人表皮生长因子基因的化学合成和克隆及其在酵母中的表达

用固相亚磷酰胺法合成了人表皮生长因子基因,全长为173个核苷酸,它被分成8个寡核苷酸,分别在DNA合成仪上合成。经分离纯化后的寡聚核苷酸进行酶促连接,然后被克隆到噬菌体M13mpl8中,克隆经分子杂交、限制酶酶切以及DNA序列分析检测,证明合成的人表皮生长因子基因和设计的完全一致。将人表皮生长因子基因的DNA片段插入酵母分泌型表达载休YFD59 HindⅢ位点中,建成表达人表皮生长因子基因的质粒YFDl04,再将此质粒转化酿酒酵母,所得转化子经摇瓶发酵,发酵上清液用受体结合试验表明有人表皮生长因子表达。     

影响固相酶制备和性质的因素

虽然早在1916年,Nelson等人已将蔗糖酶吸附在活性炭和氢氧化铝胶上,制备了第一个固相酶。但到五十年代,固相酶的研究才为人们所注意,到六十年代才迅速发展起来。近年来,发展了固定化微生物、固相化辅酶及其再生的方法。所研究的固相酶从较简单的水解     

防止336菌株老化断裂小试总结

336菌株是产葡萄糖异构酶的优良菌种。但在液体培养过程中,常常出现菌体断裂现象,造成胞内酶的大量流失和使包埋菌体法制的固相酶活力迅速跌落。为提高异构酶的收率及适应固相酶科研工作的需要,从1978年10月开始了进行防止菌体断裂的研究。经过八个月的小型试验,我们进行了二十批,四百五十余瓶的摇瓶发酵试验。达到了总酶活稳定在100单位/毫升以上及培养三天菌体不断裂的原定计划指标。     

人溶菌酶基因的合成和克隆

用固相亚磷酰胺法合成了人溶菌酶的全基因,全长为409bp,它包括了编码人溶菌酶的结梅基因,起始密码于ATG,终止密码子TAA、TGA,以及两端的BamHI和SphI的识别顺序。整个基因分成24个寡聚核苷酸片段进行合成,每个片段长度分别为26至38个核苷酸．然后用两种方法酶促连接成完整的人溶菌酶基因。基因克隆到M13载体上。用点杂交和限制酶酶切分析确定阳性克隆株。用双脱氧链终止法进行序列分析,证实所合成的人溶菌酶基因序列与设计的完全一致。     

福尔马林固定微丝蚴免疫酶染色试验检测丝虫抗体的初步观察

以马来丝虫微丝蚴为固相抗原,做免疫酶染色试验(IEST)检测丝虫病人血清抗体,具有较好的效果。但是,微丝蚴固相抗原在常温下极易腐败变质,影响了其在基层的推广应用。我们用福尔马林处理抗原后,在常温下保存60天,IEST的效果仍较满意。     

以角叉胶固相化假单胞菌连续生产L-丙氨酸

本研究用固相化假单胞菌从L天冬氨酸连续生产L-丙氨酸。假单胞菌细胞用角叉胶凝胶固相化。固相化细胞的L-天冬氨酸β-脱羧酶的活性通过将固相化细胞置于含有0.1mM吡哆醛-5-磷酸盐(PLP)的1ML-天冬铵盐(pH5.5)溶液里在37℃下恒温培养20多小时以得到提高。固相细胞的酶活性是原细胞活性的59%。酶反应的pH范围固相细胞比游离细胞宽。当使用含有0.1mMPLP底物溶液反复使用固相化细胞仍可保持酶活。当含有0.1mMPLP2ML-天冬氨酸铵(pH6.2)溶液向上通过固相化细胞柱在37℃下保持8小时后L天冬氨酸完全转变为L-丙氨酸。用戊二醛处理固相化细胞结果酶活稍有损失可是显著地增加操作的稳定性。通过戊二醛处理的固相化细胞酶活半衰期是46天。     

