固氮螺菌氢代谢与固氮作用的关系I.固氮螺菌放氢现象与吸氢能力的研究

本文研究了固氮螺菌(Azosptrillum brastlense)的放氢现象和吸氢酶活性以及与固氮作用的关系。测定了57株固氮螺菌的放氢现象及其固氮酶活性,其中不放氢41株,微放氢14株,其放氢量为2·63—31.00n mol C2H4／ml菌液·小时。放氢量较多的2株R38{和R256A都是从水稻根表上分离获得,其放氢量分别为185.75n mol H2／ml 菌液·小时和547．00 moIH2／ml 菌液·小时。测定了53株螺菌的吸氢酶活性,它们均具有吸氢能力,其吸氢量各异,0-63-27·38n mol H2／ml菌液。小时。生长在含有NH4CI培养基上的固氮螺菌既没有固氮能力,也不产氢。在无氮培养基上所产生的氢是固氮过程中放出的氢。实验结果指出,C2H2抑制氢酶的活性。当吸氢的菌株与放氢菌株混合培养时,其固氮酶活性比单株纯培养高,有氢存在时,固氮酶活性比不加氢时高。     

固氮蓝藻干藻种制备及其在稻田中的应用效果

固氮鱼腥藻“水生1042”在室内培养条件下的对数生长期为5天,在此期间栗制的藻种复苏能力最强,固氮活性也高,通过复苏培养4天的蓝藻固氮力为 217．7n mol C2H4／mg于藻／小 时。     

土壤杆菌固氮生理特性研究

对根癌土壤杆菌C58/pGV3850菌株的固氮生理特性研究结果表明,该菌具有自生固氮活性,其固氮活性的最适pH为8.0,温度为30℃.固氮活性在对数生长后期(14h)最高,延缓期和静止期乙炔还原活性较低.该菌株好氧,通过氧呼吸和吸氢酶的作用达到避氧固氮.当通入氧气超过呼吸耗氧时,对固氮活性产生抑制作用.在培养过程中增加NH_4~+浓度,固氮活性会降低,当达到15mmol/L时完全丧失固氮活性,表现NH_4~+阻遏固氮酶蛋白合成.在乙炔还原测定系统中加入NH_4~+并不影响乙炔还原反应,说明没有NH_4~+关闭现象.培养过程中加入MSX(2.5mg/ml)能解除10mmol/L NH_4~+对固氮酶合成的阻遏作用.固定的游离氮不能以NH_4~+形式分泌于胞外.固氮过程中放出大量氢气,培养16小时产氢量达65μmol H_2/mg蛋白.在限碳条件下(0.2%蔗糖)其吸氢酶活力可达520nmol H_2·ml~(-1)·h~(-1).     

固氮螺菌耐高铵突变株的选育

应用亚硝基脏(N-nitrosoguanidine,NTG)诱变剂对固氮螺菌菌株Ma241、Ma99、Sp7和G14进行诱变处理后,在掭加了铵的类似物乙撑二胺(ethyleae diamina)的D6bcreiner无氯培养基中进行筛选．反复纯化,获得了在4 5 n、M NH}浓度以上,保持固氯酶活性的耐铵突变株共9株。突变株22的耐铵固氮酶活性最强,在75mM NH+4浓度下,固氮酶活性达到464n mol乙烯／mg蛋白·小时,在200m M NH+4浓度下,固氯酶话性仍有32nmol/mg蛋白·小时。     

稻根联合固氮细菌的研究II．粪产碱菌A-15和阴沟肠杆菌E-26的固氮特性

用乙炔还原法、总氮测定法和15N同位素示踪法证实了从水稻根分离的两株固氮菌,粪产碱菌(Alcaligenes faecalis) A-15和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) E-26,具有较强的固氮 能力。A一15是徽好氧固氮菌,利用苹果酸、乳酸、琥珀酸等有机酸作为碳源,在无氮的半固体培养基中生长和固氮良好,乙炔还原活性可达500—700毫克分子C2H·／毫升培养物／小时。E一26是兼性厌氧菌,只有在严格厌氧条件下才有较明显而又稳定的固氮能力。在无氮的蔗糖培养基中,乙炔还原活性为200一如0毫克分子ctH·／毫升培养物川、时,当A一15和E一26混合培养时,两菌表现出协同的固氮作用,周氮量剧增,乙炔还原活性可提高至1000一1500毫克分子 C2H4／毫升培养物／小时。     

在限定的培养基中马铃薯汁对根瘤菌乙炔还原的影响

在基本培养基中加适量的马铃薯汁,振荡培养根瘤菌330菌株,固氮酶比话性为111．6nmol C2H4／mg蛋白／h。而对照毫无活性。比较了几种细胞密度和气相氧浓度,发现加马铃薯汁能使反应系统内的气相氧浓度,在一 定时间内保持在l％左右。在这种氧浓度范围内,固氮酶活性激增。不加马铃薯汁的对照,因不能保持这种气相氧浓度,故无活性。对马铃薯汁所起的可能作用进行了讨论。     

