麦冬OjRCA基因植物表达载体的构建

Rubisco活化酶(RCA)对光合关键酶Rubisco具有重要的调节作用.以植物表达裁体pBI121为基础,设计分别带有酶切位点Sma Ⅰ和Sac Ⅰ的一对特异引物,以麦冬叶片总RNA反转录得到的第一条cDNA链为模板,扩增得到目的基因OjRCA.用Sma Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切目的基因及表达载体pBI121,回收后利用T4DNA连接酶连接,获得植物表达载体pBI121-OjRCA.通过冻融法将所获得的植物表达裁体导入根癌农杆茵EHA105菌株中,为该基因的功能鉴定及通过农杆菌介导法将OjRCA基因导入植物提高相关抗性提供参考.     

灵芝-8基因的番茄果实特异性启动子植物表达载体的构建

构建含有灵芝-8（LZ-8）基因和番茄果实特异性E8启动子的重组载体,并将其转化到根瘤农杆菌中。通过PCR法获取LZ-8基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pBI121中,获得果实特异性表达LZ-8蛋白的重组质粒。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定,将其转入根瘤农杆菌GV3101中。PCR法、限制性内切酶酶切图谱和序列测定分析均表明番茄果实特异性表达LZ-8蛋白的重组质粒构建成功。获得了含有LZ-8基因和E8启动子的重组质粒,并成功转化根瘤农杆菌,为下一步LZ-8蛋白在番茄果实中特异表达奠定基础。     

人干扰素α-2b 基因在烟草中的表达研究

应用PCR的技术从质粒pAIFN中扩增人干扰素α-2b（Human interferon α-2b,HuIFN α-2b）编码基因,将其连接到pBI121双元载体构建植物真核表达载体pBIFN;用冻融法将该载体转染根癌农杆菌LBA4404;并用叶盘浸染法转化烟草叶片,经转化的烟草叶片的组织培养,诱导愈伤获得再生植株。通过应用PCR,RT-PCR,Wes-tern blot和WISH/VSV方法检测获得的烟草再生植株,结果表明HuIFN α-2b基因已成功整合进烟草核基因组并表达出具有活性的HuIFN α-2b蛋白。本文对HuIFN α-2b基因在烟草核系统中的表达进行了研究,为进一步在烟草叶绿体系统中该基因的表达研究奠定了基础。     

影响农杆菌转化效率的植物因子H2A1基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

拟南芥组蛋白H2A1是影响农杆菌T-DNA整合到宿主基因组的关键因素之一。与其它H2A组蛋白一样,它含有1个保守的H2A结构域。本研究利用PCP技术从拟南芥中成功扩增到H2A1基因组序列的全长。产物纯化后克隆到pBI121(Kmr),从而构建了H2A1的植物表达载体pBI121-H2A1。PCR和DNA测序证实载体构建成功。最后用电击法将该重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404菌株中形成工程菌。此表达载体的构建为进一步研究H2A1的功能和提高外源基因在植物中稳定表达水平奠定了基础。     

轮状病毒VP7基因的克隆及其植物表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了轮状病毒VP7基因,并将其克隆到pMD18-Tvectr载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了DNA全序列.结果表明,克隆片段全长为981 bp.将轮状病毒VP7基因定向的克隆到植物表达载体pBI121启动子下游,构建了植物表达载体.     

人干扰素α-2b基因在烟草中的表达研究

应用PCR的技术从质粒pAIFN中扩增人干扰素α-2b(Human interferon α-2b,HuIFN α-2b)编码基因,将其连接到pBI121双元载体构建植物真核表达载体pBIFN;用冻融法将该载体转染根癌农杆菌LBA4404;并用叶盘浸染法转化烟草叶片,经转化的烟草叶片的组织培养,诱导愈伤获得再生植株。通过应用PCR,RT-PCR,Wes-tern blot和WISH/VSV方法检测获得的烟草再生植株,结果表明HuIFN α-2b基因已成功整合进烟草核基因组并表达出具有活性的HuIFN α-2b蛋白。本文对HuIFN α-2b基因在烟草核系统中的表达进行了研究,为进一步在烟草叶绿体系统中该基因的表达研究奠定了基础。     

蒙古冰草MwLEA3基因植物表达载体的构建

以植物双元表达载体pCAMBIA2300为基础,设计分别带有酶切位点XbaI和PstI的一对引物,从克隆载体pGM-T-MwLEA3中扩增到目的基因MwLEA3。用XbaI和PstI双酶切该目的基因及表达载体pCAMBIA2300,回收后利用T4DNA连接酶连接,获得植物表达载体pCAM-MwLEA3。通过冻融法将所获得的植物表达载体重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404菌株中,为该基因的功能鉴定及通过农杆菌介导法将MwLEA3基因导入植物提高相关抗性奠定了基础。     

