枯草杆菌Ki-2-132株运载体质粒pKC1的构建和特性

pc194质粒在枯草杆菌(Bacillus subtilis)Ki-2-132株中的稳定性比在168株中的稳定性高。在EcoRI位点将质粒pUB110(Km~c)和pTP-4(Cm~r)重组,获得重组质粒pKC1(km~c Cm~c)。电镜照片表明pKC1 DNA是一环状分子。它可转化Ki-2-132获得同时抗Km和Cm的转化体,其稳定性介于二亲代质粒之间,但更接近于较稳定的pUB110。pKC1在Km~c基因内有单一的BglⅡ切点,在该位点上克隆Ki-2染色体无选择记号的BglⅡ、BamHI或BglⅡ-BamHI片段,获得插入失活的Km~s Cm~r转化体,其中一个(pK15)插入DNA片段的分子量约为1.5Md。pK15稳定性比pKC1低,但还可相当稳定地保持在Ki-2-132中。结果表明,Ki-2-132和pKG1是一个克隆外源DNA的系统。     

通过枯草杆菌原生质体融合转移pUB110质粒的研究

在脱氧核糖核酸酶(DNase)存在的情况下,用聚乙二醇(PEG)方法,将枯草杆菌BD366(pUB110)(Thr~- Try~- Az~- Km~r Sm~s)的原生质体与枯草杆菌Ki-2-132(Thr~- Val~- Ile~- Km~sSm~r)的原生质体进行融合,在再生培养基上再生细胞壁,获得同时抗Km和Sm的融合体。融合频率在10~(-4)—10~(-7)之间。经测定,融合体的遗传性稳定。从融合体中挑出菌落形态与Ki-2-132相同的融合体A18、B20和B7,其质粒DNA带有Km~r基因,而且其琼脂糖凝胶电泳图与pUB110质粒DNA相同。因而确认pUB110质粒通过原生质体融合而进行转移。     

枯草杆菌和大肠杆菌融合转移双复制功能杂种质粒pTZ22的研究

在大肠杆菌C600(pTZ22)(Km~rTc~rAp~r)和枯草杆菌Ki-2-132(Sm~rIle~-Thr~-Val~-)(简称A系统)以及在枯草杆菌Ki-2-132(pTZ22)(Km~r)和大肠杆菌C600(简称B系统)菌株之间,通过细胞融合,从两个方向转移pTZ22。A系统获得一批抗Km Sm融合子,B系统获得一批抗Km Ap和Tc的融合子,融合频率为10~(-4)—10~(-6)。融合子的抗性是稳定的,并且革兰氏染色、产酶和产孢匦与不带质粒的亲本相同。DNA的电泳图证明,除了不带质粒的亲本无质粒带外,其它菌株都有质粒带,A系的电泳相同,B系的则不同,原因尚不清楚。用融合子的质粒DNA转化ki-2-132和C600都获得了转化体,其转化频率因实验条件不同而有差异。以上结果表明,大肠杜菌和枯草杄菌细胞之间能够相互融合,通过融合能从A、B两个方向转移质粒pTZ22,枯草杆菌的蛋白酶不阻碍细胞融合和质粒转移。     

多粘芽孢杆菌质粒的研究——Ⅱ.多粘芽孢杆菌原生质体形成、再生与转化

多粘芽孢杆菌P250-2完整菌体不能作为质粒DNA的转化受体,但其质粒消除菌株P_0250-5制成的原生质体,可接受多粘芽孢杆菌的pBD2502及枯草杆菌的pUB110质粒DNA转化。在高渗蔗糖再生培养基上,原生质体再生率为20％左右,形成率在95％以上。在含新霉素(10μg/ml)、青霉素(25μg/ml)、四环素(12.5μg/ml)的高渗蔗糖再生培养基上分别获得了转化子。多粘芽孢杆菌的转化频率为3.29×10~(-3),枯草杆菌为4.4×10~(-4)。转化子的形态表现、生化特性和抗菌谱与给体菌株一致,表明多粘芽孢杆菌株间及多粘芽孢杆菌和枯草杆菌种间的质粒可以进行转化。     