沙棘弗兰克氏菌的生物学特性研究

从辽宁省西部的沙棘(Hippophae rhamnoides L.)根瘤中分离到8株内生菌,它们都具有Frankia菌的典型形态特征。 回接鉴定表明,8株菌均可使寄主结瘤。各菌株的侵染能力不同;回接培养液的种类是影响侵染力的重要因素。分离于两个不同地区的菌株Frankia sp.Hr16和Hr32在GyA培养基上的培养特征有一定差异。实验菌株可利用多种碳源,其中丙酮酸盐是理想碳源。在以丙酮酸盐为唯一碳源,浓度为10mjlf的Bap培养基中,Hrl6菌株的对数期倍增时间可降至知小时,菌体在两周内达到最大生长量o Hrl6菌株的自生固氮活性亦受碳源的影响,在以5mM的丙酮酸盐的无氮Bap培养基中,其话性为176.5nmol. C2H4／mg蛋白/小时。     

固氮螺菌CWV-22突变株与玉米、小麦联合体的固氮作用

应用乙炔还原法和同位素15N示踪技术证明固氮螺菌CWV-22是具有耐高铵、泌铵能力的突变株。它在含有50mM NH+4浓度的纯培养固氮试验中,吸收”N量为135μg／mg蛋白,不接种的对照吸收“N量为零,接种Sp7的只有1／~g]mg蛋白,在测试允许误差之内,证明Sp7的固氮作用是不耐铵的。在密闭培育装置中,用15N示踪植物试验：1．种植玉米或小麦,接种不耐铵的。P7或耐铵的CWV一22菌株,不论在有或无NH,Ac的条件下,植物吸收的生物固定”N量均远远高于不接种细菌的对照植物,达4．5—9．0倍;2．接种耐铵CWV一22菌株不受NH(Ac存在的抑制,接种不耐铵sp7菌株则受到显著的抑制,但仍有一定的固氮作用,并将固定的”N输送到植物根、茎、叶里。经检测,在有NH．Ac条件下,根际砂中含nil+量降低到l--2mM(远离根际的砂中含N时为29．1raM),低于对。P7菌株的抑制浓度,可能是。P7仍有固氮活性。     

巴西固氮螺菌Yu62nifA基因克隆、测序及功能分析

用TD-PCR法克隆了巴西固氮螺菌(Azospirillun brasilense)Yu62的nifA基因.序列分析表明它与巴西固氮螺菌Sp7的nifA序列高度同源(96.5%),其编码的产物NifA蛋白与Sp7菌株NifA的氨基酸序列同源性为97.6%.该基因可以完全互补巴西固氮螺菌Sp7 nifA-突变株的Nif-表型.研究了NH4+和O2对Yu62 nifA基因的表达及NifA活性的影响.结果表明mfA基因在Yu62菌株中是部分组成型表达的,氨和氧不能完全阻遏其表达,在5mmol/LNH4Cl与微氧(0.5%O2)条件下表达最高;NifA蛋白在0.4%～0.5%O2时活性最高,氧分压降低和提高都使NifA活性下降,1mmol/L NH4Cl足以抑制NifA的活性.     

巴西固氮螺菌Yu62 nifA基因克隆、测序及功能分析

用TD－PCR法克隆了巴西固氮螺菌（Azospirillun brasilense)Yu62和nifA基因。序列分析表明它与巴西固氮螺菌Sp7的nifA序列高度同源（96．5％）,其编码的产物NifA蛋白与Sp7菌株NifA的氨基酸序列同源性为97．6％。该基因可以完全互补巴西固氮螺菌Sp7 nifA^-突变株的Nif^-表型。研究了NH4^ 和O2对Yu62 nifA基因的表达及NifA活性的影响。结果表明：nifA基因在Yu62菌株中是部分组成型表达的,氨和氧不能完全阻遏其表达,在5mmol/LNH4Cl4与微氧（0.5%O2)条件下表达最高;NifA蛋白在0.4%-0.5%O2时活性最高,氧分压降低和提高都使NifA活性下降,1mmol/L NH4Cl足以抑制NifA的活性。     

铵培养的粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）中固氮酶的生物合成

粪产碱菌A—15的氮素同化途径在铵培养下以GDH途径为主,而氮培养下则以GS/GOGAT途径为主,DEAE—纤维素层析,SDS—PAGE及免疫学试验均证明,粪产碱菌在铵浓度高达30mmol/L时仍有固氮酶合成,但没有固氮活性。铵和氮培养两者细菌粗提液在电泳条带上有些差异。铵培养的粪产碱菌合成的固氮酶,在解阻遏后,仍可出现固氮活性。     

