昆虫质型多角体病毒同义密码子使用模式分析

昆虫质型多角体病毒(cypovirus,CPV)是害虫种群重要调节因子,可用作生物防治剂。本研究采用多元统计分析方法对7种CPV进行密码子使用模式分析,结果表明:CPV密码子使用偏好性较弱,多数基因密码子使用模式受碱基组成影响,少数基因密码子使用模式除碱基组成外还有其它影响因素;中性绘图分析表明碱基组成主要受选择压力影响,受突变影响较小。同一电泳型CPV之间比同一宿主CPV之间共有的偏好性密码子多。CPV基因组内10个基因组片段之间密码子偏好性存在差异。CPV密码子偏好性与宿主昆虫密码子偏好性存在差异,所有CPV与其宿主昆虫共有的偏好性密码子均较少。对应分析进一步证明碱基组成是影响密码子使用的主要因素,不同电泳型CPV具有不同的密码子使用模式。聚类分析表明同一电泳型CPV密码子使用模式相似,同一宿主CPV密码子使用模式差异较大。     

柞蚕感染微孢子虫后血淋巴免疫应答蛋白质的分离与鉴定

了解柞蚕Antheraea pernyi感染微孢子虫初期血淋巴内免疫系统及刺激应答相关蛋白质种类, 本研究以柞蚕5龄雌幼虫的起蚕（结束4眠, 刚完成蜕皮的幼虫）添食柞蚕微孢子虫Nosema pernyi为材料, 对感染后血淋巴利用SDS-PAGE进行分离后, 利用LC-MS/MS质谱技术和蛋白质组学分析对差异蛋白质条带进行鉴定。结果显示： 感染微孢子虫144 h后, 血淋巴中分子量约为44 kD （AP44）和28 kD （AP28）的蛋白质条带表达量增高。质谱分析AP28和AP44蛋白质条带样品, 共鉴定117个不重复蛋白质, 其中2个样品共有蛋白质12个, AP28独有蛋白质52个, AP44独有蛋白质53个。对质谱数据利用COG数据库进行搜寻鉴定, 显示AP28和AP44的鉴定蛋白质中涉及柞蚕免疫系统及刺激应答生物过程的蛋白质共有29个, 其中AP28中包括热激蛋白、 泛素样蛋白、 泛素结合酶E2、 保幼激素环氧水解酶、 微管结合蛋白、 溶菌酶、 ADP-核糖基化因子、 防御蛋白、 肽聚糖识别蛋白等15个, AP44中包括DRK、 酚氧化酶原、 类免疫球蛋白等10个; 二者共有热激蛋白hsp21.4、 酚氧化酶原、 抗菌肽等4个。本研究结果可以为今后研究柞蚕对微孢子虫的免疫应答及防御机制提供参考。     

柞蚕微粒子病潜在生物标志物的挖掘

【目的】挖掘柞蚕Antheraea pernyi微粒子病的潜在生物标志物,为开发该病害检测方法及研究柞蚕被微孢子虫Nosema pernyi侵染后体内代谢产物的差异及功能奠定基础。【方法】利用高效液相色谱和高分辨率质谱进行非靶向代谢组学分析,调查健康和患微粒子病柞蚕雌成虫血淋巴中代谢物差异。【结果】正离子模式下从健康和患微粒子病柞蚕雌成虫血淋巴中共获得8 870个代谢物,注释代谢物5 390个,筛选到差异表达代谢物472个(上调260个,下调212个),其中二级鉴定差异表达代谢物12个(上调8个,下调4个);负离子模式下获得6 716个代谢物,注释代谢物3 848个,筛选到差异表达代谢物301个(上调207个,下调94个),其中二级鉴定差异表达代谢物9个(上调8个,下调1个)。正离子模式下二级鉴定的差异表达代谢物包括缬氨酸(valine)、苯并噻唑(benzothiazole)、3-脱羟基肉碱(3-dehydroxycarnitine)、1 甲基鸟嘌呤(1-methylguanine)、2-乙氧基萘(2-ethoxynaphthalene)、N6-乙酰基-L-赖氨酸(N6-acetyl-L-lysine)、生物素(biotin)、桑色素(morin)、噻吗洛尔(timolol)、酰基肉碱15∶0(acylcarnitine 15∶0)、酰基肉碱18∶4(acylcarnitine 18∶4)和异槲皮苷(isoquercitrin);负离子模式下二级鉴定的差异表达代谢物包括二甲基丙二酸(dimethylmalonic acid)、戊二酸(glutaric acid)、2,5-二羟基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid)、1,3-二乙酰基丙烷(1,3-diacetylpropane)、3-(4-羟基苯基)乳酸(DL-p-hydroxyphenyllactic acid)、泛酸(pantothenate)、荧光素(fluorescein)、飞燕草素-3-O-beta-吡喃葡萄糖苷(delphinidin-3-O-beta-glucopyranoside)和溶血磷酯酰肌醇16∶1 (lysoPI 16∶1)。【结论】健康与患柞蚕微粒子病的柞蚕雌成虫血淋巴内代谢物具有显著差异,通过代谢组学挖掘出21个二级鉴定的差异表达代谢物,这些代谢物可作为潜在生物标志物用于开发柞蚕微粒子病的检测方法。     

