家蚕微孢子虫中小RNAs的全基因组鉴定与分析

【目的】家蚕Bombyx mori微粒子病是蚕业生产上的毁灭性病害,家蚕微孢子虫Nosema bombycis是该病的病原,可经卵垂直传播和经口水平传播。为了探索家蚕微孢子虫中对重复元件的抵御以及对基因转录调控的潜在方式,本研究拟在基因组水平上对该物种的小RNAs进行全面系统的分析,鉴定与转座子相关的小RNAs和潜在的miRNAs。【方法】从感染家蚕微孢子虫的家蚕中肠中提取总RNA,分离小片段RNA并反转录后,进行Solexa高通量测序。通过生物信息学方法对小RNAs进行分类及功能注释,鉴定起源于家蚕微孢子虫不同类型转座子的小RNAs,并对潜在的miRNA进行预测分析。【结果】家蚕微孢子虫小RNAs的长度主要是24和25 nt,其中大部分序列表现出5′末端的尿嘧啶偏好性。家蚕微孢子虫中存在丰富的与转座子相关联的小RNAs,并且与转座子标准序列匹配的反义小RNAs明显多于正义小RNAs。同时,鉴定获得了31个候选miRNAs,部分为Nosema属的其他孢子虫中所共有,暗示其在微孢子虫基因组进化上具有保守性。【结论】首次鉴定到家蚕微孢子虫的转座子相关性小RNAs,暗示小RNAs在家蚕微孢子虫基因组对转座子防御过程中起到作用,31个潜在的miRNAs为家蚕微孢子虫miRNAs的功能验证提供了后续靶标。     

梨花迁粉蝶微孢子虫对家蚕的侵染力与胚传性

【目的】对梨花迁粉蝶Catopsilia pyranthe分离的微孢子虫进行形态与分子鉴定,探究其对非天然宿主家蚕Bombyx mori的侵染力与胚传性。【方法】从田间采集的梨花迁粉蝶中分离得到梨花迁粉蝶微孢子虫液,测定其孢子的形态、大小、体积、长短轴比,同时对该孢子虫的16S r DNA进行PCR克隆测序与分析。将梨花迁粉蝶微孢子虫Nosema sp.CP与家蚕微孢子虫N.bombycis分别对2龄起蚕、4龄起蚕进行添食感染比对,测定家蚕食下两种微孢子虫的感染率和胚种传染能力。【结果】本研究分离的梨花迁粉蝶微孢子虫形态为长椭圆形,具双核;其16S r DNA序列与已报道的梨花迁粉蝶微孢子虫的序列一致性大于99%,为梨花迁粉蝶微孢子虫。梨花迁粉蝶微孢子虫和家蚕微孢子虫对家蚕综合感染率分别是68.8%和98.3%;在继代蚁蚕中,感染梨花迁粉蝶微孢子虫和家蚕微孢子虫的雌蛾所产蚕卵次代蚁蚕检出有孢子虫的检出率分别为100%和100%,卵壳的孢子虫的检出率分别为92.9%和100%;梨花迁粉蝶微孢子虫和家蚕微孢子虫对家蚕的胚种传染力分别为9.6%和23.2%。【结论】本研究分离得到的微孢子虫为梨花迁粉蝶微孢子虫,具有微孢子虫Nosema属的典型特征。梨花迁粉蝶微孢子虫能感染危害家蚕,也具有家蚕胚种传染性,但感染率和胚传率均明显低于家蚕微孢子虫,是蚕业生产中必须防控的对象。     

