大肠杆菌α-D-半乳糖苷酶的提纯及特性*

大肠杆菌中与抗原K(?)s ab基因相连锁的棉子糖操纵子(raf)编码的α-D-半乳糖苷酶经硫酸铵沉淀,Sepharose 4B和DEAE纤维素等提纯步骤获纯化品,其在PAGE上呈单一电泳区带,分子量80000。粗酶品经Sepharose 4B后呈现为两个酶活性峰。该酶特性与染色体编码的同功酶有明显差异。最适温度为35—37℃,最适Ph 7.5。以PNPG、蜜二糖、棉子糖为底物,其米氏常数分别为0.11,2.1和136mmol/L。Mn²⁺离子影响酶稳定性,然而可以被巯基试剂消除。双     

大肠杆菌棉子糖操纵子a-半乳糖苷酶表达的调节控制

大肠杆菌棉子糖操纵子(raf)位于质粒,其第一结构基因rafA编码的a-半乳糖苷酶为诱导酶。Rat操纵子比乳糖操纵子(lac)或蜜二糖操纵子(mel)对诱导物有更严格的结构特异性。该酶被蜜二糖或棉子糖诱导,也被D-半乳糖微弱诱导,但不受乳糖、PNPG等结构相近糖所诱导。A-半乳糖苷酶的酶诱导形成能力在对数生长末期出现高峰。Rat 操纵子基因结构组成及调节与乳糖操纵子相似。以阻遏物为中介的负调控在raf操纵子调节中起主要作用,同时以环腺苷一代谢降解物基因激活蛋白(cAMP-CAP)为中介的正调控也参与调节。当0．4％葡萄糖加入到其它碳源培养基时,该酶表达水平下降至原活力的1／2—1／3。无论诱导或组成型酶的葡萄糖抑制均未见瞬时抑制。腺苷环化酶(cya)缺失或环腺苷受体蛋白(crP)和cya双缺陷菌株的酶表达则分别下降到原活力的9％和2．5％。Cya突变株或葡萄糖对raf操纵子表达的抑制可被cAMP解除,但cya和crP双缺陷菌株仍有葡萄糖抑制,而且这种抑制不为cAMP抵消,表明通过降低cAMp而影响cAMP-CAP复合体形成还不能解释代谢降解物抑制的全部机制。尚无证据说明吲哚类小分子化合物和低浓度尿素对raf操纵子表达的明显作用。     

大肠杆菌棉子糖操纵子

大肠杆菌（Ｅscherichia coli）棉子糖（raf）操纵子位于质粒,它编码能够使大肠杆菌吸收和利用三糖棉子糖的蛋白,即一个主动运输系统（Ｒaf透性酶）,α－关乳糖苷酶和蔗糖水解酶。raf操纵子包括启动子rafP,调节基因rafR,操纵基因rafO以及rafA,rafB,rafD三个结构基因。这个操纵子一个阻遏蛋白RafR负控制,同时以环腺苷－代谢降解物基因激活蛋白（cAMP-CAP）为中介的正调控也参与调节。     

根霉α-半乳糖苷酶的三相分离及其酶学性质

根霉Rhizopus sp. A01发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了6.7倍,总酶活回收率达到46%;凝胶过滤和SDS-PAGE显示该酶为相对分子质量为87.6kDa的单体蛋白。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为5.0,最适温度为55℃,表观Km、kcat/Km分别为2.56mmol/L、47,400L/mol·s;能微弱水解蜜二糖和棉子糖,水解蜜二糖的速率是水解棉子糖速率的3.4倍;水解活性受多种     

大肠杆菌棉子糖操纵子

大肠杆菌(Escherichiacoli)棉子糖(raf)操纵子位于质粒,它编码能够使大肠杆菌吸收和利用三糖棉子糖的蛋白,即一个主动运输系统(Raf透性酶),α半乳糖苷酶和蔗糖水解酶。raf操纵子包括启动子rafP,调节基因rafR,操纵基因rafO以及rafA,rafB,rafD三个结构基因。这个操纵子由一个阻遏蛋白RafR负控制,同时以环腺苷代谢降解物基因激活蛋白(cAMPCAP)为中介的正调控也参与调节。     