用染料修饰吐温80液—固萃取体系从猪心肌匀浆液中分离纯化心肌黄酶

用三嗪类染料 Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３Ｇ－Ａ修饰的吐温８０,与吐温８０、硫酸被构成液－固萃取体系,从猪心肌匀浆液中分离纯化心肌黄酶。研究了吐温８０染料修饰物在吐温８０相中所占的比例、分相盐浓度、溶液的酸度、匀浆液的加入量等对匀浆液中酶及杂蛋白在两相中分配的影响。在室温条件下,酶选择性地进入吐温８０固相,杂蛋白主要留在盐水相。匀浆液中心肌黄酶的酶活力平均收得率为８１．４％,一步纯化倍数为６．６。降低盐浓度,提高盐水相酸度,能使酶从吐温８０固相反萃到盐水相。     

酶联免疫吸附测定中固相化方法概述

酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一项应用广泛的固相酶免疫测定技术。抗原或抗体等反应物的固相化在ELISA检测系统中有着十分重要的作用,可直接影响检测结果。应用稳定性好、固相化物质变性率低及固定效率高的ELISA操作体系,可显著提高检测分析的灵敏性、特异性和可靠性。现就ELISA技术中不同固相介质和固相化方法作一概述。     

固相酶制备与应用的一些研究

在天然情况下,有的酶分泌在细胞外;有的则存在于细胞内。细胞内的酶,有的以溶于水的形式存在于细胞浆内;也有一些酶存在于细胞的细微结构上,在正常情况下不溶于水。不溶于水的酶经过一定处理,也能成为水可溶的酶;水可溶酶经过处理也可变为水不可溶的酶。经过这种处理的酶称为固相酶。近年来,固相酶的研究有了迅速的发展。     

用硝酸纤维膜作抗原或抗体的载体筛选交瘤培养物

<正>杂交瘤技术中的关键是鉴定产生的单克隆抗体的特异性,最方便的方法可能是用抗原吸附稳定的载体(例如塑料微量培养板)的各种固相酶免疫试验(EIA),并用酶结     

Hin P_1I底物片段d-ATGCGCAT的固相磷酸三酯法合成

本文报道用固相磷酸三酯法化学合成了限制性内切酶HinP_1Ⅰ的底物片段d-ATGCGCAT。固相载体采用β-丙氨酰基聚苯乙烯树脂(2%交联度)。合成的产物经顺序分析得到证明,同时能被限制性内切酶HinP_1Ⅰ识别并在专一位置上水解。     

人α-心钠素全基因的化学合成

用固相亚磷酰胺法(solid-phase phosphoramidite method)合成了人α-心钠素(简称α-hANP)的全基因。合成的α-hANP基因全长为96bp,包括编码α-hANP的结构基因、基因5＇端的谷氨酸(作为表达产物用内肽酶Glu-C专一裂解的位点)密码子GAA、基因3＇端的终止信号TGA及基因两端的接头部分。基因分7个寡聚核苷酸片段在DNA合成仪上合成,然后一次性酶促连接成为完整的α—hANP双链基因。化学合成的基因克隆到M13载体上,经分子杂交鉴定筛选出的α-hANP基因克隆株,用双脱氧链终止法进行序列分析,证明核苷酸顺序正确。     

酶在非水相介质中的生物催化

本文主要综述了酶在非水相介质中实现生物催化反应的各种反应体系如液－液两相、反胶团、液－固两相、气相等的特点,性质及应用。     

人恶性疟杂合多肽抗原基因化学合成及克隆

本文报道用固相亚磷酰胺法合成人恶性疟杂合多肽抗原基因。基因全长为216bp,分为10个寡聚核苷酸片段分别合成,然后经T4 DNA连接酶按设计顺序连接成完整的杂合抗原基因,重组到噬茵体M13 mp 18 RF DNA内,转染大肠杆菌JM109。用分子杂交和酶切分析筛选出重组克隆体。经序列分析,证明所合成的人恶性疟杂合多肽抗原基因与所设计完全一致。     

固相3′-核糖核酸酶的制备及应用

1.对β-硫酸酯乙砜基苯胺通过醚化连接于葡聚糖凝胶G200,制成固相化的载体ABSE-葡聚糖凝胶。2.将红酵母3′-RNase 共价结合于重氮化的ABSE-葡聚糖凝胶G200制成固相3′-RNase。3.对于影响偶联及固相酶活力的一些因素进行了观察。4.固相3′-RNase 已应用于工业生产3′-单核苷酸,实际效率提高十余倍,产品质量符合要求。     