一株家蚕异型微孢子虫感染特征和分类地位

【背景】家蚕微粒子病是一种对蚕业生产危害巨大的蚕病,该病病原是蚕种生产唯一检疫对象,而家蚕病原性微孢子虫种类多、来源复杂,给蚕种生产微粒子病的防控增加了难度。【目的】研究一株从蚕种检疫样品中分离的微孢子虫(命名为GXM15)的致病性和分类地位,鉴定并分析其来源,完善家蚕病原性微孢子虫分类和数据库,为蚕种生产控制家蚕微粒子病提供参考依据。【方法】采用生物试验方法测定GXM15微孢子虫对家蚕的半数感染浓度(IC50)和胚种传染率;显微镜观察GXM15微孢子虫孢子形态,利用透射电子显微镜观察GXM15微孢子虫的超微结构;采用PCR扩增、T克隆和测序获得GXM15微孢子虫的SSU rRNA基因和ITS片段DNA序列,并利用MEGA 5.0和DNAstar软件构建GXM15微孢子虫的系统发育树和遗传距离分析。【结果】GXM15微孢子虫对家蚕的IC50为8.29×104个/mL,是家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)的2.28倍;GXM15微孢子虫对家蚕的胚种传染率为3.6%,明显低于Nb;GXM15微孢子虫形态呈短卵圆形,大小为(2.05±0.20)× (3.25±0.30) μm,GXM15微孢子虫体积是Nb微孢子虫的2.19倍;GXM15微孢子虫超微结构具双核,极丝13圈,极丝倾斜角约45°,符合Nosema属的特征;GXM15微孢子虫SSU rRNA基因在系统发育树中位于Nosema属分支中,遗传距离分析表明GXM15微孢子虫与Nb同属异种,是一株新微孢子虫。【结论】GXM15微孢子虫是一株家蚕病原性微孢子虫,根据GXM15微孢子虫致病性和分类地位研究,可以为蚕种生产防控家蚕微粒子病提供参考依据。     

家蚕微孢子虫丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白serpin基因NbSPN106的鉴定

摘要：【目的】Serpin在病原与宿主互作中起着重要的作用。本研究旨在分析在家蚕微孢子虫中的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白（Serpin）的结构特征,原核克隆表达以及Western blotting检测。【方法】 基于家蚕微孢子虫全基因组序列,同源序列比对搜索获得serpin基因序列。利用在线软件分析基因的序列特征,ClustalX对氨基酸序列进行多重序列比对。构建含有GST标签的pGEX4T1-NbSPN106原核重组表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达并进行纯化。纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备抗体,并与家蚕微孢子虫总蛋白进行Western blotting免疫杂交。【结果】比对搜索在家蚕微孢子虫基因组中发现一个新的serpin基因NbSPN106。NbSPN106蛋白序列长度为384 aa,N端具有信号肽,编码一个42 kDa左右的成熟蛋白。多重序列比对说明NbSPN106具有保守的serpin位点,可能具有抑制功能。免疫杂交在家蚕微孢子虫总蛋白检测到一条45 kDa左右的特异条带。【讨论】生物信息学分析以及免疫杂交结果说明在家蚕微孢子虫中存在NbSPN106。这是在微孢子虫中首次报道发现serpin基因。对研究家蚕微孢子虫与宿主家蚕的互作具有一定的参考价值。     

家蚕微孢子虫ADP/ATP转运蛋白的原核表达及间接免疫荧光定位分析

【目的】家蚕微孢子虫Nosema bombycis ADP/ATP转运蛋白可能参与搬运宿主细胞的能量。本研究克隆家蚕微孢子虫ADP/ATP转运蛋白基因,并进行原核表达、抗体制备及间接免疫荧光定位,为控制和防治家蚕微粒子病提供理论基础。【方法】通过同源序列比对鉴定家蚕微孢子虫N. bombycis ADP/ATP转运蛋白序列,采用生物合成的方法将编码3段面向膜内侧肽段的核酸序列拼接合成,在其两端引入BglⅡ和SalⅠ酶切位点,克隆至pUC57载体并测序,再亚克隆至含有二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase,DHFR）标签的表达载体pQE40中,然后利用BamHⅠ和SalⅠ酶切获得含有DHFR标签的重组序列,并连接至pET30a（+）载体中进行诱导表达。通过SDS-PAGE、镍柱亲和层析和免疫印迹法鉴定表达蛋白,利用间接免疫荧光对ADP/ATP转运蛋白的分布进行检测。【结果】家蚕微孢子虫的ADP/ATP转运蛋白编码序列（GenBank登录号为EOB13854.1）全长1 524 bp,编码蛋白含有507个氨基酸残基,预测分子质量为59 kDa,等电点为9.35。具有12个跨膜结构域和TLC结构域,其中TLC结构域含有4个功能保守位点。与蜜蜂微孢子虫的ADP/ATP转运蛋白比较,氨基酸序列一致性达30%。系统进化分析表明微孢子虫ADP/ATP转运蛋白聚为一类,具有共同的起源。成功构建了NbADP/ATP-△TM-DHFR-pET30a原核表达重组质粒,目的基因获得表达,其融合蛋白分子量约为37 kDa,纯化重组蛋白并制备了多克隆抗体。免疫印迹分析表明,成熟微孢子虫中表达ADP/ATP转运蛋白;间接免疫荧光定位结果显示,家蚕微孢子虫孢子ADP/ATP转运蛋白定位于孢子质膜上。【结论】本研究将为阻断微孢子虫能量来源,达到控制和防治家蚕微粒子病提供新的思路。     