第10届国际生物奥林匹克竞赛(1999)理论试题(三)

(续 2 0 0 0年第 35卷第 7期第 4 4页 )理论试题 B部分 :B部分的所有题目为多项选择题 ,但答案数目不一定 ,可能有一个、几个或全部为正确答案。答题时你必须准确地选出正确答案 ,并在正确选项前的横线上标 。细胞生物学、微生物学和生物工程学4 6　大肠杆菌的乳糖操纵子基因是典型的 (最优秀的 ) ;从此创造了操纵子概念 ,提出操纵子概念的研究者获得了诺贝尔奖金。大肠杆菌乳糖操纵子含有 3个基因 :z.编码 β-半乳糖苷酶 ,y.编码 β-半乳糖透过酶 ,a.编码转乙酰酶。变构乳糖是乳糖的异构体 ,这是通过 β-半乳糖苷酶产生的中间体 ,半乳糖…     

一种来源于青霉的新的α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

从丝状真菌中筛选到一株产α-半乳糖苷酶的菌株F63,对该菌株进行了形态观察和18SrDNA序列分析,该菌株属于青霉属。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析等方法分离纯化了该菌株的一种α-半乳糖苷酶。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此酶蛋白的分子量约为82kDa。该α-半乳糖苷酶反应的最适pH为5.0,最适温度为45℃。此α-半乳糖苷酶的热稳定性在40℃以下,pH稳定性为pH5.0-6.0。与已报道的α-半乳糖苷酶的活性都受到Ag 的强烈抑制不同的是,该α-半乳糖苷酶受Ag 的抑制作用不显著。以pNPG为底物的Km值为1.4mmol/L和Vmax=1.556mmol/L.min-1.mg-1。该酶可以有效降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖,但不能降解末端含α-半乳糖苷键的多糖。通过利用质谱技术对纯化的α-半乳糖苷酶进行鉴定以及内肽的N端测序证明该蛋白为一种新的α-半乳糖苷酶。     

碳源对K.fragilis LFS-8611β-D-半乳糖苷酶合成的影响

探讨了碳源对脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)LFS-8611生长、β-D-半乳糖苷酶合成的影响及碳源对该酶合成的诱导作用。脆壁克鲁维酵母(K,fragilis)LFS-8611生长与β-D-半乳糖苷酶合成同步。该菌株生长和产酶的最适碳源为半乳糖,乳糖次之。菌体生物量和酶活力随着培养基中乳糖浓度的增加而增加,乳糖浓度为12mg／mL,菌体生物量和酶活力达到峰值,分别为5．84g／L、19,12U／mL。半乳糖和乳糖对β-D-半乳糖苷酶合成具有诱导作用。诱导物浓度对β-D-半乳糖苷酶的诱导合成有较大影响。半乳糖诱导以山梨醇为碳源预培养的K．fragilis LFS-8611细胞合成β-D-半乳糖苷酶的最适浓度为10mg／mL。     

β-半乳糖苷酶的筛选、克隆表达、酶学性质及其酶法合成低聚半乳糖

采用人工底物邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o NPG)为筛选标记,从耐有机溶剂微生物菌库中,筛选出具有较高水解活性的β-半乳糖苷酶产生菌,再以乳糖为底物考察菌株低聚半乳糖的合成性能,筛选得到1株产β-半乳糖苷酶的Erwinia billingiae WX1。根据Gen Bank中相同属种的基因组序列推测β-半乳糖苷酶基因,克隆得到β-半乳糖苷酶基因gal,并在大肠杆菌中实现了来源于Erwinia billingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表达。该基因的开放阅读框(ORF)为1 428 bp,编码475个氨基酸,理论相对分子质量为5.2×104。镍柱法分离纯化得到电泳纯的β-半乳糖苷酶GAL,其酶学性质研究表明最适催化温度55℃,最适p H 7.0;Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶起较强促进作用,EDTA对该酶抑制作用较强。利用β-半乳糖苷酶GAL的转糖基作用,以乳糖为底物合成低聚半乳糖,初步优化的反应条件:底物乳糖质量浓度400 g/L,每克乳糖添加酶量1.0 U,在40℃反应16 h后,低聚半乳糖合成率达到34%(质量分数),显示了较好的开发前景。     

