肌苷产生菌枯草芽孢杆菌Bs菌株的选育和发酵条件

1．用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)腺嘌呤营养缺陷型(ade-)No 18经1次亚硝基胍(MNNG)。诱变处理及2次单菌落分离,获得了能利用酶法制造葡萄糖3次结晶母液,发酵生产肌苷的变异菌株B,。在适宜条件下,摇瓶肌苷产量在7.0克／升以上。 2．不同来源的酵母粉及其在培养基中的含量,对肌苷产量均有显著影响。在所试验的酵母粉中,以北京光华木材厂生产的圆酵母最好,在种子和发酵培养基中的逢合用量分别为1.0一1.4％和1.2一1.4％。 3．在发酵过程中,次黄嘌呤的积聚和肌苷积聚有着明显的消长关系。4．枯草芽孢杆菌B4菌株具有很强的分段合成肌苷的能力,当添加0．3％次黄嘌呤时,可获得高于对照93．3％的肌苷产量,但转化率以添加0．1％次黄嘌呤时为最高。     

枯草芽孢杆菌突变体在合成培养基中的生长和肌苷合成的研究

用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产肌苷突变体24—36,在合成培养基巾探讨了核陵碱基等成份对肌苷积聚的影响,结果表明： 1．在所试验的7种碱基中,腺嘌呤对肌苷积聚影响最大,它的最适含量为200毫克／升,超过400毫克／升时肌苷积聚显著降低,但生长量达到最大值。 2．在腺嘌呤含丘为200毫克／升的培养基中加入适量尿嘧啶能促进菌帮本生长和肌侍积聚。 3．在腺嘌呤过量存在时,加入0．3％次黄嘌呤,肌苷积聚量可达最适腺螵呤时的合成量。 4．硫胺素营养缺陷型与其自发回复突变株积聚肌苷的能力无明显区别。 5．葡萄糖,(NH4)2SO45尿 素。L-谷氨酸对该菌生长和肌苷积聚均有一定影响,但以L-谷氨酸庄培养基中的含量影响最大。     

芽孢杆菌原生质体作为质粒DNA转化的受体

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) B3F 7658,短小芽孢杆菌(B. pumilus) AS 1.940,巨大芽孢杆菌(B．Megaterium) AS 1.941,和多粘芽孢杆菌(B. polymyxa) AS 1.878等菌株,既不能作为染色体DNA的转化受体,也不能作为质粒DNA的转化受体。用不同量的溶菌酶处理这些菌株形成原生质体,然后加pUB110质粒DNA,经聚乙二醇6000(PEG)诱导,在含新霉素(400μg／ml)的DM-3再生培养基上恢复细胞壁,培养48小时后,转化子数为1.0 x 103一4.6×105／μg DNA。若同时用PEG和Ca2+ 离子诱导,转化子数可提高2—3倍。质粒pUBll0用EcoRI酶切后,转化子数大大下降(2.0×102转化子／μg DNA)。Eco RI酶切后,用T4连接酶连成环状,转化子数有所增加(1．7×103转化子／μg DNA)。     

利用淀粉直接发酵生产肌苷菌株的构建

以肌苷生产菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TF_2为受体菌,利用质粒DNA的原生质体转化法,将携带糖化型α-淀粉酶基因的重组质粒pBX96导入肌苷产生菌TF_2中,转化频率为5.7×10^(-6),获得一株能以淀粉为碳源生产肌苷的转化子T140(pBX96),该工程菌株能在以淀粉为碳源的培养基上平均积累肌苷4.64g/L,经过92代,质粒自发丢失率为0.78％。培养48h后,工程菌株的糖化型α—淀粉酶活力为受体菌的7.79倍。并对工程菌株TI40(pBX96)的发酵条件做了初步摸索。     