家蚕微孢子虫海藻糖酶3的表达、定位及功能

【目的】本研究旨在初步明确家蚕微孢子虫Nosema bombycis海藻糖酶3(NbTre3)的功能,为家蚕Bombyx mori微粒子病的防治提供理论依据和线索。【方法】通过PCR扩增NbTre3,构建原核表达载体pET28a-NbTre3;经IPTG诱导在大肠杆菌Escherichia coli中表达重组蛋白NbTre3,Western blot检测目的蛋白;Ni柱亲和层析法对重组蛋白NbTre3进行纯化,用获得的NbTre3免疫新西兰兔制备多克隆抗体;利用间接免疫荧光技术对成熟家蚕微孢子虫中的NbTre3进行定位;qRT-PCR检测家蚕微孢子虫感染家蚕5龄起蚕后不同时间中肠中NbTre3的转录水平;通过分别注射siRNA-1, siRNA-2和siRNA-3进行RNAi,qRT-PCR检测RNAi后不同时间感染家蚕微孢子虫的家蚕5龄起蚕中肠中NbTre3和16S rRNA的转录水平。【结果】成功纯化并获得重组目的蛋白NbTre3,大小约为34 kD。免疫新西兰兔后,收集血清,纯化获得NbTre3多克隆抗体,经Western blot鉴定正确。间接免疫荧光结果显示NbTre3主要分布在成熟家蚕微孢子虫孢原质中。qRT-PCR结果表明,家蚕微孢子虫感染后6 h时家蚕5龄起蚕中肠中NbTre3的表达量最高;siRNA抑制NbTre3的表达后,家蚕微孢子虫16S rRNA的转录水平没有明显的变化。【结论】结果提示NbTre3可能在家蚕微孢子虫感染初期的发芽过程中发挥重要的作用。     

家蚕微孢子虫与家蚕ECH1和GAPDH蛋白的相互作用

【目的】在分子层面上研究家蚕微孢子虫Nosema bombycis与家蚕Bombyx mori蛋白的相互作用,初步探讨家蚕微孢子虫向家蚕细胞能量中心靠近的原因。【方法】采用Far-western blot分析与家蚕微孢子虫具有相互作用的家蚕中肠蛋白,质谱鉴定筛选出候选蛋白。PCR扩增候选蛋白的基因,连接到p ET30a载体并转入大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞培养,测序选取正确的3个重组质粒,转化到大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中诱导表达候选蛋白,亲和层析柱纯化候选蛋白,制备多克隆抗体。用免疫共沉淀和间接免疫荧光技术验证候选蛋白与家蚕微孢子虫的相互作用。【结果】Far-western blot筛选到的anti-SWP9和anti-SWP5抗体与感染家蚕微孢子虫的家蚕中肠总蛋白的PVDF膜孵育,分别在26 k D和34 k D处检测到一条特异条带,说明家蚕微孢子虫与26 k D和34 k D的家蚕中肠蛋白发生了相互作用。对质谱鉴定结果进行蛋白质的分子量、肽段数以及功能的分析,筛选出与家蚕微孢子虫相互作用的候选家蚕蛋白烯酰辅酶A水合酶(ECH1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和3-羟酰辅酶A脱氢酶(HCDH)。利用制备的能够特异识别ECH1,GAPDH和HCDH 3种蛋白的多克隆抗体anti-ECH1,anti-GAPDH和anti-HCDH进行免疫共沉淀,证实了家蚕微孢子虫与家蚕中肠蛋白ECH1和GAPDH具有相互作用;间接免疫荧光分析结果进一步说明GAPDH能与家蚕微孢子虫特异性结合。【结论】家蚕微孢子虫可以和家蚕蛋白ECH1和GAPDH特异性结合。由于ECH1是定位于线粒体膜上的脂肪酸β-氧化的关键酶,GAPDH是糖酵解途径的关键酶,推测家蚕微孢子虫可能通过和家蚕ECH1和GAPDH的相互作用,在空间上靠近宿主细胞的线粒体和糖酵解途径,便于摄取宿主细胞脂肪酸β-氧化和糖酵解途径产生的中间产物和ATP,满足家蚕微孢子虫的物质和能量需求。     