芽孢杆菌异源转化和转导的比较研究

以枯草杆菌168和Ki-2-148作转化受体,8个种和1个变种的17株芽孢杆菌DNA作给体进行转化,证实大多数异源DNA能将给体的遗传标记传递给受体,但种间转化的频率与同源转化的频率相比,往往降低。借助转导噬菌体PBS1,在枯草杆菌Ki-2,浸麻芽孢杆菌AS1·64,短小芽孢杆菌AS1·386和枯草杆菌168之间能进行异源转导。抗链霉素标记的转化频率比色氨酸标记和尿嘧啶标记的转化频率高,表明芽孢杆菌的抗链霉素标记具有较大的同源性。插     

双功能质粒的构建与功能表达

将大肠杆菌抗四环素、氨基苄青霉素、氯霉素质粒pBR325和金黄色葡萄球菌/枯草杆菌抗新霉素、卡那霉素质粒pUB110,在体外经限制性内切酶EcoRI和T4 DNA连接酶作用,进行重组,获得了重组质粒pMM 1。pMM 1兼有抗四环素、氨基苄青霉素、卡那霉素和新霉素以及对氯霉素敏感的特性;用凝胶电泳法测定分子量,证明pMM1确为pBR325和pUB110两者的重组质粒。pMM 1在大肠杆菌中的转化频率为每微克DNA 0.79×10~3个转化子,在枯草杆菌受体中为每微克DNA 0.15×10~2个转化子。pMM1不仅能分别在大肠杆菌和枯草杆菌两种受体中复制,而且能同样表达,其抗药性水平为:对氨基苄青霉素不小于每毫升160微克,对四环素不小于每毫升120微克,对新霉素、卡那霉素不小于每毫升80微克。此外,用同样的方法构建了pBR 322和pUB 110的另一个重组质粒pMM 2,也获得了类似的结果。     

短小芽孢杆菌作为芽孢杆菌属基因工程受体菌的研究

以质粒pUB110 DNA转化B. pumilus 289原生质体,转化频率为10~(-3)—10~(-9)与B.tubtilis 168系统相当;但B.pumilus 289原生质体的再生频率(0.3—12.0％)略低于B.subtilis 168(1.53—24.16％);在无选择压力条件下质粒pUB110在B.pumilus 289中经过45个世代周期,自发丢失率小于3％,同于B.subtilis 168系统。外源基因在B.pumilus 289中经25个世代周期丢失率低于5％,而在B.subtilis 168系统中则高达24％;外源基因的表达水平亦高于B.subtilis 168系统。因此,B.pumilus 289是一个值得进一步开发的基因工程受体系统。     

枯草芽孢杆菌转化育种中几个有关问题的探讨

1．肌苷生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B5-3(产肌苷6—7克／升)的DNA转化给枯草芽孢杆菌Ki-2-148时,于受体菌对数生长后期,在转化培养基中处理60分钟,转化频率最高。 2．转化体Ki-2-148-4 积聚痕迹量的肌苷,经单菌分离,得到Ki-2-148-4-8菌株,摇瓶发酵试验积聚肌苛4.1克／升。 3．转化处理时,加入溶菌酶5微克／毫升,可以提商转化频率约6倍。 4．用电子显微镜观察到,枯草芽孢杆菌B,-3的DNA与处于感受态的受体细胞接触时,一部分工DNA比较集中在受体细胞的分裂面上、,并有垂直于分裂面的趋势。此现象未见报道过,其机理有待进一步研究。     

枯草杆菌的抗铬性

所有测试过的Bocillus subtilis菌株都对37.5μgCrO_3/ml敏感。以紫外线照射168trpC2~+菌株,很容易从中分离到抗100—150μgCrO_3/ml的突变体。多次企图通过转化或转导将此抗性转移到其他菌株,均未获成功。而以所有三种位点的半胱氨酸缺陷菌株为受体进行转化或转导,所得到的Cys~+转化体或转导体却都能抗50—75μgCrO_3/ml。在肉汤琼脂培养基中外加半胱氨酸,可以诱导抗铬拟表型,但在合成培养基上诱导抗铬拟表型,除半胱氨酸之外,还要补加其他一、二种氨基酸。这些结果加上其他实验结果表明,半胱氨酸诱导抗铬拟表型,不是由于半胱氨酸使CrO_3在细胞外脱毒之故。由于枯草杆菌很容易在合成培养基上生长,本实验结果说明枯草杆菌可以作为进一步研究抗铬机理的模型。     