攀枝花苏铁(Cycas panzhihuaensis)的根瘤和固氮作用

 分布在南亚热带金沙江干热河谷的攀枝花苏铁,普遍受蓝细菌侵染形成特殊的多级分枝珊瑚状根瘤簇。当年生树苗活瘤重可达8克／株,100年生370克／株。固氮活性在秋季一般为1.8—11.1μmol C2H4／g·f·w·h-1,它明显受光照和湿度影响,昼夜动态是白天活性明显比夜间高。苏铁固氮量从0.64—18.69毫克／株·小时,它在生态系统的氮循环中起良好作用。     

温度,含水量和光照对发菜固氮酶活性的影响

陆生蓝藻发菜(Nostoc flagelliforme)固氮酶活性的最适温度为21—28℃;最适藻丝体含水量为1000—1500%;最大饱和光强达150—200焦耳/m~2·秒。在湿润状态下,发菜对较高的温度很敏感。在45℃下1小时,发菜固氮酶失掉活性。在干燥状态下,发菜在55℃高温下,每天5小时,放置21天后,其固氮酶活性保持不变。预先培养4—5天的湿发菜对干燥变得敏感;但在干湿交替循环中,其固氮酶活性逐步提高,并明显地改善了它对干燥的抵抗能力。此外,在高盐浓度下(0.17—0.43mol/LNaCl)发菜的固氮酶活性被强烈地抑制,说明它不能耐盐碱。发菜的固氮生理特性是它对荒漠草原生态条件适应的结果。干湿交替循环或许是发菜维持生存的必需条件。     

高活性纤维素酶菌株778-1的筛选鉴定与产酶条件的研究

我们从湖南省隆回县河岸土中分离筛选到产生高活性纤维素酶的野生菌株778-1,其酶活性比优良的木霉野生菌株高一倍[1,2],并对秸杆类天然纤维素有较强的降解作用。此菌株按《青霉鉴定手册》[3]鉴定属于散枝亚组微紫青霉系(P．Janthinellum series)鱼肝油青霉(P．Piscarium wcstling)和微紫青霉(P. janthinellum biourge)的中间类型。最适培养基成分为：苞米秸粉(1号)10g,营养盐溶液(NaNO,1.5％,(NH4)：SO4 0．8％,KH2PO4 0．2％,MgSO47H2O 0．05％)30ml。pH5-5—6．0,25—30℃培养96小时。在此条件下该酶分解滤纸、CMC、棉花的活性分别为200—220 mg／g.h、4000一4200mg／g．H 580--650mg／g．H。在上述 培养基中加入0．2—0．6g豆饼粉酶活性可以进一步提高。     

耐氨固氮型催娩克氏菌的某些生理特性

耐氨固氮型催娩克氏菌（KlebsiellaoxytocaNG13／pMC73A）的生长特性与其野生型亲本菌株相似。在好气和微好气环境中均能生长,对生长所需的碳源、氮源和无机盐类要求不严格。最适pH值为6—9,其生长温度范围较宽,10℃开始生长,最适生长温度30－35℃,45℃才受到抑制。具有比野生型菌株强的固氮能力,在含有10mM硫酸铵的培养基中能正常固氮,乙炔还原活性可达636．5nmolC2H4／ml·h,而野生型菌株在相同培养基中无固氮能力。     

携带Paenibacillus polymyxa WLY78固氮基因簇(nif)的重组大肠杆菌Escherichia coli 78-7转录组分析（英文）

【目的】来自Paenibacillus polymyxa WLY78的固氮基因簇(nifBHDKEf NXhesAnifV)可以转化入Escherichia coli中表达并使重组大肠杆菌合成有固氮活性的固氮酶。本文拟通过对重组大肠杆菌E.coli78-7的转录组分析以提高其固氮能力。【方法】对固氮条件(无氧无NH+4)和非固氮条件(空气和100 mmol/L NH_4~+)培养的重组大肠杆菌E.coli 78-7进行转录组分析。【结果】nif基因在两种培养条件下显著表达,说明在重组大肠杆菌中可规避原菌中氧气和NH_4~+对nif基因的负调控。对于固氮过程必需的非nif基因,如参与钼、硫、铁元素转运的mod、cys和feoAB,这些基因在两种培养条件下表达水平有差异。而参与铁硫簇合成的suf和isc基因簇在两条件下表达水平差异巨大。此外,参与氮代谢的基因在固氮条件下显著上调。【结论】重组大肠杆菌中与固氮相关的非nif基因在该菌的固氮过程中具有较大影响,本文对在异源宿主中调高固氮酶活性研究具有重要意义。     

