基因组结构,有别于已知的典型冠状病毒,相关研究正在进行中。     

Two Inhibitors Against the 3C-Like Proteases of Swine Coronavirus and Feline Coronavirus

Virologica Sinica - Coronaviruses (CoVs) are important human and animal pathogens that cause respiratory and gastrointestinal diseases. Porcine epidemic diarrhoea (PED), characterized by severe...     

冠状病毒的新成员--SARS-CoV的基因组特性

2003年3月,人类发现一种新的冠状病毒SARS-CoV,这种病毒是非典型性肺炎(SARS)的病原体。SARS-CoV的基因组序列已经由包括中国科学家在内的全世界的科研人员测定完成。该文对国际报道的SARS病源的基因序列进行了收录,阐述了SARS-CoV基因组的基本特性：SARS-CoV的基因组长约28-30kb,与冠状病毒科的基因组长度相符合,其中包括11个编码序列,基因组的组织方式也与其他冠状病毒类似,从表面蛋白(S蛋白)、外膜蛋白(M蛋白)和核蛋白(N蛋白)上看,SARS病毒与其他冠状病毒的对应蛋白进化关系接近。同时发现,在某些区域,SARS病毒的基因序列与其他冠状病毒存在相当大的差异,具有自身比较保守的基因组序列结构。而且氨基酸的序列也与其他冠状病毒有很大程度的不同。基因信息的冗余分析表明,SARS-CoV具有较低的冗余度,即发生变异的可能性比较大。虽然SARS-CoV外表与冠状病毒类似,亲缘关系未超出冠状病毒科界限,但由于蛋白基因与氨基酸的序列与其他冠状病毒有本质不同,因此可能不是其他冠状病毒的变异体,而是一种与冠状病毒类似、但早已独立存在、此前未被人类所认识的新病毒。     

冠状病毒的基因组结构及特征

冠状病毒(Coronavirus)是具有包膜的正单链RNA病毒,基因组大小介于26 000与32 000 nt之间,编码刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核壳蛋白(N)等四种结构蛋白、复制酶(ORF1a/b)与若干辅助蛋白,部分病毒还具有血细胞凝集素酯酶(HE),这些蛋白除维持病毒结构,还有促进感染与抵抗宿主免疫反应等功能,其中刺突蛋白可与宿主细胞表面的受体结合,使病毒包膜和宿主细胞的膜融合以感染细胞.冠状病毒的感染会影响细胞的许多信号转导途径,引发免疫反应,是一类可感染哺乳动物与鸟类的病毒.     

新型冠状病毒肺炎与mNGS技术

新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)是指2019新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染导致的肺炎。截至2020年5月21日已造成全球超过496万人感染、30万人以上死亡。宏基因组下一代测序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)技术是在发现和检测新冠肺炎中发挥重要作用的技术。本文介绍了mNGS在新冠肺炎疫情中的作用及核心技术特点,并为mNGS在抗击全球疫情中的应用做出技术性归纳总结。     

SARS相关冠状病毒及其基因组

正在全球部分地区流行的严重急性呼吸综合征(SARS),由于其传染性强、危害性大而引起了广泛关注。各国实验室密切协作,在数月时间内分离出了SARS冠状病毒(SARSCoV),测定了病毒基因组序列,并在猴体内初步再现出SARSCoV所致肺部疾病与人相似,这些工作为遏制SARS的蔓延发挥了重要作用。现就SARSCoV的鉴定、基因组及其产物的结构与功能做一综述。     

Feline Coronavirus Type II Strains 79-1683 and 79-1146 Originate from a Double Recombination between Feline Coronavirus Type I and Canine Coronavirus

Recent evidence suggests that the type II feline coronavirus (FCoV) strains 79-1146 and 79-1683 have arisen from a homologous RNA recombination event between FCoV type I and canine coronavirus (CCV). In both cases, the template switch apparently took place between the S and M genes, giving rise to recombinant viruses which encode a CCV-like S protein and the M, N, 7a, and 7b proteins of FCoV type I (K. Motowaka, T. Hoh- datsu, H. Hashimoto, and H. Koyama, Microbiol. Immunol. 40:425–433, 1996; H. Vennema, A. Poland, K. Floyd Hawkins, and N. C. Pedersen, Feline Pract. 23:40–44, 1995). In the present study, we have looked for additional FCoV-CCV recombination sites. Four regions in the pol gene were selected for comparative sequence analysis of the type II FCoV strains 79-1683 and 79-1146, the type I FCoV strains TN406 and UCD1, the CCV strain K378, and the TGEV strain Purdue. Our data show that the type II FCoVs have arisen from double recombination events: additional crossover sites were mapped in the ORF1ab frameshifting region of strain 79-1683 and in the 5′ half of ORF1b of strain 79-1146.     

Recombination and Coronavirus Defective Interfering RNAs

Naturally occurring defective interfering RNAs have been found in 4 of 14 coronavirus species. They range in size from 2.2 kb to approximately 25 kb, or 80% of the 30-kb parent virus genome. The large DI RNAs do not in all cases appear to require helper virus for intracellular replication and it has been postulated that they may on their own function as agents of disease. Coronavirus DI RNAs appear to arise by internal deletions (through nonhomologous recombination events) on the virus genome or on DI RNAs of larger size by a polymerase strand-switching (copy-choice) mechanism. In addition to their use in the study of virus RNA replication and virus assembly, coronavirus DI RNAs are being used in a major way to study the mechanism of a high-frequency, site-specific RNA recombination event that leads to leader acquisition during virus replication (i.e., the leader fusion event that occurs during synthesis of subgenomic mRNAs, and the leader-switching event that can occur during DI RNA replication), a distinguishing feature of coronaviruses (and arteriviruses). Coronavirus DI RNAs are also being engineered as vehicles for the generation of targeted recombinants of the parent virus genome.