产α-半乳糖苷酶嗜热芽孢杆菌的选育

α-半乳糖苷酶催化棉子糖的水解,可以提高甜菜制糖中的蔗糖得率。我们从专性嗜热芽孢杆菌中筛选到α-半乳糖苷酶的菌株T59(尚未鉴定)。该菌株生长温度在45—60℃范围内,本实验培养温度为55℃。     

一种来源于Brachybacterium sp.DB5的α-半乳糖苷酶克隆及性质研究

α-半乳糖苷酶是一种有着巨大商业价值的工业酶制剂,在医药、食品和化工等行业有着广泛的应用。以来源于雪莲根部土壤的短状杆菌Brachybacterium sp.DB5为材料,从其基因组中扩增出一个α-半乳糖苷酶基因编码序列,经过测序及BLAST比对分析,证实该基因属于α-半乳糖苷酶。将其与p ET-30a(+)载体相连后在大肠杆菌中进行异源表达,经过诱导获得了此酶的胞外高效表达,粗酶液的活性为5.07 U/m L,经纯化后酶的活性达72.78 U/m L,酶学特性分析表明其最适p H为6.0,最适温度为40℃。此酶可用作动物饲料豆粕的添加剂,以提高饲料的利用率。     

大肠杆菌β—D—半乳糖苷酶的定位突变及突变酶的动力学性质

利用人工合成的寡核苷酸探针,将编码大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)的Lac Z基因中537位Glu密码子GAA分别用GAC(Asp)、CAA(Gln)、GTC(Val)来替代,替代后的突变酶的催化活性显著降低.同天然β-D-半乳糖苷酶相比,作用于ONPG底物时,突变酶的k_(cat)值分别为0.13%(Asp-537)、0.0006%(Gln-537)、0.0035%(Val-537),但它们的K_m值并无明显改变.无论是天然酶还是突变酶,底物类似物IPTG是一个强有力的抑制剂,而过渡态类似物2-脱氧-2-氨基-半乳糖和L-核糖只对突变酶有微弱的抑制作用.活化剂叠氮钠的激活作用小于β-D-半乳糖苷酶的Glu-461突变酶.催化甲醇成酯反应的能力小于天然酶.突变酶对热更不稳定.以上结果表明Glu-537残基是该酶催化反应的必需基团.     

短双歧杆菌α-D-半乳糖苷酶基因aga1在大肠杆菌中的高效表达

短双歧杆菌（Bifidobacterium breve 203）α_D_半乳糖苷酶基因(aga1)被克隆到大肠杆菌温度诱导表达质粒pBV220中,构建重组质粒pBVaga1,转入大肠杆菌进行温度诱导表达,得到的重组酶Aga1在大肠杆菌DH5α、DH10B和BL21中的比活分别为28.08、19.44和13.85U/mg, 均高于短双歧杆菌α_D_半乳糖苷酶的比活1.76U/mg。重组质粒pBVaga1在E. coli BL21中稳定性较好。重组酶Aga1蛋白亚基分子量约67kD,最适反应温度为45℃,酶在40℃以下稳定,60℃仅剩余约5%的酶活性,70℃时酶全部失活;最适反应pH为4.0～4.4,酶在pH 3.6～6.0范围内稳定;酶对p_硝基苯酚_α_半乳糖苷的Km＝1.43mmol/L,Vmax＝35.71μmol/(L·min),对蜜二糖的Km＝261mmol/L,Vmax＝63.69μmol/(L·min);酶在蜜二糖、棉子糖水解体系中不显示转糖基活性。结果说明Aga1与已经报道的一种短双歧杆菌的α_D_半乳糖苷酶不同,是新发现的一种短双歧杆菌的α_D_半乳糖苷酶。     