两株不同地域的家蚕微孢子虫分离株的细胞侵染力 比较及遗传多样性分析

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是蚕业生产上一种毁灭性病害—— 微粒子病的病原体。文章将安徽和重庆两地域来源的病原性家蚕微孢子虫分离株进行草地贪夜蛾Sf9细胞感染性检测, 结果显示二者对细胞的侵染能力存在显著差异。为进一步探讨不同家蚕微孢子虫分离株的种群多态性, 进行了孢子虫核糖体DNA序列的测定和系统聚类比较, 结果表明SSU rDNA(Small subunit ribosomal DNA)和ITS(Internal transcribed spacer)在不同地域的种群差异性并不显著。通过检索重庆株全基因组数据及其他地域株rDNA序列, 显示在家蚕微孢子虫rDNA元件的部分SSU rDNA结构复制子中存在MITE-like转座元件的插入, 表明家蚕微孢子虫rDNA结构的多样性。     

家蚕微孢子虫感染对家蚕海龟蛋白(Bmtutl)基因表达水平的影响

【目的】本研究旨在阐明家蚕微孢子虫Nosema bombycis感染不同时间对家蚕Bombyx mori幼虫不同组织中家蚕海龟蛋白(Bombyx Turtle, Bmtutl)基因表达水平的影响,为揭示家蚕微孢子虫的侵染机制奠定基础。【方法】利用生物信息学方法对家蚕海龟蛋白3种亚型Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810的序列结构特征进行了分析;利用qPCR检测家蚕微孢子虫感染后12, 24, 48, 72, 96和120 h,家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810基因表达水平的变化情况。【结果】家蚕海龟蛋白3种亚型的二级结构均主要由无规则卷曲、α螺旋、β转角和延伸链组成,其中无规则卷曲所占比例最高。但是PredictProtein分析发现,Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810之间的蛋白/多核苷酸结合位点存在较大差异。qPCR结果表明,感染家蚕微孢子虫后,家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810基因的整体表达处于被抑制状态,尤其在脂肪体中最为明显：Bmtutl-519和Bmtutl-810基因的表达在家蚕微孢子虫感染家蚕后的72 h开始受到显著抑制,特别是Bmtutl-519基因,其相对表达水平均不到对照的5.0%。【结论】家蚕海龟蛋白这3种亚型的序列结构特征存在较大差异,家蚕微孢子虫感染在一定程度抑制了家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810基因尤其是Bmtutl-519的表达。结果说明,与其他两种家蚕海龟蛋白亚型相比,Bmtutl-519蛋白可能在家蚕微孢子虫侵染宿主的过程中起主要作用。     

东方蜜蜂微孢子虫孢子中微小RNA的鉴定与分析

【目的】丰富东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的微小RNA(microRNA, miRNA)信息,并为深入探究miRNA在病原孢子和病原侵染中的功能提供理论和实验依据。【方法】基于已获得的small RNA-seq数据,利用生物信息学软件对东方蜜蜂微孢子虫的纯净孢子中的miRNA进行鉴定和分析。采用茎环反转录PCR(stem-loop RT-PCR)检测已鉴定的miRNA的表达;通过分子克隆与Sanger测序验证miRNA的序列。使用TargetFinder软件预测这些miRNA的靶基因,并对靶基因进行数据库注释。根据miRNA与靶基因的靶向结合关系构建调控网络,再利用Cytoscape软件进行可视化。【结果】在东方蜜蜂微孢子虫孢子中共鉴定到10个miRNA;这些miRNA的长度分布介于21~25 nt,首位碱基表现出U偏向性,每一位碱基的偏向性差异明显。Stem-loop RT-PCR检测结果表明这10个miRNA均真实表达;Sanger测序结果证实了随机选取的其中2个miRNA的序列真实性。共预测出249个靶基因,其中分别有249, 118, 136和3个靶基因可注释到Nr,Swiss-Prot, KOG和eggNOG数据库。此外,分别有134和71个靶基因可分别注释到GO数据库的30个功能条目和KEGG数据库的54条通路。【结论】本研究揭示了东方蜜蜂微孢子虫孢子中miRNA的存在和表达;这些miRNA通过调控潜在靶基因的表达参与孢子的生命活动。     

