血红素加氧酶-1对肝癌细胞细胞周期调控因子的影响

目的观察血红素加氧酶-1（heme oxygenase 1,HO-1）对人肝癌细胞HepG2细胞周期调控因子的影响。方法构建含有野生型和突变型HO-1基因的重组载体pcDNA3．1（＋）-wtHO-1和pcDNA3．1（＋）-mHO-1G143H。利用脂质体介导的方法将构建好的重组载体转染肝癌细胞系HepG2,以空载体转染作为对照组。通过G418筛选建立稳定表达野生型和突变型HO-1的HepG2肝癌细胞系。经半定量RT—PCR、Western印迹检测转染细胞系中HO-1 mRNA和蛋白的表达水平。在HO-1表达改变的稳转细胞系中,利用Western印迹检测转染细胞系中P21、P27蛋白表达水平。结果成功实现了野生型和突变型HO-1在HepG2细胞中的过表达;野生型和突变型HO-1过表达均能诱导抑癌基因p21和p27的表达。结论HO．1过表达诱导抑癌基因p21和p27的表达与血红素分解产物无关。HO-1可能通过其它机制调节p21和p27的表达。     

p53基因对人胃癌细胞系恶性生长的影响

以p53cDNA为探针,用Southern印迹法对人胃癌细胞系BGC823进行了检测,发现该细胞中P53基因存在异常．将可在真核细胞表达的重组野生型P53质粒PC53一SN3和突变型P53质粒PC53—SCX3,用脂质体介导法,分别导入BGC823细胞,获得了较长时间耐受G418的多个阳性克隆．Southern印迹法证实阳性克隆细胞中有外源性P53基因存在．比较BGC823细胞,转染野生型及突变型P53质粒的3种细胞生长曲线和软琼脂集落形成状况发现,野生型P53基因对BGC823细胞恶性生长有一定抑制作用．     

重组K-Ras突变基因在胰腺癌Bxpc-3细胞株中的表达及其对化疗药物药效的影响

K-Ras是Ras基因家族中的一员,在细胞生存、增殖和分化过程中发挥重要作用.当Ras基因发生突变时,其表达的Ras蛋白可能被过度激活,从而导致肿瘤的产生和发展.胰腺癌中K-Ras的突变频率较高,但其对胰腺癌化疗药物药效的影响尚不明确.本文以p Ac GFP1-C3质粒为载体构建了含有5种不同基因型K-Ras序列的重组质粒,分别为野生型和G12V,G12R,G12D,G13D 4种突变型.将上述重组质粒转入人胰腺癌Bxpc-3细胞株并筛得稳转株.结果显示,转染野生型和突变型K-Ras的细胞株具有相似的生长速度,且细胞中K-Ras-GFP融合蛋白的表达量也一致.药效学研究显示,转染突变型K-Ras基因的细胞对吉非替尼、5-氟尿嘧啶、多西他赛和吉西他滨的药物敏感性降低,而对厄罗替尼和顺铂的药效则无显著影响,这可能与转染突变型K-Ras基因的细胞中K-Ras下游信号p-Akt和p-Erk的水平升高有关.此外,转染不同突变型K-Ras导致的药效及p-Akt,p-Erk的表达变化也不同.体外研究结果表明,K-Ras突变细胞对多种化疗药物的药效敏感性降低,同时不同突变型细胞之间药效也有差异,该结果有待进一步深入研究.     

生半夏、南星水提物对人胃癌BGC823 细胞的侵袭力及 HIF-1αmRNA 蛋白表达的影响

目的:观察生半夏、南星中药水提物对缺氧环境中人胃癌细胞株BGC823细胞HIF-1α蛋白表达和侵袭力的影响。方法:运用CoCl(2氯化钴)诱导BCG823细胞缺氧,使得细胞中HIF-1α蛋白表达升高.实验组加入生半夏、南星水提物对细胞进行预处理,然后在进行缺氧诱导。通过甲基噻唑基四唑法(MTT)检测细胞活性,使用Transwell检测细胞侵袭能力变化,RT-PCR、Western blotting分别检测HIF-1α mRNA及蛋白含量及变化。结果:生半夏、南星水提物能抑制人胃癌BGC823细胞的增殖;生半夏、南星水提物均能抑制缺氧诱导胃癌细胞的侵袭力,并且能降低HIF-1α mRNA及蛋白表达。结论:生半夏、南星水提物可抑制人胃癌BGC823细胞的增殖,抑制人胃癌BGC823细胞侵袭力,可能通过降低HIF-1α蛋白表达有关。     

