人前列腺癌PC3细胞Bloom解旋酶基因干扰载体的构建

通过RNAi技术干扰人前列腺癌PC3细胞Bloom(BLM)解旋酶基因的表达。实验前期根据BLM解旋酶基因序列设计并合成两对sh RNA,插入到CMV-cop GFP-T2A-Puro-H1-mcs载体,构建针对BLM解旋酶基因的重组干扰载体CMV-cop GFP-T2A-Puro-H1-mcs-BLM1、CMV-cop GFPT2A-Puro-H1-mcs-BLM2。经测序载体构建成功后,用脂质体将所构建的载体及阴性对照载体转染前列腺癌PC3细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测转染细胞的BLM解旋酶表达情况。检测结果显示,成功构建了BLM解旋酶RNAi真核表达载体;利用脂质体转染PC3细胞后,荧光定量PCR和Western blot鉴定结果表明,BLM解旋酶的表达水平显著降低,即Bloom RNAi真核表达载体在m RNA和蛋白质水平阻断了BLM解旋酶的表达。     

RNA干扰沉默低氧诱导因子-1α对低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

本研究应用基因克隆技术,将合成的发卡样特异性低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1alpha,HIF-1α）干扰寡核苷酸（siRNA）序列插入真核表达载体中,构建出特异性HIF-1α基因RNA干扰（RNAi）真核表达载体。采用组织块种植法,原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs）,将构建出的特异性HIF-1αRNAi真核表达载体转染到PASMCs;分别在常氧和低氧下进行细胞培养,采用RT-PCR检测PASMCsHIF-1αmRNA表达水平,用MTT和流式细胞仪检测细胞增殖水平,探讨低氧条件下HIF-1αRNAi真核表达载体对PASMCs增殖的影响。结果表明,低氧培养48h后,正常PASMCs和转染了HIF-1αsiRNA阴性表达载体的细胞增殖显著,HIF-1αmRNA表达水平也显著升高;而转染了HIF-1αsiRNA阳性表达质粒的细胞增殖不显著,HIF-1αmRNA表达水平较低。结果提示：HIF-1αRNAi真核表达载体能显著干扰培养的PASMCsHIF-1αmRNA表达,同时抑制低氧环境下PASMCs的增殖。     

维甲酸受体β基因RNAi表达质粒的构建及其对A549细胞增殖和分化的影响

目的：利用RNA干扰（RNAi）技术,构建针对维甲酸受体（RAR）β基因的小干扰RNA（siRNA）表达质粒,诱导RARβ基因沉默,并观察其对肺癌细胞A549株的细胞周期和增殖的影响。方法：依据设计siRNA的原则。针对人RARβ的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆到pSUPER-NEO-GFP真核表达载体中构建重组体pSUPER-RAR[β转染至A549细胞中,以空质粒和RARβ高表达质粒转染为对照,用Western印迹检测RARβ基因的表达,并采用M1Tr试验检测转染后细胞株的增殖和细胞分化情况。结果：表达人类RARβ基因的siRNA重组表达质粒构建成功;MTT试验结果表明,转染的A549-RARβ-si细胞增殖能力降低。结论：采用RNAi技术特异阻断RARB基因表达,通过转染A549细胞,可使其细胞形态发生变化,并抑制其细胞生长。     

幽门螺杆菌VacA N端在巨噬细胞中表达对其细胞因子 分泌功能的影响

构建pDsRed-Monomer-C1/vacA N端真核表达载体,研究幽门螺杆菌空泡毒素单一毒力决定簇对THP-1巨噬细胞细胞因子分泌的影响.PCR扩增vacA目的基因片段,克隆人真核表达载体pDsRed-Monomer-C1中,经酶切、PCR及测序鉴定后,转染THP-1巨噬细胞中,Western blot和荧光显微镜鉴定VacA蛋白在细胞中的表达;电子显微镜和中性红摄人法观察巨噬细胞的空泡样变;ELISA法检测巨噬细胞培养上清TNF-α、IL-1β含量.重组质粒转染THP-1巨噬细胞24h,部分细胞胞浆中出现大小不等的空泡,且重组质粒组培养上清中TNF-α、IL-1β含量明显高于空质粒组和阴性对照组(P＜0.001),二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)下调细胞因子的分泌.结果显示,成功构建pDsRed-Monomer-C1-vacA真核表达载体;VacA蛋白瞬时高表达上调THP-1巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β;核因子kB(nuclear factor kappaB,NF-kB)可能参与调节VacA诱导的THP-1巨噬细胞的分泌.     