家蚕LTR逆转录转座子的鉴定、分类及系统发育分析

转座子是真核生物基因组的重要组成成分。为了研究家蚕Bombyx mori长末端重复序列 (long terminal repeat, LTR)逆转录转座子的分类及进化, 本研究采用de novo预测和同源性搜索相结合的方法, 在家蚕基因组中共鉴定出了38个LTR逆转录转座子家族, 序列长度占整个基因组的0.64%, 远小于先前预测的11.8%, 其中有6个家族为本研究的新发现。38个家族中, 26个家族有表达序列标签 (expression sequence tag, EST)证据, 表明这些家族具有潜在的活性。对有EST证据的6个家族和没有EST证据的5个家族用RT-PCR进行了组织表达谱实验, 结果表明这11个家族在一些组织中有表达, 这进一步证实了这些家族具有转录活性, 基于此我们推测家蚕中大部分的LTR逆转录转座子家族很可能具有潜在活性。对转座子的插入时间进行估计, 结果表明绝大部分元件都是最近1百万年内插入到家蚕基因组中的。我们还比较了黑腹果蝇Drosophila melanogaster、 冈比亚按蚊Anopheles gambiae和家蚕B. mori中Ty3/Gypsy超家族分支的差异, 结果表明不同枝在不同昆虫中有着不同的扩张。家蚕中LTR逆转录转座子的鉴定和系统分析有助于我们理解逆转录转座子在昆虫进化中的作用。     

东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-10660及其靶基因表达谱

【目的】本研究旨在为探究nce-miR-10660调控东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染的作用机制提供理论和实验依据。【方法】采用Stem-loop RT-PCR对前期鉴定到的东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-10660进行表达验证，再通过Sanger测序验证nce-miR-10660的序列。利用相关生物信息学软件预测和分析nce-miR-10660的靶基因。通过RT-qPCR检测nce-miR-10660及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂过程中中肠中的表达谱。【结果】Stem-loop RT-PCR和Sanger测序结果分别证实了nce-miR-10660在东方蜜蜂微孢子虫孢子中的表达和真实存在。靶向预测结果显示nce-miR-10660共靶向RRDRP和RCDP 42等9个基因；分别有2和6个靶基因可被分别注释到KEGG数据库中的4条通路和GO数据库中的23个条目。RT-qPCR结果显示，相较于东方蜜蜂微孢子虫侵染后1 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中nce-miR-10660的表达量，东方蜜蜂微孢子虫侵染后2 d时意...     

微孢子虫核糖体小亚单位RNA（ssurRNA）基因

微孢子虫是广泛分布于自然界的细胞内原虫类寄生虫,它们可寄生于整个生物界。微孢子虫是真核生物,但其核糖体及核糖体RNA（rRNA）为原核生物型。为探讨9种家蚕病原性微孢子虫的种地位及亲缘关系,对已广泛用于生物进化分类的核糖体小亚单位RNA（ssurRNA)基因进行了研究。由微孢子虫ssurRNA基因序列同源笥分析所构建的系统进货发育树及Southern杂交分析表明,这9种微孢子虫同为Nosema属,为同属不同种。     