生半夏、南星水提物对人胃癌BGC823细胞的侵袭力及HIF-lαmRNA蛋白表达的影响

摘要目的：观察生半夏、南星中药水提物对缺氧环境中人胃癌细胞株BGC823细胞HIF-lα蛋白表达和侵袭力的影响。方法：运用CoCl2（氯化钴）诱导BCG823细胞缺氧,使得细胞中HIF-1α蛋白表达升高．实验组加入生半夏、南星水提物对细胞进行预处理,然后在进行缺氧诱导。通过甲基噻唑基四唑法（MTT）检测细胞活性,使用Transwell检测细胞侵袭能力变化,RT-PCR、Weste-rn blotting分别检测HIF-lαmRNA及蛋白含量及变化。结果：生半夏、南星水提物能抑制人胃癌BGC823细胞的增殖;生半夏、南星水提物均能抑制缺氧诱导胃癌细胞的侵袭力,并且能降低HIF-1αmRNA及蛋白表达。结论：生半夏、南星水提物可抑制人胃癌BGC823细胞的增殖,抑制人胃癌BGC823细胞侵袭力,可能通过降低HIF-1α蛋白表达有关。     

小鼠GITRL基因真核表达质粒的构建转染及其在Kupffer细胞中的表达

目的构建含小鼠GITRL基因的真核表达质粒pEGFP-N1-GITRL,体外转入小鼠Kupffer细胞。方法利用PCR方法扩增GITRL基因,克隆至pEGFP-N1载体,选择阳性克隆并进行序列测定。以脂质体化学法转染至Kupffer细胞中。结果构建了真核表达质粒pEGFP-N1-GITRL,基因测序与GenBank中发表的序列完全一致,体外瞬时转染Kupffer细胞,RT-PCR及WB检测该Kupffer细胞表达GITRL。结论成功构建了真核表达质粒pEGFP-N1-GITRL,并在小鼠Kupffer细胞成功表达,为进一步研究GITRL在Kupffer细胞中的的生物学功能提供研究基础。     

抗病毒固有免疫分子TRIM22 C端SPRY结构域对其转录、翻译及亚细胞定位的影响

本文旨在探讨TRIM22 C端SRPY结构域对其转录、翻译及亚细胞定位的影响。以野生型TRIM22真核表达质粒为模板,扩增出C端SPRY结构域缺失的TRIM22基因片段,并将其克隆入真核表达质粒pcDNA3.1。将野生型和突变型TRIM22真核表达载体分别转染高分化人肝癌细胞株HepG2。通过反转录-聚合酶链反应检测其mRNA表达水平,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测其蛋白表达水平,并通过间接免疫荧光法检测其亚细胞内定位。结果成功构建了C端SPRY结构域缺失的TRIM22真核表达质粒。转染HepG2细胞后,TRIM22 SPRY结构域缺失突变体在转录和翻译水平上均与野生型TRIM22无明显差异,但TRIM22 SPRY结构域缺失突变体完全丧失了核定位能力,这为进一步研究SPRY结构域在TRIM22抗病毒过程中所发挥的作用及机制提供了有益的启示。     

低氧模拟剂氯化钴对胃癌细胞BGC823中S100A4基因表达的影响

摘要: S100A4基因是肿瘤侵袭转移相关的重要基因, 该基因高表达与胃癌浸润、淋巴结转移及胃癌细胞体外侵袭力密切相关。为探讨S100A4基因高表达的机制, 文章应用低氧模拟剂氯化钴处理胃癌细胞BGC823, RT-PCR、免疫组化、免疫荧光及Western blotting方法分别检测BGC823细胞中S100A4 mRNA及蛋白表达情况。结果显示, 氯化钴处理胃癌BGC823细胞后, S100A4 mRNA及蛋白表达明显增加。提示低氧模拟剂氯化钴可促进胃癌细胞BGC823中S100A4 基因表达。     