血管紧张素Ⅱ1型受体短发夹环RNA对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的:RNA干扰(RNAi)是一种新的高效特异地阻断基因表达的基因阻断技术.本研究旨在探讨血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)的短发夹环RNA质粒(pAT1R-shRNA)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响.方法:构建pAT1R-shRNA质粒,并转染入鼠VSMC中,应用RT-PCR及Western blot检测血管平滑肌细胞AT1R的mRNA和蛋白表达的变化,验证pAT1R-shRNA是否具有RNAi作用;应用台盼蓝染色法和MTT法检测VSMC增殖情况.结果:构建的质粒pAT1R-shRNA经测序鉴定验证与预期相符.转染组AT1R的mRNA和蛋白表达明显减少,与对照组相比有显著性差异(P＜0.01);转染质粒同时加AngⅡ刺激的VSMC增生明显受到抑制,与对照组相比有显著性差异(P＜0.01).结论:构建的pAT1R-shRNA质粒具有RNAi作用,并对AngⅡ所诱导的VSMC增殖有抑制作用.     

RNA干扰技术对PC12细胞CaMKⅡβ基因表达的影响

观察RNA干扰表达载体对PC12细胞中CaMKIIβ基因的抑制作用。构建针对CaMKIIβ基因的RNAi质粒表达载体,脂质体法转染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot 检测其对CaMKIIβ mRNA及蛋白质水平的影响。构建的质粒表达载体在PC12细胞中抑制了CaMKIIβ mRNA及蛋白质的表达。与阴性对照组相比,表达质粒产生的siRNA对CaMKIIβ mRNA的抑制率48h、72h分别为46.40％、64.69％,蛋白抑制率72h约为74.77％。RNAi表达载体可以有效地抑制PC12细胞CaMKIIβ基因的表达。     

心脏发育候选基因PYGO1 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

利用RNA干扰技术构建PYGO1基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒(pSUPER-PYGO1)。首先,针对PYGO1 cDNA序列设计并化学合成一对编码短发夹RNA序列,经退火插入到由BglⅡ和XhoⅠ酶切的pSU-PER质粒上构建重组RNAi质粒pSUPER-PYGO1。通过XbaⅠ酶切鉴定及测序分析验证构建效果,将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞系H9c2建立产生逆转录病毒的细胞克隆。通过RT-PCR和Western blot检测pSU-PER-PYGO1对H9c2细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白的干扰效果。pSUPER-PYGO1质粒经酶切鉴定及测序分析,发现59nt寡核苷酸成功插入到预计位点,且序列完全一致;RT-PCR和Western blot检测结果显示转染pSUPER-PYGO1的细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白量明显降低。因此,靶向PYGO1的pSUPER RNAi载体构建成功,为进一步从分子水平探讨PYGO1在心脏发育中的功能奠定了基础。     

核输入蛋白α/β真核表达载体的构建及细胞内定位

目的:构建带有myc标签的核输入蛋白(importin)α/β的真核表达载体,转染人胚肾293T细胞并分析其表达。方法:以乳腺癌文库为模板PCR扩增核输入蛋白α/β基因,扩增产物插入真核表达载体p XJ-40-myc,经双酶切和测序鉴定;将空载体与重组质粒分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹和免疫荧光技术检测核输入蛋白α/β的表达。结果:酶切鉴定与测序结果表明构建的myc-Importinα/β真核表达载体正确;Western印迹检测到重组质粒在293T细胞中的表达;免疫荧光检测到核输入蛋白α定位于细胞质和细胞核,而核输入蛋白β定位于细胞核。结论:构建了核输入蛋白α/β的真核表达载体,并确定了其在细胞中的表达定位。     

应用RNA干扰技术调节大鼠c-jun基因的表达

目的:应用RNA干扰(RNAi)技术调节大鼠c-jun基因在Cos-7细胞中的表达.方法:分别构建大鼠c-jun基因的RNA干扰载体和真核表达GFP(绿色荧光蛋白)载体,将两者共转染Cos-7细胞,镜下观察大鼠C-Jun-GFP融合蛋白的表达,应用Western blot方法检测抑制效率.结果:酶切和测序结果表明,大鼠c-jun基因的RNA干扰载体和真核表达GFP载体构建成功,镜下及Western blot共转染结果均显示随着RNA干扰载体浓度的增加C-Jun-GFP融合蛋白表达量逐渐减少.结论:在Cos-7细胞中应用RNAi技术成功调节大鼠c-jun基因的表达.     

人TBK1小干扰RNA质粒的构建及稳定干扰TBK1细胞株的筛选

目的:构建人TANK结合激酶1(TBK1)的小干扰RNA真核表达质粒,并筛选出稳定干扰TBK1的细胞株。方法:根据文献报道的序列和载体的黏性末端,设计合成2条针对TBK1的DNA序列,退火后连接到载体pSUPER.retro.neo+gfp上,经测序分析正确后得到质粒psiTBK1。用脂质体转染质粒psiTBK1到MCF-7细胞中,经G418加压筛选稳定表达TBK1小干扰RNA的细胞株,用免疫印迹检测细胞中TBK1的表达情况,将干扰效果好的细胞株命名为MCF-7/siTBK1,再用萤光素酶试验检测MCF-7/siTBK1细胞对外源TBK1诱导干扰素-β(IFN-β)转录的情况。结果:免疫印迹结果证实建立的稳定细胞株MCF-7/siTBK1能够有效干扰TBK1的表达,并在外源TBK1存在的情况下抑制IFN-β的转录活性。结论:构建了表达TBK1小干扰RNA的质粒psiTBK1,筛选出稳定干扰TBK1表达的细胞株MCF-7/siTBK1,为深入研究TBK1在先天免疫中的作用提供了平台。     