应用转化方法从枯草杆菌168中选育高产α-淀粉酶产生菌

以枯草杆菌168(trp~-)为受体菌,枯草杆菌SH-16(Str~R)和枯草杆菌209(lin~R)为供体菌,通过DNA转化而获得抗链霉素,抗林可霉素和色氨酸缺陷回复原养型的各种枯草杆菌转化体。其中,有小部分转化体产生的α-淀粉酶比供体菌高达24%,大部分转化体产生的α-淀粉酶与供体菌差不多或较低,但均比受体菌高。结果表明用DNA转化方法来选育新菌种是有一定价值的。     

应用转化方法从枯草杆菌168中选育高产α-淀粉酶产生菌

以枯草杆菌168(trp~-)为受体菌,枯草杆菌SH-16(str~R)和枯草杆菌209(lin~R)为供体菌,通过DNA转化而获得抗链霉素,抗林可霉素和色氨酸缺陷回复原养型的各种枯草杆菌转化体。其中,有小部分转化体产生的α-淀粉酶比供体菌高达24%,大部分转化体产生的α-淀粉酶与供体菌差不多或较低,但均比受体菌高。结果表明用DNA转化方法来选育新菌种是有一定价值的。     

枯草芽孢杆菌中的分子克隆和单体杂种质粒转化的研究

枯草芽孢杆菌感受态细胞的质粒转化与质粒的分子构型有关。用琼脂糖凝胶电泳法分离纯化的pUB110质粒DNA单体是很少或没有转化活性的。在pUB110质粒DNA上插入一段受体菌染色体DNA,这种杂种质粒的单体可以转化感受态细胞,但受体菌必须是重组型的。转化效率和插入片段的大小有关,片段愈大转化活性愈高,片段小于0.6kb,就和pUB110DNA单体一样,几乎没有转化活性。在pUB110质粒DNA上插入一段解淀粉芽孢杆菌染色体DNA,这种杂种质粒的单体转化效率都很低。本文还讨论了用鸟枪法在枯草芽孢杆菌中进行分子克隆的一些问题。     

多效调控基因degU32(Hy),degQa和degR对枯草芽孢杆菌Ki-2-132生长和蛋白酶发酵的影响

通过向枯草芽孢杆菌Ki-2-132染色体和／或细胞质导入来自枯草杆菌168菌株的degU32（Hy）和degR基因,以及来自芽孢杆菌解淀粉菌株（Bacillus amyloliquefaciens）的degQa基因,对上述基因对枯草芽孢杆菌Ki-2-132细胞的生长、孢子发生、蛋白酶发酵的影响进行了研究。尽管上述多效调控基因来自不同的芽孢杆菌种和菌株,它们在枯草芽孢杆菌Ki-2-132中依然表现多效性。枯草杆菌Ki-2-132degU32（Hy）表现出增高了的蛋白酶产量;当和质粒或染色体上的degQa基因协作,可以进一步依赖葡萄糖的水平和degQa的基因剂量影响细胞生长,增加蛋白酶产量,以及影响孢子的形成。与此不同,degR在degU32（Hy）突变体中并不显著影响其蛋白酶的产量,这一发现支持DegR蛋白通常稳定磷酸化的DegU,而其在degU32（Hy）菌株中不再进一步放大该突变体内已被磷酸化的DegU的调控作用。     

枯草杆菌中通过细胞融合的质粒转移

在PEG存在下,枯草杆菌BD366(pUB110)菌株和G1菌株的原生质体以10~(-6)—10~(-4)的融合率发生融合。在染色体的抗药性标记、营养要求和一般细菌学特征鉴定方面,多数融合子相似于亲本G1,所不同的是质粒上的抗药性标记相同于另一亲本菌株BD366,并且在高渗培养基上具有独特的菌落形态。融合子的以上一些特征极为稳定。高温能使质粒pUB110消除,质粒消除后融合子的菌落形态转变成为亲本G1的形态特征。我们认为双亲细胞融合后没有发生遗传重组,而是在分裂过程中发生分离,于是质粒pUB110可能出现在G1细胞中,因此本文为通过细胞融合的质粒转移和由于某一特定质粒的存在而改变菌落形态提供了初步证据。     