用于活体影像技术稳定表达荧光素酶的肺癌细胞系的建立

目的:建立稳定表达萤火虫荧光素酶的人肺癌细胞系并进行体外验证.方法:亚克隆萤火虫荧光素酶基因到真核表达载体pRc/CMV2上,构建重组质粒pRc/CMV2.1uc+,转染到肺癌细胞株spc-a-1,经过G418筛选获得单细胞抗性克隆.抗性克隆连续传代,并通过荧光素酶活性检测筛选出高水平表达荧光素酶的稳定细胞克隆,在体外检测细胞的生物发光能力与细胞数量的相关性.结果:构建的pRc/CMV2-1uc+真核表达质粒转染spe-a-1细胞后,经G418筛选出多个抗性克隆;传代至40代时确定有3株细胞的荧光素酶活性最高;活体影像系统体外检测证实阳性细胞株发光强度与数量呈正相关.结论:结果表明成功构建了稳定表达萤火虫荧光素酶的spc-a-1细胞系.     

DLC-1基因表达对结肠癌细胞侵袭转移能力的影响

目的:研究DLC-1基因对结肠癌细胞侵袭迁移能力的影响.方法:将DLC-1 shRNA(短发夹状RNA,short hairpin RNA)序列克隆到质粒pGCsi-U6/Neo载体,采用脂质体介导的转染方法将构建的DLC-1 shRNA表达质粒转入结肠癌细胞系LoVo细胞.采用RT-PCR技术和Western Blot技术分别检测LoVo细胞中DLC-1mRNA和蛋白表达水平的变化.Transwell小室人工重组基底膜侵袭转移实验观察LoVo细胞侵袭迁移能力的改变.结果:结肠癌细胞系LoVo细胞表达DLC-1分子.所构建质粒表达载体能有效地干扰LoVo细胞DLC-1 mRNA和蛋白质表达水平;Transwell小室人工重组基底膜侵袭转移实验结果显示,转染后LoVo细胞侵袭转移能力明显增强(p＜0.05).结论:结肠癌细胞系LoVo细胞表达DLC-1基因,应用RNAi技术可特异性降低其表达.DLC-1的表达水平与结肠癌细胞侵袭转移相关.     

人PAK1重组蛋白质的表达及在人胃癌BGC-823细胞内定位

为检测人PAK1在原核细胞中的表达情况及在真核细胞中的定位,利用RT-PCR技术获得PAK1目的基因,构建GST融合蛋白原核表达载体pGEX-5X-1/PAK1,IPTG诱导后进行SDS-PAGE及Western印迹检测,并用体外激酶实验测定其生物学活性;同时,构建带绿色荧光蛋白(GFP)标签的真核表达载体pEGFP/PAK1,利用脂质体法转入人胃癌BGC-823细胞系中,在共焦激光扫描显微镜下观察癌细胞中绿色荧光蛋白的表达。结果表明,pGEX-5X-1/PAK1载体能在大肠杆菌BL-21中正确表达GST-PAK1融合蛋白,大小约为94kDa,具有生物活性;PAK1绿色荧光蛋白定位于细胞浆。上述研究为进一步探索PAK1的生物学特性及信号转导通路打下了基础。     

上调hMLH1基因表达对卵巢癌药物敏感性的影响

构建携带错配修复基因hMLH1编码序列全长的真核表达质粒pCAN—hMLHl,并探讨其对卵巢癌细胞顺铂耐药的逆转作用。应用基因重组技术将pET28-hMLHl中的目的基因hMLHl定向克隆到真核表达载体pCAN,经酶切及测序鉴定：分别将pCAN—hMLHl和空质粒pCAN转染进卵巢癌耐药细胞SKOV3／DDP,同时以对顺铂敏感的sKOV3细胞和未转染的SKOV3／DDP细胞作为对照：应用RT-PCR和Westemblo凇测转染前后细胞内hMLHlmRNA和蛋白的表达变4Jc;四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测转染前后sKOv3／DDP细胞对顺铂敏感性的变化;Hoechst染色检测转染前后细胞的凋亡。结果提示：pCAN—hMLHl重组质粒经酶切及测序鉴定,表明真核表达质粒构建正确;采用脂质体法转染sKOv3／DDP细胞后,RT-PCR和Westernblot检测到耐药细胞内hMLHl的表达增强：MTT结果显示转染重组质粒后sKOv3／DDP细胞对顺铂的敏感性显著增加;Hoechst染色观察到转染后耐药细胞的凋亡明显增强。该研究成功构建了pCAN．hMLHl重组质粒,在sKOV3／DDP细胞中进行表达,并能增强耐药细胞对顺铂的敏感性,促进耐药细胞的凋亡。     