海枣曲霉产生的糖苷酶类

以木聚糖酶、β-D-岩藻糖苷酶活力较高的海枣曲霉作为试验菌株。该菌株的粗酶液含有多种糖苷酶,活力较高的有木聚糖酶、地衣多糖酶、β-木糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-D-岩藻糖苷酶及β-半乳糖苷酶等。其β-D-岩藻糖苷酶活力还高于β-半乳糖苷酶。将海枣曲霉培养不同时间后测活力,表明木聚糖酶在培养的第2天即大量产生,第3天达到高峰。Β-D-岩藻糖苷酶在第4天开     

黑颈鹤粪便分离菌Arthrobacter sp. GN14 的α-半乳糖苷酶基因克隆、表达与酶学特性

【目的】克隆高原唯一珍惜鹤类——黑颈鹤粪便分离菌Arthrobacter sp.GN14的α-半乳糖苷酶基因agaAGN14,并对该酶进行序列分析、系统发育分析和重组酶的酶学特性分析。【方法】利用简并PCR和GCTAIL-PCR方法获得agaAGN14全长,并对其氨基酸序列(AgaAGN14)进行比对和neighbor-joining系统发育树的构建。将agaAGN14重组到载体pET-28a(+)中并转化到Escherichia coli BL21(DE3)中异源表达。利用组氨酸标签纯化重组α-半乳糖苷酶rAgaAGN14并进行酶学性质分析。【结果】agaAGN14全长2109 bp,GC含量66.8%,编码702个氨基酸(77.5 kDa)。AgaAGN14与数据库中序列的最高一致性为53.7%,与其余胃肠道环境α-半乳糖苷酶的一致性<43%。系统发育分析将AgaAGN14聚于具有催化域KWD和SDXXDXXXR的α-半乳糖苷酶分支,与土壤微生物来源α-半乳糖苷酶距离相对较近,而与其余胃肠道环境α-半乳糖苷酶距离相对较远。rAgaAGN14可水解pNPG、棉籽糖、密二糖、水苏糖、菜粕和棉籽粕,表观最适pH为6.5,在pH 6.0-pH 9.0的范围内稳定并维持50%以上的酶活性。rAgaAGN14的表观最适温度为45℃,在10℃、20℃和37℃内稳定并分别具有约28%、30%和80%的酶活。在45℃pH 6.5条件下,rAgaAGN14对pNPG的Km、Vmax和kcat分别为0.41 mmol/L、18.28μmol/min/mg和25.36 s-1。rAgaAGN14受Ag+、Hg2+及SDS抑制,受K+、Ca2+、Mn2+、Fe3+、Ni2+、Cu2+和β-mercaptoethanol部分抑制,受Co2+、Pb2+、Zn2+、Mg2+、Na+和EDTA的影响较小。【结论】首次报道从黑颈鹤粪便中分离到Arthrobacter菌,并对该属细菌α-半乳糖苷酶进行序列分析、系统发育分析、异源表达和重组酶的酶学特性分析。rAgaAGN14序列较新颖,其酶学特性可能是同时适应黑颈鹤肠道环境和高原淡水湿地环境的结果。     