芽孢杆菌异源转化和转导的比较研究

以枯草杆菌168和Ki-2-148作转化受体,8个种和1个变种的17株芽孢杆菌DNA作给体进行转化,证实大多数异源DNA能将给体的遗传标记传递给受体,但种间转化的频率与同源转化的频率相比,往往降低。借助转导噬菌体PBS1,在枯草杆菌Ki-2,浸麻芽孢杆菌AS1·64,短小芽孢杆菌AS1·386和枯草杆菌168之间能进行异源转导。抗链霉素标记的转化频率比色氨酸标记和尿嘧啶标记的转化频率高,表明芽孢杆菌的抗链霉素标记具有较大的同源性。插     

pUB 110质粒转化枯草杆菌Ki-2株及其突变体的研究

迄今文献中报道枯草杆菌基因克隆化都采用枯草杆菌168株及其突变体。本文采用我国分离的枯草杆菌Ki-2株及其突变体Ki-2-1 32(Thr~-Ile~-Val~-)和Ki-2-148(ura~-)为pUB110质粒DNA的受体菌株。用酸酚法提纯pUB110质粒DNA,在琼脂糖凝胶电泳上看不到样品中有染色体DNA的带。结果表明,Ki-2、Ki-2-132和Ki-2-148都可作pUB 110质粒的受体菌,其转化频率在10~(—3)—10~(—8)之间,因菌株和条件不同,频率有所差异。Ki-2-132的转化效率为每微克DNA可产生10~4转化体。pUB 110质粒DNA浓度在0.01—1.00μg/ml之间时,转化体数目随DNA浓度增加而增加,其中,在浓度为0.01—0.1μg/ml之间成直线关系,测定的DNA依赖指数为1.04,系一级反应。从pUB110质粒DNA转化168、Ki-2、Ki-2-132、Ki-2-148的转化体中提取的质粒DNA仍具有pUB110质粒DNA的抗卡那霉素的转化活性。从转化体提纯的质粒DNA的电泳图以及EcoRI消化后的电泳图与原来的pUB110 DNA的电泳图相同。     

肌苷产生菌B.Subtilis H841在2升罐中的发酵

枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)H841肌苷产生菌是腺嘌呤、组氨酸、硫胺素三重缺陷型菌株,并对8—氮杂乌嘌呤、6—巯基嘌呤有抗性。在摇瓶中产肌胺18.1克/升,在2L自控发酵罐中最高可产肌苷19.6克/升,在流加葡萄糖情况下可产肌苷26.2克/升。控制pH较不控制pH发酵肌苷产量有较大的增加,控制pH发酵并补加营养时,肌苷产量可稳定地增长,但对葡萄糖的转化率是相同的。     

枯草芽孢杆菌分子克隆系统受体的改造

实验证明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BR151和MI112中的pUB110质粒,在液体中传代要比固体斜面传代稳定。通过NTG诱变获得了对pUB110稳定的受体BSG.来自大肠杆菌的穿梭质粒在BSG菌中转化频率较亲本高。小的外源DNA片段插入pBE2后在BSG菌中转管传代30次是稳定的。     

绿色荧光蛋白基因标记野生型生防枯草芽孢杆菌的研究

根据绿色荧光蛋白基因和枯草芽孢杆菌木糖诱导型启动子PxylR 序列,分别设计两对特异引物primers PxyF/R和primers gfpF/R,扩增获得了完整的启动子PxylR和-gfp基因序列。进一步以上述产物混合物为模板,以primer PxyF/primer gfpR做引物进行重迭PCR,获得了PxylR-gfp重组翻译融合表达盒。经SphⅠ和KpnⅠ完全酶切后,将PxylR-gfp表达盒分别插入大肠杆菌_苏云金芽孢杆菌穿梭载体pHT315和大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭载体pRP22。相应的重组表达质粒pGFP315和 pGFP22转化枯草芽孢杆菌感受态细胞。前者在标准菌株168中得到良好发光表型,后者则在标准菌株168和野生目标菌株B916中均得到良好的发光表型。室内平板抑菌实验结果显示B916生防效果与出发菌株没有明显差异,遗传稳定性研究表明连续稀释培养约175代后,工程菌株稳定性为94%,质粒丢失频率低于3.5×10^-4/代。     