HPV16L1抗原表达肿瘤模型的建立

应用基因重组技术,构建pcDNA-L1真核表达载体,经限制性内切酶和序列分析,用脂质体转染技术将其转入B16细胞,G418稳定筛选后IFA法检测其表达,RT-PCR法检测HPV16L1 mRNA 的生成,并将转染细胞接种小鼠皮下,观察成瘤情况及RT-PCR法检测HPv16L1 mRNA的生成。结果,酶切鉴定证实重组质粒中插入的目的基因片段及载体大小、方向和插入位点均正确,在转染的 B16细胞中可见绿色荧光并检测到HPV16L1 mRNA的生成,接种的转染细胞在小鼠皮下可成瘤, 接种后1月在肿瘤组织中可检测到HPV16L1 mRNA的生成,B16细胞转染L1后其致瘤性与转染空载体组和野生型B16细胞组无明显差异。     

人源NOVA1蛋白的真核表达及其抗低氧活性鉴定

构建人NOVA1基因的真核表达载体pCMV-Myc-NOVA1,转染PC12细胞后筛选最佳转染条件,进而结合细胞免疫组织化学研究NOVA1蛋白在PC12细胞中的表达分布,并探究其抗低氧活性。根据NCBI数据库NOVA1基因序列设计上下游引物,以pCR4-TOPO-NOVA1载体为模板采用聚合酶链式反应扩增获得NOVA1基因的全长c DNA编码序列,限制性内切酶SalⅠ和XhoⅠ双酶切后插入pCMV-Myc真核表达载体,酶切及直接测序验证后采用脂质体转染法转染入PC12细胞,针对转染比例和转染时间进行优化,进而采用实时定量PCR和Western blotting检测NOVA1蛋白的表达,最后采用细胞免疫组织化学检测NOVA1蛋白在PC12细胞中的表达定位及其抗低氧活性。通过酶切和直接测序验证,成功构建了真核表达载体pCMV-Myc-NOVA1;质粒和Lipo2000最佳转染比例为1:2.5,最佳转染时间为72 h;最佳转染条件下NOVA1基因和蛋白的表达水平显著增加,转染pCMV-Myc-NOVA1质粒后,NOVA1蛋白主要分布于细胞核和细胞质;过表达NOVA1的PC12细胞增殖活性明显增加。本文采用分子克隆的方法成功构建了NOVA1基因的真核表达载体,通过条件优化实现了高效表达并测定过表达NOVA1蛋白具有明显的抗低氧活性,不仅为深入揭示NOVA1蛋白的作用机理提供了重要参考,而且为NOVA1蛋白潜在的药物开发提供了重要技术支撑。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建含有天然完整的乙型肝炎病毒(HBV)X基因序列的真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法:设计并合成HBV X基因的引物,用PCR方法从含完整HBV全基因的HepG2细胞中扩增X基因序列,并将其连接到真核表达载体pVAX-1上,酶切、PCR鉴定;用Triton X-114去除质粒内毒素后,采用电穿孔法将重组质粒pVAX-HBV X和空质粒pVAX-1分别转染SMMC-7721细胞,RT-PCR法检测HBV X基因mRNA的表达,Western印迹鉴定HBV X蛋白(HBx)的表达。结果:酶切和PCR鉴定证实pVAX-HBV X载体中包含完整的HBVX基因片段,该重组质粒转染的SMMC-7721细胞中HBV X基因mRNA及HBx蛋白的表达稳定。结论:构建了HBV X基因的真核表达载体,为X基因及其编码蛋白的生物学功能的研究提供了可靠的基因材料。     

人LC3B基因的真核表达及鉴定

目的:构建带HA标签的重组人LC3B基因的真核表达载体,获得HA-LC3B融合蛋白,并初步检测其生物学功能。方法:从人乳腺文库中通过PCR技术扩增LC3B基因编码序列,将其插入pc DNA3.0-HA载体,获得HA-LC3B真核表达载体;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测转染细胞的表达情况,免疫共沉淀实验证实其生物学活性。结果:双酶切和测序结果表明HA-LC3B真核表达质粒构建成功,Western印迹表明重组质粒转染293T细胞后获得表达;免疫共沉淀实验显示HA-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白相互作用,具有较好的生物学活性。结论:在真核表达系统中表达了带HA标签的人LC3B,为进一步研究细胞自噬奠定了基础。     