嗜热子囊菌JCM12803的α-半乳糖苷酶基因tcgal27A在毕赤酵母中的表达

从嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)JCM12803克隆α-半乳糖苷酶基因,并对其酶学性质进行系统的研究,旨为获得工业应用性质优良的α-半乳糖苷酶。通过RT-PCR方法从T.crustaceus JCM12803中克隆α-半乳糖苷酶基因序列,并对其酶学性质进行了系统的分析。结果显示,tcgal27A属于糖苷水解酶27家族,基因全长1 918 bp,含有4个内含子,c DNA全长1 419 bp,编码472个氨基酸,预测tcgal27A N端含有24个氨基酸为其可能的信号肽。将TCGal27A在毕赤酵母中成功地进行了表达,所获得的重组TCGal27A具有高比活(336.5 U/mg)及宽泛的底物特异性,对蜜二糖(14.4 U/mg)、棉子糖(9.1 U/mg)、角豆胶(3.6 U/mg)、魔芋粉(1.6 U/mg)、瓜尔豆胶(1.3 U/mg)、水苏糖(0.7 U/mg)都有着不同程度的降解作用。以pNPG为底物时的Km值为1.6mol/m L,Vmax为536.8μmo L/(min·mg)。TCGal27A的最适作用pH为4.5,最适温度为65℃,50℃处理1 h之后酶活力还能保持86.0%。这些结果表明耐高温TCGal27A性质优良,可添加到饲料中,在消化和提高豆粕蛋白能量利用率方面有良好的潜在应用价值。     

表达β-半乳糖苷酶的gal B16肿瘤模型的建立及其在肿瘤DNA疫苗研究中的应用

本文工作的目的是建立以β-半乳糖苷酶为标志性抗原的小鼠黑色素瘤模型,并进行肿瘤免疫的研究。我们首先在pcDNA3质粒中引入一个β-半乳糖苷酶编码基因从而建立转染质粒p3gal。p3gal转染小鼠黑色素瘤细胞B16后,再通过G418筛选及X-Gal细胞染色得到表达β-半乳糖苷酶的gal B16细胞株。接着用该细胞株成功地在C57小鼠上建立了表达β-半乳糖苷酶的gal B16肿瘤模型。并在此模型上观察了β-半乳糖苷酶编码基因作为DNA疫苗抑制gal B16肿瘤生长的作用。     

霉菌α-半乳糖苷酶分解棉子糖的初步研究——Ⅰ.菌株的分离筛选

甜菜含棉子糖较多。棉子糖占糖蜜总糖量的比数虽较小,但却导致蔗糖结晶难以析出而产生大量废糖蜜,造成废糖蜜含蔗糖量高达45—50%。所以,棉子糖是甜菜制糖工艺中重要有害物质之一。对此曾采用过化学处理方法,但因工艺复杂,成本较高,尚难消除其不良作用。棉子糖被蔗糖酶分解产生蜜二糖和果糖;被α-半乳糖苷酶分解产生半乳糖和蔗糖。若用     

耐热α-半乳糖苷酶的高效表达及酶学性质初探

[目的]实现耐热α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中的高效表达,并初步研究其酶学性质。[方法]克隆来源于埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的α-半乳糖苷酶基因TEgal,构建p AO815-TEgal重组表达载体,采用DNS法测定其水解活性及酶学性质;通过薄层层析研究其水解底物谱;并构建TEgal基因多拷贝表达框,实现了该基因的高效表达。[结果]TEgal对棉籽糖水解活性最高9. 5 U/m L,最适温度75℃,最适pH值3. 5; Na~+、K~+对TEgal有促进作用,Mg~(2+)、Co~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)均能抑制酶活,多拷贝重组表达菌株活性最高为22. 4 U/m L。[结论]成功构建耐热α-半乳糖苷酶高效表达菌株,通过提升基因剂量将酶活和蛋白含量提高了135%和356%。     

重组α-半乳糖苷酶的制备工艺研究

α-半乳糖苷酶是B→O血型改造研究中的关键工具酶。在获得了可分泌表达α-半乳糖苷酶的基因工程毕赤酵母菌株的基础上,进行了工程菌株在5L发酵罐中的发酵。发酵液上清中α-半乳糖苷酶活性为80～150U／mL,蛋白浓度为3～4.5mg／mL,比活性约为20-30U／mg。发酵液采用超滤、阳离子交换层析、疏水层析和阴离子交换层析等纯化方法,建立起了规模化生产重组α-半乳糖苷酶的工艺。制备的重组酶纯度经鉴定达98％以上,符合新生物制品的纯度要求。制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,从而解决了应用此酶开展B→O血型改造研究的关键问题。