多效调控基因degU32(Hy),degQa和degR对枯草芽孢杆菌Ki-2-132生长和蛋白酶发酵的影响

通过向枯草芽孢杆菌Ki-2-132染色体和／或细胞质导入来自枯草杆菌168菌株的degU32（Hy）和degR基因,以及来自芽孢杆菌解淀粉菌株（Bacillus amyloliquefaciens）的degQa基因,对上述基因对枯草芽孢杆菌Ki-2-132细胞的生长、孢子发生、蛋白酶发酵的影响进行了研究。尽管上述多效调控基因来自不同的芽孢杆菌种和菌株,它们在枯草芽孢杆菌Ki-2-132中依然表现多效性。枯草杆菌Ki-2-132degU32（Hy）表现出增高了的蛋白酶产量;当和质粒或染色体上的degQa基因协作,可以进一步依赖葡萄糖的水平和degQa的基因剂量影响细胞生长,增加蛋白酶产量,以及影响孢子的形成。与此不同,degR在degU32（Hy）突变体中并不显著影响其蛋白酶的产量,这一发现支持DegR蛋白通常稳定磷酸化的DegU,而其在degU32（Hy）菌株中不再进一步放大该突变体内已被磷酸化的DegU的调控作用。     

蛋白酶产生菌种间原生质体融合的研究

Baci llus属中的一些种是生产蛋白酶的重要菌株。 采用2500u／ml溶菌酶制备的两种芽孢杆菌原生质体在30％聚乙二醇(Mw6000)的作用下,成功地获得了枯草芽孢杆菌(Bacillusfubtilis)和地衣状芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的种间融合重组子。融合频率为7．47 x10—2．28×10-5经过四代的移接验证,融合子的稳定率达到12—20％。结果表明,两种产蛋白酶的芽孢杆菌融台后,营养缺陷和抗药特性方面可以互补;菌落形态发生某些变化;生产性能有较大的改进。     

昆虫病原菌苏云金芽孢杆菌群(Bacillus thuringiensis Group)的分类

采用形态、生化、血清学的方法对国外引种的15株巳知菌和本国51株未知菌进行了变种的分型研究。结果表明：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)作为有益的细菌资源在藏国分布较广。51株菌中属于血清型H1苏云金芽孢杆菌苏云金变种(Baeillus thuringiensisvar. Thuringiensis)有11株,血清型H50-5b苏云金芽孢杆菌蜡螟变种(B．Thur．Var．Galleriae)31株,血清型H4-4b苏云金芽孢杆菌松蜩变种(B.thur. Var. dengrolimut)3株,血清型H4-4a。苏云金芽孢杆菌肯尼亚变种(B. thur. Var kenyae) 5株,同时发现血清型H．苏云金芽孢杆菌玉米螟变种(B. thur var. ostrinia,)一株。玉米螟变种不同于该菌群的巳知菌株,认为是一个新变种。实践证明,利用血清学抗原抗体具有高度特异{生的凝集反应来鉴别苏云垒芽孢杆菌变种,简便,快速,准确。而该群噬菌体却不能作为区分变种的标准。     

枯草芽孢杆菌中的分子克隆和单体杂种质粒转化的研究

枯草芽孢杆菌感受态细胞的质粒转化与质粒的分子构型有关。用琼脂糖凝胶电泳法分离纯化的pUB110质粒DNA单体是很少或没有转化活性的。在pUB110质粒DNA上插入一段受体菌染色体DNA,这种杂种质粒的单体可以转化感受态细胞,但受体菌必须是重组型的。转化效率和插入片段的大小有关,片段愈大转化活性愈高,片段小于0.6kb,就和pUB110DNA单体一样,几乎没有转化活性。在pUB110质粒DNA上插入一段解淀粉芽孢杆菌染色体DNA,这种杂种质粒的单体转化效率都很低。本文还讨论了用鸟枪法在枯草芽孢杆菌中进行分子克隆的一些问题。     

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究

为便于枯草芽孢杆菌工业化生产应用,对Spizizen创立的枯草芽孢杆菌DNA转化方法进行改进.用GMI和GMII溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a、营养缺陷型突变株DBl342和非营养缺陷型突变株WB800,用改进的方法制备感受态细胞,用7.5kb质粒pSBPTQ进行转化,并研究RNA、酵母粉、水解酪蛋白、培养方法对枯草芽孢杆菌质粒转化的影响.结果表明,该方法适用于不同基因型枯草芽孢杆菌的质粒转化,营养缺陷型突变株DBl342的转化率为750 CFU/μg/DNA,非营养缺陷型突变株WB800转化率为1 070 CFU/xg DNA,野生型菌株BS501a转化率为270 CFU/μg/DNA.根据影响转化效率的因素,推测在该方法中,枯草芽孢杆菌质粒转化原理:一定生物量的枯草芽孢杆菌在外界营养条件和钙、镁离子作用下,细胞壁和细胞膜形成缺陷,使外源DNA转入枯草芽孢杆菌细胞内.     