棘孢曲霉固态发酵柚皮产柚苷酶的条件优化

【目的】以柚皮为原料,优化棘孢曲霉利用柑橘加工副产物固态发酵柚苷酶的条件。【方法】采用高效液相色谱法检测酶活力,通过单因素试验考察固水比、装样量、接种量、温度对柚苷酶发酵的影响,用正交试验优化发酵条件。【结果】单因素试验结果的显著性分析表明培养基的固水比、装样量和培养温度对柚苷酶产量有显著性影响,而接种量影响不显著;经正交试验确定的优化条件是：固水比1:1 (质量体积比),装样量5 g/250 mL三角瓶,温度为30 °C,接种1 mL孢子悬浮液,发酵8 d。在此优化条件下,柚苷酶酶活力为8.19 IU/g干物质,比初始培养基产柚苷酶活力提高7.38倍。【结论】通过对固水比、装样量和发酵温度进行优化,大幅度提高了棘孢曲霉固态发酵柑橘加工副产物的柚苷酶产量,为柚苷酶的生产提供了一种高产发酵工艺。     

几丁质作固相载体检测人乙肝病毒表面抗原

用戊二醛作交联剂,将抗人乙肝病毒表面抗原(HBsAg)单克隆抗体共价固定于几丁质上,固定化后的抗体具有抗原结合活性,采用非竞争夹心法能从HBsAg阳性人的血清中检出明显的HBsAg结合反应,再生后的几丁质能重复用于酶免疫分析。同时还比较了几丁质作固相载体与聚苯乙烯板作固相载体酶联法的有关性质.     

化学合成的人免疫干扰素基因在E.coli中表达

山人的免疫干扰素(hIFN—r)基因,启始和终止信号加上适当的限制酶位点组成的一个454bp的双链DNA片段被总地合成了。该合成包括用快速的固相法制备的62个寡脱氧核苷酸,以及用酶连接这些寡核苷酸。这个合成的基因在lacuv5启动子控制之下,在E.coli中表达。表达产物具有抗病毒活性,该活性系对酸不稳定并完全地被抗hIFN—r抗血清中和,但不能被抗hIFN—α或者hIFN—β抗血清中和。用凝胶过泸法和SDT—聚丙烯酰胺凝胶电泳分别地测出E.coli产生的hIFN—γ的分子量约为32,000和17,000。     

与内含子相邻的核苷酸是tRNA内切酶的识别特征

含有内含子的tRNA前体必须经过剪接反应加工成熟.顺序比较指出与内含子顺序相邻的核苷酸有一定的特异性.用寡核苷酸定点突变技术改变这2个位点的核苷酸,确定这些tRNA前体的剪接效率.结果如下:当37位和38位都是嘌呤核苷酸时,tRNA内切酶能够有效地酶切酵母 tRNA~(phe)前体;如果其中的 1个位点变成嘧啶核苷酸,但另1个位点的核苷酸是野生型的嘌呤核苷酸,tRNA前体的酶切效率将降低.如果2个位点的核苷酸都发生变异,其中1个是嘧啶核苷酸,另1个是变异的嘌呤核苷酸,tRNA前体的酶切效率就会进一步降低.如果2个位点都是嘧啶核苷酸,tRNA前体就难以为tRNA内切酶酶切了.由此提出,与内含子相邻的核苷酸也是tRNA由切酶识别的结构特征.tRNA前体的37位和38位核苷酸的改变可能影响剪接位点之间的距离或它们的精细结构,从而影响tRNA内切酶酶切的效率.     

计算机在确定牛病毒性腹泻病毒基因组常用限制性内切酶位点中的应用

应用计算机测定71种限制性内切酶在牛病毒性腹泻病毒NADL株(BVDV NADL)基因组的cDNA核苷酸序列中酶切位点,结果表明其中S8种酶的酶切位点所在的核苷酸序列数,也表明了其中13种限制性内切酶在核苷酸序列中无酶切位点。这些结果有助于进一步研究BVDV InL株的cDNA基因库。