栎黄掌舟蛾幼虫肠道好氧菌群分析及产纤维素酶菌的筛选

栎黄掌舟蛾Phalera assimilis是柞树主要叶部害虫之一。本研究以栎黄掌舟蛾幼虫为材料,从幼虫肠道中分离出好氧细菌23株,通过对16S r DNA扩增产物ARDRA分析后,代表性菌株测序结果表明,23株肠道好氧细菌分别属于葡萄球菌属Staphylococcus sp.、短小杆菌属Curtobacterium sp.、赖氨酸芽孢杆菌属Lysinibacillus sp.、肠球菌属Enterococcus sp.和阿特拉津降解菌属Arthrobacter sp.5个属的细菌,其中,以葡萄球菌属及短小杆菌属细菌种类最多。通过筛选培养基从23株菌中筛选出产纤维素酶菌6株。本研究可为深入了解栎黄掌舟蛾肠道菌群结构、寻找产纤维素酶菌及新的微生物资源等奠定了理论基础。     

柞蚕微孢子虫孢子分离纯化方法

柞蚕微粒子病是柞蚕Antheraea pernyi(Guérin-Méneville)的主要胚胎传染性病害,病原为柞蚕微孢子虫Nosema pernyi(Wenet Ding),其病原分离提纯技术研究对于柞蚕微粒子病的防治具有重要意义。本文利用差速离心和Percoll密度梯度离心法研究了柞蚕微孢子虫孢子的分离纯化方法,结果表明,采用不连续密度梯度分离纯化柞蚕微孢子虫孢子的效果比单一浓度的效果好,以浓度为25%、50%、75%、100%不连续梯度,15000r/min离心30min分离纯化得到的柞蚕微孢子虫孢子纯净度高。     

柞蚕微孢子虫Nosema pernyi微管蛋白基因的克隆及系统发育分析

【目的】柞蚕微粒子病的病原为柞蚕微孢子虫Nosemapernyi,为解明柞蚕微孢子虫微管蛋白基因的序列信息,明确柞蚕微孢子虫的系统分类学地位。【方法】采用RT-.PCR、3′RACE(Rapid amplification ofcDNAends)等技术克隆得到了柞蚕微孢子虫的α、β和y-微管蛋白基因,并利用α、β-微管蛋白序列,分别采用NJ、ML法构建进化树。【结果】将克隆得到的基因序列提交NCBI(GenBank登录号:KF154086、KF023271、KF740389)。构建的系统发育树显示,微孢子虫类以一个独立群位于真菌群体中,与真菌的虫霉门关系较近,且与担子菌、球囊菌、壶菌、接合菌及部分子囊菌互为姐妹群。从部分微孢子虫的系统发育分析结果可以看出,20种微孢子虫分为2个分支,柞蚕微孢子虫与其他Nosema属聚为一类。【结论】本研究克隆得到了柞蚕微孢子虫α、β和y-微管蛋白基因,系统发育分析为更进一步了解柞蚕微孢子虫奠定了基础。     

柞蚕蛹解除滞育过程中海藻糖合成酶基因的表达变化

【目的】克隆柞蚕Antheraea pernyi海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)基因,并对其进行组织表达分析,探讨该基因在柞蚕滞育蛹解除滞育过程中的表达规律,为阐明柞蚕滞育期间碳水化合物代谢规律与蛹滞育解除的关系提供数据支持。【方法】利用PCR及3'RACE技术从柞蚕幼虫脂肪体组织中克隆得到TPS基因,并进行生物信息学分析;RT-PCR检测该基因在柞蚕幼虫各组织中的表达分布,进一步采用Real-time PCR分析柞蚕滞育蛹解除滞育过程中该基因在脂肪体组织和血淋巴中的表达量变化。【结果】克隆获得柞蚕海藻糖合成酶基因并命名为ApTPS。其开放阅读框长2 487 bp,编码828个氨基酸,蛋白预测分子量为93.19 k D,等电点(p I)4.61;无信号肽,无跨膜区。蛋白质亚细胞定位预测该蛋白定位于细胞质中;蛋白质结构域分析表明,ApTPS有两个保守功能区:TPS(第22-497位氨基酸)和TPP(第532-772位氨基酸)。组织特异性分析表明,ApTPS基因在柞蚕幼虫脂肪体中表达量最高;柞蚕解除滞育过程中,ApTPS在脂肪体和血淋巴中的表达量均有所升高,且显著高于对照组(P0.05),但血淋巴中表达量的升高滞后于脂肪体。【结论】结果提示ApTPS参与了柞蚕蛹滞育中碳水化合物代谢调控并在其中发挥重要作用,与柞蚕蛹滞育解除关系密切。     