添加次黄嘌呤或腺嘌呤提高肌苷产量

肌苷生产菌No.226具有将次黄嘌呤转变为肌苷的能力,添加次黄嘌呤有利于肌苷的积累。腺嘌呤缺陷型的肌苷生产菌株,在培养液中腺嘌呤的浓度对肌苷积累有显著影响。我们采用中国科学院上海生物化学研究所等单位选育的枯草芽孢杆菌7171-9-1菌株,进行舔加次黄嘌呤或腺嘌呤与酵母粉试验,现报道如下。     

酶切枯草芽孢杆菌染色体DNA的转化

对枯草芽孢杆菌的转化已经进行了相当深入的研究。人们对菌株168进行诱变处理,得到了许多衍生菌。我们收集了一些衍生菌,用它们作为受体菌株,来比较它们之间的转化活     

多粘芽孢杆菌质粒的研究——Ⅱ.多粘芽孢杆菌原生质体形成、再生与转化

多粘芽孢杆菌P250-2完整菌体不能作为质粒DNA的转化受体,但其质粒消除菌株P_0250-5制成的原生质体,可接受多粘芽孢杆菌的pBD2502及枯草杆菌的pUB110质粒DNA转化。在高渗蔗糖再生培养基上,原生质体再生率为20％左右,形成率在95％以上。在含新霉素(10μg/ml)、青霉素(25μg/ml)、四环素(12.5μg/ml)的高渗蔗糖再生培养基上分别获得了转化子。多粘芽孢杆菌的转化频率为3.29×10~(-3),枯草杆菌为4.4×10~(-4)。转化子的形态表现、生化特性和抗菌谱与给体菌株一致,表明多粘芽孢杆菌株间及多粘芽孢杆菌和枯草杆菌种间的质粒可以进行转化。     

肌苷产生菌缺失核苷水解酶活性突变株选育及其发酵生产试验

以枯草芽孢杆菌ＪＳＩＭ－１０１９为出发菌株,经物理、化学诱变剂连续处理,获得一株缺失核苷水解酶活性的突变株ＪＳＩＭ－Ｂ－１９８。该突变株不能降解肌苷,应用于发酵生产中,肌苷产量显著增加。在２００００升发酵罐中,连续１０罐批,平均产肌苷８．３８ｇ／Ｌ,对糖转化率２１．９８％,发酵周期５０ｈ￣６０ｈ,该菌株遗传性能稳定,已在工业生产中应用。     

杀虫防病基因工程枯草芽孢杆菌的构建

分别以枯草芽孢杆菌大肠杆菌穿梭质粒pHB201和pRP22为载体,通过感受态转化方法,将Bt-HD-1杀虫蛋白基因cry1Ac导入了水稻纹枯病生防菌株枯草芽孢杆菌B916。工程菌株质粒酶切电泳分析、Southern印迹分析和杀虫生物活性测定结果证实了cry1Ac基因的导入及其在B916中的有效表达。抑菌测定证明工程菌株保持了原野生型菌株良好的抑菌活性。质粒稳定性分析表明以载体pRP22构建的工程菌株Bs2249具有良好的稳定性,而以载体pBH201构建的工程菌株Bs2014则不稳定。此外,实验还证实Bt基因的导入与表达对B916的生长没有不良影响。     

苏云金芽孢杆菌以色列亚种130kDa杀蚊蛋白基因在枯草芽孢杆菌中的表达

本文将苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis)130kDa杀蚊蛋白基因亚克隆到pNQ1 22载体上,通过枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)原生质体转化,得到Kmt Cm2的正反向克隆子(pFZl和pFZ2)。 Western—blotting免疫杂交证明130kDa杀蚊蛋白基因在枯草芽孢杆菌中表达了具有免疫活性的130kDa杀蚊蛋白。 所表达的杀蚊蛋白在实验中具有杀蚊活性。