枯草杆菌质粒pUB110与大肠杆菌质粒pBR322构建的杂种质粒及其基因表型表达

用EeoRI酶消化pUB 110和pBR 322 DNA,然后以T4 DNA连接酶进行连接,转化大肠杆菌,从转化体中获得pTZ3、pTZ22和pTZ24三个杂种质粒。研究了pTZ22 DNA的分子特性,从BamHI和PstI酶切片段测出其分子量为5.6×10~6道尔顿,并确定其捻接方向。观察了三个杂种质粒的稳定性,研究了其基因表型表达。同源基因均可表达,Ap~r、TC~r基因在枯草杆菌细胞中不能进行异源表型表达,Km~r基因在大肠杆菌细胞中异源表型表达不充分。     

枯草杆菌(Bacillus subtilis)转化的研究I．受体菌株的筛选

混合两个枯草杆菌抗链霉素突变体的核酸,对149株枯草杆菌进行转化试验,筛选到Ki-2为一可转化的受体菌株。用紫外线诱变,从Ki-2获得的9个营养缺陷型其中包括尿嘧啶、异亮氨酸、褓氨酸、苏氨酸、撷氨酸加异亮氢酸、苏氧酸加蛋氦酸、辙氨酸加亮氨酸加异亮氨酸、苏氨酸加异亮氨酸加檄氨酸、苏氨酸加亮氧酰加异亮氨酸加颛氯酸的缺陷型各一个,都可进行转化。以单独核酸分刖进行转化试验表明,四个抗链霉素突变体中,有一个不能作耠体。观察了有转化活性的DNA与无转化活性的DNA按不同比例混合后对转化作用的影响。讨论了用混合不同耠体核酸从大量菌株中簖选受体菌株的方法。     

枯草杆菌表达载体pUB23的构建及地衣杆菌α-淀粉酶基因的表达

将克隆的解淀粉芽胞杆菌强启动子经DNA序列分析后连接到能在枯草杆菌中复制的质粒pUB18上,构建枯草杆菌表达载体pUB23。为了测试构建的表达载体能否表达外源基因,将地衣杆菌抉失了启动子的α-淀粉酶基因接到pUB23上启动子的下游,组建重组质粒,转化枯草杆菌QB1130(amy~-),获得能分泌α-淀粉酶的转化株,证明缺失了启动子的结构基因在pUB23上克隆启动子的启动下获得表达。酶活力测定结果表明,表达水平是用原启动子时的2.5倍.     

芽孢杆菌原生质体作为质粒DNA转化的受体

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) B3F 7658,短小芽孢杆菌(B. pumilus) AS 1.940,巨大芽孢杆菌(B．Megaterium) AS 1.941,和多粘芽孢杆菌(B. polymyxa) AS 1.878等菌株,既不能作为染色体DNA的转化受体,也不能作为质粒DNA的转化受体。用不同量的溶菌酶处理这些菌株形成原生质体,然后加pUB110质粒DNA,经聚乙二醇6000(PEG)诱导,在含新霉素(400μg／ml)的DM-3再生培养基上恢复细胞壁,培养48小时后,转化子数为1.0 x 103一4.6×105／μg DNA。若同时用PEG和Ca2+ 离子诱导,转化子数可提高2—3倍。质粒pUBll0用EcoRI酶切后,转化子数大大下降(2.0×102转化子／μg DNA)。Eco RI酶切后,用T4连接酶连成环状,转化子数有所增加(1．7×103转化子／μg DNA)。     

黄地老虎颗粒体病毒DNA片段在枯草芽孢杆菌中的克隆

EcoRI酶解的AsGV-XJ DNA和质粒pUB 110 DNA,经T4 DNA连接酶连接后,转化枯草芽孢杆菌BR 151感受态细胞,涂布在加有新霉素(5,ug／ml)的完全培养基上。用琼脂糖凝胶电泳快速法检测抗新霉素转化子中的重组质粒。在388个转化子中得到12个较PuB110 DNA分子量大的重组质粒。所有重组质粒均可与”PdcTP标记的Fco RI酶解AsGV—XJDNA片段的探针进行分子杂交。通过琼脂糖凝胶电泳对重组质粒中插入AsGV一XJ DNA 片段进行了测定。     

枯草芽孢杆菌分子克隆系统受体的改造

实验证明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BR151和MI112中的pUB110质粒,在液体中传代要比固体斜面传代稳定。通过NTG诱变获得了对pUB110稳定的受体BSG.来自大肠杆菌的穿梭质粒在BSG菌中转化频率较亲本高。小的外源DNA片段插入pBE2后在BSG菌中转管传代30次是稳定的。