农杆菌LBA4404不含内源GUS基因

用长度为21bp的一对β－葡糖苷酸酶（GUS）基因的PCR引物,从根癌农杆菌LBA4404细胞总DNA中扩增不出任何片段,但从合pBI121的LBA4404细胞总DNA中可扩增出一条预期大小（1．2kb）的GUS基因片段,这表明根瘤农杆菌LBA4404不含内源GUS基因．     

抗冻蛋白(afp)基因表达载体的构建及对香蕉胚性细胞悬浮系的转化

通过PCR从‘京都七寸人参'胡萝卜基因组DNA中扩增抗冻蛋白基因,测序结果表明该基因的核苷酸序列与从宁夏‘吴忠'胡萝卜中克隆的完全一致。先后将获得的胡萝卜afp基因克隆和亚克隆至pMD18-T和pBI121,构建植物表达载体pBI121-afp。通过冻融法将pBI121-afp导入根癌农杆菌EHA105中。以香蕉栽培品种‘北大矮蕉'的胚性细胞悬浮系为受体,采用农杆菌介导法将胡萝卜afp基因导入其中,然后在Kanamycin的选择压力下通过体细胞胚发生途径进行植株再生。共获得抗性再生植株9株,其中两株经PCR检测呈阳性,可初步确定目的基因已经整合到这两株转基因香蕉植株的基因组中。     

辣椒ML基因植物表达载体的构建及其转化

为分析辣椒ML基因在抗辣椒疫病方面的作用,构建了ML基因的植物表达载体pBI121-ML,采用快速冻融法将表达载体导入农杆菌EHA105,并用农杆菌介导法转化辣椒感病品种B12,对得到的转化植株经PCR和RT-PCR分子检测,结果显示,获得了4个辣椒转基因株系.     

甜味蛋白thaumatin基因转入烟草的研究

利用基因工程技术,将分别克隆在两个不同载体上的甜味蛋白thaumatin cDNA基因片段连接成一个完整的cDNA基因,并将该基因克隆进pBI121,构建成表达载体pBI121-tha。通过冻融法导入农杆菌,农杆菌介导叶盘法转入烟草,经过组培,得到转基因的植株。提取转基因烟草总DNA,经PCR,PCR—Southern和Southern杂交证实,甜味蛋白基因已整合到烟草基因组中。RT—PCR结果证明,thaumatin基因已在转基因烟草中转录成mRNA,但SDS—PAGE和甜味尝试都表明thaumatin基因在转基因烟草中没有表达出甜味蛋白。     

诱导人参发根的rolC基因植物表达载体构建及其在人参中的表达

根据Slightom等RiA₄TL-DNA序列分析结果 ,设计了一对引物 ,以R_i 质粒DNA为模板 ,利用PCR方法对rolC基因进行了扩增。利用pGEM-T载体对rolC基因进行了克隆和测序。结果 ,克隆的DNA片段序列与报道的ORF12阅读框内的rolC序列一致。将pGEM-T-rolC用限制性内切酶SacI酶切 ,与经SmaI酶切CIAP去磷酸化的pUC19质粒重组 ,经蓝白斑筛选得到正向重组的pUC19-rolC。再用Xbal-SacI双酶切pUC19-rolC与pBI121 ,将rolC基因定向克隆到具有CaMV35S启动子的pBI121表达质粒上 ,构建成植物表达载体pBI-rolC。用pBI-rolC转化农杆菌LBA4404构建成的LBA4404 (pBI-rolC)工程菌转化人参子叶 ,获得发根的表达。经PCR扩增分子检测 ,证明rolC基因确已整合到人参发根基因组中。经对转化的人参发根中单体皂苷含量测定 ,发现发根中含有所检测的 7种人参单体皂苷 ,总皂苷含量达 18.55mg/g。     

猪干扰素-α基因的克隆及其植物表达载体的构建

目的:克隆与分析猪干扰素-α(INF-α)基因,构建猪干扰素基因的高效植物表达载体。方法:根据NCBI中DQ248997序列设计引物,以猪的总DNA为模板,PCR扩增出猪的INF-α基因,克隆至pBS-T载体后进行序列分析,构建猪干扰素基因的植物表达载体。结果:实验所克隆序列经Blastn比对,98%的核酸序列相同,98%的蛋白质序列相同,3个非功能性氨基酸与基因库中序列不一致,推测为猪INF-α的一个亚型。构建的2个植物表达载体经BamHⅠ/SacⅠ限制性内切酶消化,均可得到570bp的目的基因。结论:成功克隆了猪的INF-α基因,并构建出含猪INF-α基因的高效植物表达载体pBI121/INF和pCAMBIA1301/INF。     