柞蚕蛹滞育和滞育解除过程中海藻糖酶基因表达模式及酶活力分析

【目的】克隆柞蚕Antheraea pernyi海藻糖酶(trehalase,Treh)基因,探讨该基因在柞蚕蛹滞育和滞育解除过程中的表达模式与海藻糖酶活力变化,为阐明柞蚕蛹滞育期间糖代谢机制提供参考。【方法】利用RT-PCR技术从柞蚕蛹中克隆获得海藻糖酶基因,并对其进行生物信息学分析。采用半定量RT-PCR检测长光照(17L∶7D)处理后的滞育解除柞蚕蛹与对照滞育蛹不同组织中该基因的表达谱;采用实时定量PCR(qPCR)分析其在长光照下滞育解除过程中柞蚕蛹脂肪体中的相对表达量变化。利用3,5-二硝基水杨酸法检测脂肪体中海藻糖酶活力的变化,同时采用蒽酮比色法测定其血淋巴中海藻糖含量。【结果】克隆获得柞蚕3个海藻糖酶基因,分别命名为ApTreh1A,ApTreh1B和ApTreh2(GenBank登录号分别为:KU977455,KU977456和KU977457),开放阅读框(ORF)全长分别为1 797,1 635和1 932 bp,分别编码598,544和643个氨基酸。同源序列比对与系统进化树分析表明,ApTreh1A和ApTreh1B为可溶型海藻糖酶(Treh S),ApTreh2为膜结合型海藻糖酶(Treh M)。半定量RT-PCR检测发现,各组织中ApTreh2比ApTreh1的分布更广且表达量更高。qPCR检测发现,ApTreh1A和ApTreh1B在长光照处理后的柞蚕蛹脂肪体中,21 d时表达量都表现出快速升高[分别是对照组(12L∶12D)的2倍和4.7倍],28 d与35 d时下降,42 d时表达量再次升高;ApTreh2随着滞育的解除表达量逐渐升高,28 d时达到最高(约为对照组的2.7倍),42 d时又出现一个小高峰(约2.3倍),后期逐渐下降。长光照下脂肪体中海藻糖酶活力逐渐升高,21 d时达到最高(约18.5 U),35 d时降到最低(约11.2 U),42 d时其酶活力再次略微升高,之后呈下降趋势,与基因表达变化趋势一致。蛹血淋巴中海藻糖含量在长光照条件下呈现出升高趋势,21 d时达到最高,在整个发育时期的含量比对照组要高。【结论】本研究结果表明柞蚕蛹滞育解除过程中海藻糖酶基因表达的变化与蛹脂肪体中海藻糖酶活性、蛹血淋巴中海藻糖含量的变化趋势呈一致性,提示海藻糖酶基因的表达响应在柞蚕蛹滞育解除中发挥重要作用。     

柞蚕RR-1亚族表皮蛋白基因ApCP12与ApCP23的表达特征与功能分析

【目的】表皮蛋白(cuticular proteins,CPs)种类丰富,在昆虫生长发育中起着重要作用。本研究旨在丰富柞蚕Antheraea pernyi体内所含表皮蛋白的类型,探讨不同发育阶段表皮蛋白基因的表达规律。【方法】利用PCR及3'RACE技术从柞蚕幼虫表皮组织中克隆得到两个表皮蛋白基因,并进行生物信息学分析及系统进化分析;半定量RT-PCR检测该基因在柞蚕胚胎发育期的表达规律及在幼虫各组织中的表达分布;实时荧光定量PCR(qPCR)分析该基因在柞蚕不同发育时期及3龄幼虫RNAi后的表达量变化。【结果】克隆获得两个柞蚕表皮蛋白基因并分别命名为ApCP12和ApCP23,GenBank登录号分别为MF318874和MF318875。生物信息学分析表明,ApCP12基因长度为690 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)长336 bp,编码111个氨基酸,推测得到的蛋白质分子量为12 kD;ApCP23长度为1 243 bp,ORF长度为594 bp,编码197个氨基酸,相对分子质量为23 kD。两种蛋白都具有RR-1亚族的保守基序,与RR-2亚族表皮蛋白聚类分析位于不同分支。组织特异性表明,ApCP12基因在柞蚕幼虫各组织中的分布比ApCP23更为广泛。柞蚕不同发育时期中,ApCP12在胚胎发育期表达量逐渐升高;幼虫眠起3 d内相对于眠期,ApCP12的表达量最高增加了约3倍,而ApCP23的表达量增加了13倍;蛹黑化时期,ApCP12的表达量高于ApCP23;羽化前期,基因的表达量无明显变化,直至羽化前1 d,ApCP12和ApCP23的表达量相对于注射蜕皮激素第1天分别增加了3.5和3倍。RNAi处理后,3龄幼虫体内ApCP12的表达量下降了5倍,ApCP23的表达量降低了3倍。【结论】结果提示,RR-1亚族的这两种柞蚕表皮蛋白参与了柞蚕不同发育阶段幼虫表皮、蛹皮、成虫表皮的构建,与柞蚕生长发育的整个生命周期关系密切。