家蚕双重氧化酶BmDUOX的序列特征、表达模式及病原诱导表达

【目的】研究双重氧化酶(dual oxidase,DUOX)在家蚕Bombyx mori中的表达模式,探析其在家蚕肠道免疫机制中的作用。【方法】通过氨基酸多重序列比对和系统进化分析对Bm DUOX蛋白氨基酸序列特征进行研究,并采用RT-PCR方法扩增获得家蚕Bm DUOX膜外部分Bm DUOX_OM基因序列。在大肠杆菌Eescherichia coli(DE3)中诱导表达并通过亲和层析法纯化获得重组表达蛋白,以其为抗原免疫昆明鼠,获得对应的多克隆抗体;利用所得的抗体检测Bm DUOX的表达和细胞定位。通过半定量RT-PCR方法分析Bm DUOX在家蚕不同发育时期和组织中的表达模式及病原诱导表达谱。另外,利用活性氧检测试剂盒分析家蚕微孢子虫Nosema bombycis诱导后家蚕Bm E细胞的活性氧(ROS)的含量。【结果】生物信息学分析表明,Bm DUOX内有保守的Peroxidase,Ferric_reduct,EF-hand,FAD-binding和NAD-binding结构域,且具有6个跨膜区,跨膜形式与人类Homo sapiens、果蝇Drosophila melanogaster等的DUOX蛋白的跨膜形式一致。多重序列比对分析表明,Bm DUOX的过氧化酶区域内具有过氧化物酶的保守活性位点。克隆获得家蚕Bm DUOX_OM基因,并纯化获得重组表达蛋白,制备的鼠多抗具有较好的特异性。间接免疫荧光实验(IFA)表明,Bm DUOX位于家蚕Bm E细胞的细胞膜上。表达模式分析表明,Bm DUOX在家蚕5龄第3日幼虫和成虫中表达量较高;且在幼虫表皮、精巢、卵巢和头内高量表达,在成虫的卵巢、精巢、表皮和脂肪体内也有较高的表达量。病原诱导分析表明,通过肠道起始感染的家蚕微孢子虫能够诱导家蚕幼虫中肠Bm DUOX基因持续上调表达,且其诱导后的Bm E细胞内活性氧含量也明显增加,提示Bm DUOX调控的肠上皮ROS应答参与抵抗家蚕微孢子虫的侵染。【结论】Bm DUOX含有典型的结构域及保守的活性位点,表明其在家蚕中具有保守的生物学功能。Bm DUOX在家蚕不同发育时期、不同组织及病原诱导下的表达谱提示其可能参与宿主肠上皮对家蚕微孢子虫的免疫反应。     

柞蚕微孢子虫Nosema pernyi微管蛋白基因的克隆及系统发育分析

【目的】柞蚕微粒子病的病原为柞蚕微孢子虫Nosemapernyi,为解明柞蚕微孢子虫微管蛋白基因的序列信息,明确柞蚕微孢子虫的系统分类学地位。【方法】采用RT-.PCR、3′RACE(Rapid amplification ofcDNAends)等技术克隆得到了柞蚕微孢子虫的α、β和y-微管蛋白基因,并利用α、β-微管蛋白序列,分别采用NJ、ML法构建进化树。【结果】将克隆得到的基因序列提交NCBI(GenBank登录号:KF154086、KF023271、KF740389)。构建的系统发育树显示,微孢子虫类以一个独立群位于真菌群体中,与真菌的虫霉门关系较近,且与担子菌、球囊菌、壶菌、接合菌及部分子囊菌互为姐妹群。从部分微孢子虫的系统发育分析结果可以看出,20种微孢子虫分为2个分支,柞蚕微孢子虫与其他Nosema属聚为一类。【结论】本研究克隆得到了柞蚕微孢子虫α、β和y-微管蛋白基因,系统发育分析为更进一步了解柞蚕微孢子虫奠定了基础。     