银杏CONSTANS基因植物表达载体构建

目的:构建银杏CONSTANS基因的表达载体.方法:PCR扩增CO基因得到1.2kb左右的片段,用BamH Ⅰ+HindⅢ酶切纯化,通过T4 DNA连接酶连接到植物表达载体pCAMBIA 1304上,并转化到农杆菌LBA4404,然后进行菌落PCR及酶切鉴定.结果:载体构建成功.结论:构建了GbCO正义链和反义链的植物表达载体pCAMBIA 1304-GbCOs和pCAMBIA 1304-GbCOa,可用于GbCO基因的转基因功能研究.     

两种质粒中gus基因在植物细胞和根癌农杆菌中的表达特性研究

以含有基因转化操作过程中常用的两种质粒载体pBI121和pCAMBIA2301的根癌农杆菌EHA105为材料,分别转化甜瓜子叶,应用组织化学方法检测了甜瓜子叶和子叶培养后的愈伤组织及根癌农杆菌菌液的瞬时转化效果,研究了两种不同的质粒载体上所含的gus基因在根癌农杆菌中和植物细胞中的表达特性.结果表明,不同质粒载体上所含的gus基因的表达特性不同,质粒载体pBI121上所含的gus基因既能在植物细胞中能表达,也能在根癌农杆菌细胞中表达,而质粒载体pCAMBIA2301上所含的gus基因能在植物细胞中表达,但是不能在根癌农杆菌细胞中表达.     

抗虫双价基因表达载体的构建及微束激光转化植物研究

将苏云金芽孢杆菌伴孢晶体(Bacillus thuringiensis,Bt)蛋白的基因与反枝苋菜凝集素(Amaranthus retrojflexus agglutinin,ARA)基因构建成双价基因的表达载体,编码一种既能抗鳞翅目害虫,又能抗同翅目蚜虫的杀虫蛋白.把双价基因(Bt-BA)连接到原核表达载体pET28a和植物表达载体pBI121上,经过限制性酶切分析和PCR鉴定,结果表明:含有双价基因的原核和真核重组表达质粒均已构建成功.将该双价基因转入油菜,获得抗性小植株.     

玉米Lc基因植物表达载体构建及菊花转化

Lc基因是从玉米中分离得到的与花青素合成相关的调节基因,它在多种植物中的异源表达可以增加花青素的含量.本研究对pBI121载体Gus基因后的终止子进行2次PCR扩增,在原Sac Ⅰ酶切位点后添加了新的Sac Ⅰ酶切位点,利用组织化学染色法检测,结果表明改造后的载体上的Gus基因能正常表达,终止子功能正常,载体改造成功.用改造的pBI121N构建了含有Lc基因的植物表达载体pBl121N-Lc,利用农杆菌介导法转化菊花叶盘,获得了19株生根抗性苗.通过提取抗性苗基因组总DNA,PCR扩增Lc基因和CaMv35S启动子获得了11个阳性株系,PCR结果表明Lc基因已经转入菊花中.同时,在已获得的转基因植株中发现7个株系的根系有变红的现象.     

毛白杨纤维素合成酶基因（PtoCesA1）克隆及正义植物表达载体的构建

以毛白杨形成层为材料克隆了毛白杨纤维素合成酶基因（PtoCesA1）,序列分析表明该基因序列为3215bp, 与欧洲颤杨的PtCesA1基因同源性为97% 具有开放的阅读框,编码区在52~2985碱基之间,编码区为2925bp。通过同义突变引入BamHI酶切位点,将全长基因克隆到植物表达载体pBI121中,经酶切和PCR鉴定确认载体构建正确,为下一步ptoCesA1转基因功能研究打下了基础。     

单纯疱疹病毒gG1基因植物表达载体的构建

[目的]提高gG1基因中植物的表达量,研制Ⅰ型单纯疱疹病毒的口服植物疫苗。[方法]PCR扩增植物组成型表达启动子CaMV35S、378 bp的单纯疱疹病毒gG1基因、NOS终止子基因,将这些基因插入植物表达载体pCAMBIA1301的多克隆位点处,将pCAMBIA1301-gG1转化至大肠杆菌DH5α,用双酶切、测序进行鉴定。最后,将其转化至农杆菌EHA105,用PCR进行鉴定。[结果]从转化农杆菌中提取pCAMBIA1301-gG1DNA中得到了预期大小的gG1基因。[结论]成功构建了单纯疱疹病毒gG1基因的植物表达载体,为转化植物奠定了基础。