沙门菌CWDMs脂代谢检测

采用毛地黄皂苷敏感试验和菌细胞胆固醇、甘油三脂及胆碱酯酶定性与定量分析法,检测伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌经L 型变异后形成的细胞壁缺陷突变株(CW DM )的脂类代谢活性,了解这些CW DM 变异的性质和探讨细菌细胞壁缺陷突变与细菌演变的关系。结果表明,沙门菌CW DM s 具有显著的胆固醇和甘油三脂代谢活性、对毛地黄皂苷高度敏感并且还具有与白色念珠菌相似的胆固醇和甘油三脂的含量,但未能检出胆碱酯酶活性。CW DM s返祖菌丧失了脂类代谢酶类和胞浆膜不含胆固醇,恢复了与其亲代细菌型相似的代谢特征。提示在沙门菌天然即存在有与脂类及胆固醇代谢相关的基因,细胞壁的缺陷导致这些脂类及胆固醇代谢基因活化,以致 CW DM s 能够表达固醇和甘油三脂代谢活性和胞浆膜含有胆固醇     

沙门菌CWDMs乳酸脱氢酶同功酶的观察

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌的ＣＷＤＭｓ及其宁代细菌型和伤寒杆菌粗糙型的乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）同功酶,以了解沙门菌ＣＷＤＭｓ生物氧化的特点和机制,探讨ＣＷＤＭｓ变异的性质。结果表明,伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌的细菌型及伤寒杆粗糙型在聚丙烯酰胺凝胶电泳后显示出相同的４种具有不同泳动速率的ＬＤＨ同功酶,但ＣＷＤＭｓ仅显示２种ＬＤＨ。ＣＷＤＭｓ的２种ＬＤＨ同功酶与其亲代细菌型及伤寒杆     

沙门菌CWDMs氨基酸代谢的检测

采用氨基氨利用生长试验和谷丙转氨酶（ＧＰＴ）、谷草转酶（ＧＯＴ）、乳酸脱氨酶（ＬＤＨ）、肌酸激酶（ＣＫ）、α－闳丁酸脱氢酶（α－ＨＢＤ）、γ－谷志肽酶（γ－ＧＴ）,酸性磷酸酶（ＡＣＰ）定性与定量分析法,检测伤ＣＷＤＭｓ变异的特点及其机制,探讨ＣＷＤＭｓ变异的性质及其与细胞壁缺陷突变的关系。结果表明,沙门菌ＣＷＤＭｓ变异的性质及其与细胞壁缺陷突变的关系。结果表明,沙门菌ＣＷＤＭｓ在仅含蛋氨酸或脯氨     

光照对蕨类植物配子体假根向重力性的影响

对８种蕨类植物配子体假根向重力性反应的研究结果表明,除卷柏Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｔａｍａｒｉｓｃｉｎａ Ｓｐｒｉｎｇ配子体假根无向重力性反应并且其生长方向与光照方向无关外,其它７种的配子体假根均有向重力性反应,并且假根的向重力性反应在配子体发育初期,因光照的方向不同而异,表现为负向光性。随着配子体发育至片状体阶段,光对其向重力性反应的影响逐渐减弱,而重力的影响增强。在蕨类植物配子体发育初期,光对     

中国鳐类脑颅的研究

作者解剖观察了33种,隶于4目、7亚目、15科、19属的中国鳐类脑颅的形态。研究结果认为:锯鳐目和鳐目是原始类群,它们均具吻软骨,其中圆犂头鳐科和团扇鳐科是特化类群。电鳐目亦具吻软骨,它们是特化和退化类群。在较高等的鲼目则无吻软骨。依据鳐类不同的分类阶元,其脑颅亦各具有不同的式型。     

两种蚤的幼虫形态

关于蚤类幼虫形态的研究,进展比较缓慢,我国王敦清1956年首次描述7种蚤的幼虫形态以后,由柳支英,虞以新(1957),孙昌秀(1965),叶瑞玉(1982,1986),费荣中(1986)等学者先后共描述过约29种蚤的幼虫形态。到目前为止,我国已知蚤类幼虫形态约36种,隶属6科19属。本文描述未见报道的无棘鬃额蚤Frontopsylla aspiniformis Liu etWu(1960)和青海双蚤Amphipsylla qinghaiensis Ren et Ji(1979)两种蚤山幼虫形态。