东方蜜蜂微孢子虫N6-腺苷特异性甲基化转移酶基因的克隆、分子特性及表达模式北大核心

【目的】东方蜜蜂微孢子虫(Nosme ceranae)专性侵染成年蜜蜂导致微孢子虫病,给养蜂生产造成很大损失。目前,东方蜜蜂微孢子虫的N6-腺苷特异性甲基化转移酶(N6-adenine-specific methyltransferase,N6AMT)基因NcN6AMT的研究仍然缺失。本研究对NcN6AMT的编码序列(coding sequence,CDS)区进行克隆,并解析NcN6AMT蛋白的理化性质和分子特性,进而测定东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)和中华蜜蜂(Apis cerana cerana)工蜂过程中NcN6AMT的相对表达量,以期丰富NcN6AMT的信息,并为探究东方蜜蜂微孢子虫侵染过程NcN6AMT的功能及表观调控机制提供基础。【方法】采用Protparam和ProtScale软件对NcN6AMT进行等电点和亲水性分析。通过SignalP 5.0、NetPhos 3.1、TMHMM-2.0、SOPMA和SWISS-MODEL等软件分别预测NcN6AMT的信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域、二级结构和三级结构。使用WoLF PSORT II软件预测NcN6AMT的亚细胞定位。根据N6AMT氨基酸序列,通过TBtools软件对智人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、褐飞虱(Nilaparvata lugens)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)、肠脑炎微孢子虫(Encephalitozoon intestinalis ATCC 50506)、蚱蜢脑炎微孢子虫(Encephalitozoon romaleae SJ-2008)、美洲思普雷格孢虫(Spraguea lophii 42_110)、家蚕微孢子虫(Nosema bombycis CQ1)、隐生菱形藻(Nitzschia inconspicua)和东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)的N6AMT进行结构域预测和分析。利用MEME软件和MEGA 11.0软件进行东方蜜蜂微孢子虫和其他物种N6AMT的保守基序预测及进化树构建。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测NcN6AMT在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂和中华蜜蜂工蜂过程的相对表达量。【结果】通过PCR扩增出大小约500 bp的目的片段,克隆测序结果显示其与GenBank数据库收录的预测序列一致;NcN6AMT蛋白的分子量约为18.7 kDa,分子式为C845H1374N214O249S6,理论等电点为5.88,脂溶系数是119.76,不稳定系数为37.47,平均亲水系数为0.025,含166个氨基酸和15个磷酸化位点,不含典型的跨膜结构域和信号肽,可同时定位于细胞质、线粒体、细胞核和液泡膜;NcN6AMT含1个甲基转移酶小结构域(methyltransferase small domain,MTS),该结构域同样存在于家蚕微孢子虫和兔脑炎微孢子虫等8个其他物种的N6AMT;在东方蜜蜂微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、肠脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的N6AMT中均预测到5个相同的保守基序;NcN6AMT与家蚕微孢子虫、肠脑炎微孢子虫、兔脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的N6AMT序列一致性达到70.92%;东方蜜蜂微孢子虫和家蚕微孢子虫的N6AMT在系统进化树上聚为一支;东方蜜蜂微孢子虫接种后1–4 d,NcN6AMT在意大利蜜蜂和中华蜜蜂工蜂中肠内均呈现先上升后下降的表达趋势。【结论】成功克隆到NcN6AMT基因的CDS区,明确了NcN6AMT蛋白的理化性质和分子特性,并揭示东方蜜蜂微孢子虫和家蚕微孢子虫的N6AMT蛋白具有较高的保守性,NcN6AMT在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂和中华蜜蜂工蜂的第一个增殖周期(1–4 dpi)内动态表达且均呈上升-下降的表达模式。     

东方蜜蜂微孢子虫N6-腺苷特异性甲基化转移酶基因的克隆、分子特性及表达模式

【目的】东方蜜蜂微孢子虫(Nosme ceranae)专性侵染成年蜜蜂导致微孢子虫病,给养蜂生产造成很大损失。目前,东方蜜蜂微孢子虫的N6-腺苷特异性甲基化转移酶(N6-adenine-specific methyltransferase,N6AMT)基因NcN6AMT的研究仍然缺失。本研究对NcN6AMT的编码序列(coding sequence,CDS)区进行克隆,并解析NcN6AMT蛋白的理化性质和分子特性,进而测定东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)和中华蜜蜂(Apis cerana cerana)工蜂过程中NcN6AMT的相对表达量,以期丰富NcN6AMT的信息,并为探究东方蜜蜂微孢子虫侵染过程NcN6AMT的功能及表观调控机制提供基础。【方法】采用Protparam和ProtScale软件对NcN6AMT进行等电点和亲水性分析。通过SignalP 5.0、NetPhos 3.1、TMHMM-2.0、SOPMA和SWISS-MODEL等软件分别预测NcN6AMT的信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域、二级结构和三级结构。使用WoLF PSORT II软件预测NcN6AMT的亚细胞定位。根据N6AMT氨基酸序列,通过TBtools软件对智人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、褐飞虱(Nilaparvata lugens)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)、肠脑炎微孢子虫(Encephalitozoon intestinalis ATCC 50506)、蚱蜢脑炎微孢子虫(Encephalitozoon romaleae SJ-2008)、美洲思普雷格孢虫(Spraguea lophii 42_110)、家蚕微孢子虫(Nosema bombycis CQ1)、隐生菱形藻(Nitzschia inconspicua)和东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)的N6AMT进行结构域预测和分析。利用MEME软件和MEGA 11.0软件进行东方蜜蜂微孢子虫和其他物种N6AMT的保守基序预测及进化树构建。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测NcN6AMT在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂和中华蜜蜂工蜂过程的相对表达量。【结果】通过PCR扩增出大小约500 bp的目的片段,克隆测序结果显示其与GenBank数据库收录的预测序列一致;NcN6AMT蛋白的分子量约为18.7 kDa,分子式为C845H1374N214O249S6,理论等电点为5.88,脂溶系数是119.76,不稳定系数为37.47,平均亲水系数为0.025,含166个氨基酸和15个磷酸化位点,不含典型的跨膜结构域和信号肽,可同时定位于细胞质、线粒体、细胞核和液泡膜;NcN6AMT含1个甲基转移酶小结构域(methyltransferase small domain,MTS),该结构域同样存在于家蚕微孢子虫和兔脑炎微孢子虫等8个其他物种的N6AMT;在东方蜜蜂微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、肠脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的N6AMT中均预测到5个相同的保守基序;NcN6AMT与家蚕微孢子虫、肠脑炎微孢子虫、兔脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的N6AMT序列一致性达到70.92%;东方蜜蜂微孢子虫和家蚕微孢子虫的N6AMT在系统进化树上聚为一支;东方蜜蜂微孢子虫接种后1–4 d,NcN6AMT在意大利蜜蜂和中华蜜蜂工蜂中肠内均呈现先上升后下降的表达趋势。【结论】成功克隆到NcN6AMT基因的CDS区,明确了NcN6AMT蛋白的理化性质和分子特性,并揭示东方蜜蜂微孢子虫和家蚕微孢子虫的N6AMT蛋白具有较高的保守性,NcN6AMT在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂和中华蜜蜂工蜂的第一个增殖周期(1–4 dpi)内动态表达且均呈上升-下降的表达模式。     