钨酸盐去阻遏的棕色固氮菌提取液中无机钼酸对固氮酶的活化

钨酸盐中培养并去阻遏的棕色固氮菌(W-Av)只有极微弱的固氮酶活性(0.3～0.5 nmole C_2H_4/分/毫克W-Av蛋白)。当以部分纯化的钼铁蛋白补入W-Av的提取液中,后者的固氮酶活性能够上百倍地提高。当有适量保险粉及ATP和ATP发生系统存在时,W-Av提取液与钼酸钠在30℃下保温,固氮酶得到活化。在本实验的最适条件下,固氮酶的活性可达5～8nmole C_2H_4/分/毫克W-Av蛋白或25～40n mole C_2H_4/分/n mole Mo。就固氮酶的活化来说,W-Av提取液是比较稳定的,在-15℃下冻存可维持二十天以上,60℃加热5分钟,总活性约降低一半。W-Av提取液与钼酸钠保温后在-15℃下保存四天,已活化的固氮酶活性也只比对照略为降低。钨酸盐抑制固氮酶的活化,但不抑制已活化的固氮酶活性。     

不同水分条件下坚韧胶衣固氮活性对冻融的响应

坚韧胶衣Collema tenax是干旱和半干旱生态系统中生物土壤结皮的重要组分,其固氮作用对生态系统氮素循环具有重要影响。该地衣生长于温度和水分条件变化剧烈的土壤表面,但在我国北方其固氮活性对冻融的响应尚不清楚。采用乙炔还原法研究了坚韧胶衣固氮活性在不同水分条件下(湿冻组:地衣体含水量200%干重;干冻组:地衣体含水量20%干重)和4次冻融处理之间的差异。坚韧胶衣固氮活性为2,371.0-8,701.8nmolC2H4/m2·h,湿冻组固氮活性低于干冻组,对照组固氮活性最高,湿冻组和干冻组的固氮活性(对照的百分比)均与冻融次数呈显著的线性负相关关系(干冻组:R2=0.916,p0.001;湿冻组:R2=0.965,p0.001),但湿冻组的斜率绝对值(25.05)明显高于干冻组斜率绝对值(7.60)。结果表明低温对坚韧胶衣固氮活性具有显著抑制作用,干燥条件下坚韧胶衣固氮活性对于低温胁迫的敏感性比地衣体湿润条件下更低,这种较低的敏感性可能是该地衣对我国北方干燥和冷热变化剧烈的气候特点的生理适应策略。     

马铃薯培养基中的根瘤菌自生固氮活性

以20％马铃薯提取液为主,加88毫克分子阿拉伯糖(或蔗糖、或葡糖酸盐)、2.5或25毫克分子琥珀酸钠以及0.7％琼脂,配成简易的马铃薯培养基。豇豆根瘤菌(Rhizobium sp·)330S、330V和32H1三个菌株,以及大豆根瘤菌(Rhizobium japonicum)C_8和B_(15)二个菌株纯培养在此培养基上,均具有自生固氮活性。 气相氧的浓度在0.75～2％时,根瘤菌的固氮活性最高。氧浓度超过10％时,活性显著被抑制。当根瘤菌的固氮酶活性已表达后,加入10％氧,2小时后活性就降低,44小时后随着气相氧浓度的下降,固氮活性又有所恢复。在加入不同碳源的马铃薯培养基中,根瘤菌固氮活性的水平因不同菌株而有差异。培养基中加入适当浓度的琥珀酸钠,根瘤菌固氮活性显著提高。培养基的pH在6.4～7.0范围内,豇豆根瘤菌的固氮活性较高,pH低于5.4或高于8.0时,都没有活性。预培养17天的豇豆根瘤菌仍有一定的固氮活性,但以5～7天的活性最高。分析马铃薯不同提取部分对根瘤菌生长和固氮活性的影响时,表明水溶部分比脂溶部分的效果好。     

XTT四唑鎓盐试验快速检测卡介苗活性

卡介苗生产中最重要的质检指标—活菌含量测定 ,传统固体培养计数方法时间需 2 1天以上 ,且结果有时不稳定、操作复杂。使用XTT[2 ,3 bis (2 methoxy 4 nitro 5 sulphenyl) (2H) tetrazolium 5 carboxanilide]做底物的四唑钅翁盐试验在活卡介菌的还原下快速显色 ,很好地反映出卡介苗活菌的浓度差异。实验观察在微孔培养板中反应经酶标仪测定的XTT试验非常简便易行 ,不受死亡细菌的影响 ,不受培养基的影响 ,实验重复性非常好 ,检测活性单位时间惊人地缩短为 2 4小时左右 ,检测活性范围大。此方法有潜力代替传统活菌计数法用于卡介苗生产中的活性单位测定。