人Six1基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究简

目的：构建带myc标签的Sixl基因的真核表达载体,获得myc-Sixl融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法：以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增Sixl编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体,West-ern印迹检测其在人293T细胞中的表达;将重组质粒-9空载体分别转染乳腺癌细胞ZR75-1,通过qRT-PCR检测细胞中VEGF-C在mRNA水平的变化。结果：双酶切和测序结果表明myc-Six1真核表达质粒构建成功;Western印迹证明转染293T细胞后成功表达;qRT—PCR结果表明myc-Sixl可升高乳腺癌细胞ZR75-1的VEGF-C转录水平。结论：构建了带myc标签的Six1表达载体,为进一步研究Six1在乳腺癌转移中的作用奠定了基础。     

双荧光素酶报告系统鉴定miR-204对水通道蛋白1基因的调控作用

[目的]构建水通道蛋白1(AQP1)基因3'-UTR双荧光素酶报告载体,并验证miR-204与AQP1基因的靶向调控关系。[方法]采用生物信息学软件预测miR-204与AQP1基因的结合位点;荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测转染miR-204抑制剂前后miR-204及AQP1在K562细胞中的表达改变;构建AQP1-3'UTR野生型及突变型重组质粒,与miR-204、阴性对照共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。[结果]转染miR-204抑制剂后,miR-204表达量较阴性对照及空白对照组明显下降,分别为1. 97、9. 32、11. 25(P 0. 01);而AQP1基因表达显著增高,分别为13. 14、2. 29、2. 54(P 0. 01);酶切及测序结果表明已成功构建psi CHECKTM-2-AQP1 3'-UTR野生型和突变型重组质粒。荧光素酶活性结果表明,miR-204可使野生型AQP1 3'-UTR质粒荧光素酶活性降低约65. 9%,而对突变型质粒荧光素酶活性没有显著影响。[结论]成功构建了AQP1基因3'-UTR的荧光素酶报告基因载体,miR-204对AQP1存在靶向调控。     

下调lincRNA HOTAIR对胃癌细胞迁移及增殖抑制作用的研究

通过下调人胃癌细胞BGC823中linc RNA HOTAIR基因的表达,该文探讨了linc RNA HOTAIR低表达对胃癌细胞迁移、侵袭及增殖能力的影响。该文构建针对人linc RNA HOTAIR基因的干扰质粒sh HOTAIR,稳定转染入胃癌细胞BGC823、筛选稳转株,q PCR检测linc RNA HOTAIR在胃癌细胞中表达水平。采用划痕试验、侵袭试验、MTT法分别检测转染胃癌细胞迁移、侵袭及增殖能力。结果表明,稳定转染干扰质粒sh HOTAIR后下调linc RNA HOTAIR表达的胃癌细胞株细胞迁移、侵袭及增殖能力较阴性对照组明显减弱。下调胃癌细胞中linc RNA HOTAIR的表达,可降低胃癌细胞的迁移力、侵袭性、抑制其增殖能力,提示linc RNA HOTAIR可作为分子靶点用于胃癌的分子靶向治疗。     

小鼠DLL1真核表达载体的构建及其在肿瘤细胞中的表达

目的：构建带绿色荧光蛋白的小鼠DLL1全长基因真核表达载体,并在肿瘤细胞中表达。方法：利用PCR特异性引物扩增出DLL1基因全长,将克隆的基因片段插入带绿色荧光蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP质粒中。然后利用脂质体将重组质粒pIRES2-EGFP-DLL1转染进小鼠B16黑色素瘤细胞中,并通过G418筛选后选取生长良好、荧光强度高的三株单克隆进行mRNA水平DLL1表达的鉴定。结果：成功扩增小鼠DLL1的全长基因。克隆入质粒载体后,通过DNA序列测定证实其序列正确。将构建的pIRES2-EGFP-DLL1质粒转染小鼠B16黑色素瘤细胞,经过G418筛选和荧光显微镜观察后,挑选得到GFP阳性率90%以上的稳定转染细胞株。RT-PCR检测稳定转染细胞的mDLL1的表达显著增加,进一步证实了pIRES2-EGFP-DLL1的表达效能。结论：成功构建了小鼠DLL1基因的真核表达质粒,证实其在真核细胞B16中可以表达。