进境熊蜂风险分析

【目的】对进境熊蜂所带来的病虫害、生物入侵等一系列风险进行分析,为制定相应的检疫措施提供科学依据。【方法】本文根据新西兰风险分析模型,从传入释放的可能性、定殖和扩散的可能性以及对经济和生态的潜在危害性3个方面对进境熊蜂进行风险分析。【结果】熊蜂孢子虫Apicystis bombi、熊蜂短膜虫Crithidia bombi、熊蜂微孢子虫Nosema bombi、布赫纳蝗螨Locustacurus buchneri、寄生蜂Melittobia acasta和蜂巢小甲虫Aethina tumida 6种病虫害能给国内熊蜂带来较高的风险,同时引进非本地种熊蜂也可能带来生物入侵问题。【结论】进境熊蜂能带来一定的风险,需要制定相应的风险管理措施。     

东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中nce-miR-34537和靶基因PIP5KI的表达谱

【目的】本研究旨在对前期鉴定到的nce-miR-34537进行表达和序列验证,预测nce-miR-34537的靶基因并明确其分子特性,进而检测nce-miR-34537及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂过程的表达谱,为进一步探究nce-miR-34537调控东方蜜蜂微孢子虫侵染的功能和作用机制提供基础。【方法】通过Stem-loop-RT-PCR和Sanger测序验证nce-miR-34537的表达和序列。通过生物信息学软件预测nce-miR-34537的靶基因PIP5KI(I型磷脂酰肌醇4-磷酸-5-激酶基因)的理化性质等分子特性和保守基序,并构建基于氨基酸序列的系统进化树。采用RT-qPCR检测nce-miR-34537及其靶基因的表达谱。【结果】nce-miR-34537在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在和表达。nce-miR-34537共靶向PIP5KI等151个基因。PIP5KI蛋白的分子式为C₈₈₂H_{1 364}N₂₂₆     

进境熊蜂风险分析

【目的】对进境熊蜂所带来的病虫害、生物入侵等一系列风险进行分析,为制定相应的检疫措施提供科学依据。【方法】本文根据新西兰风险分析模型,从传入释放的可能性、定殖和扩散的可能性以及对经济和生态的潜在危害性3个方面对进境熊蜂进行风险分析。【结果】熊蜂孢子虫Apicystis bombi、熊蜂短膜虫Crithidia bombi、熊蜂微孢子虫Nosema bombi、布赫纳蝗螨Locustacurus buchneri、寄生蜂Melittobia acasta和蜂巢小甲虫Aethina tumida 6种病虫害能给国内熊蜂带来较高的风险,同时引进非本地种熊蜂也可能带来生物入侵问题。【结论】进境熊蜂能带来一定的风险,需要制定相应的风险管理措施。