沉默ABCE1对神经胶质瘤细胞U251增殖、迁移和凋亡的影响

ABCE1是ATP结合盒蛋白亚家族成员之一,在病毒感染,细胞增殖,抗凋亡,翻译起始和核糖体生物发生等过程中有重要的作用。为了探讨ABCE1对神经胶质瘤细胞U251增殖、迁移和凋亡的作用,本研究通过实时荧光定量PCR和免疫印迹实验检测ABCE1在神经胶质瘤细胞和正常胶质细胞中的mRNA和蛋白质表达水平,结果发现ABCE1在神经胶质瘤细胞U251中的表达高于在正常胶质细胞中的表达。利用siRNA靶向沉默ABCE1后,神经胶质瘤细胞U251中ABCE1 mRNA和蛋白的表达水平均显著减少,细胞的凋亡率显著提高,细胞增殖和迁移明显受到抑制,而且细胞对化疗药物替莫唑胺的敏感性增强。此外,沉默ABCE1后,Bcl-2的mRNA和蛋白质表达水平显著下调,而Bax的mRNA和蛋白质表达水平显著上调。以上研究结果表明,ABCE1与神经胶质瘤细胞的增殖和迁移密切相关,通过siRNA靶向沉默ABCE1基因可显著降低U251细胞的增殖和迁移能力。     

EphA2对神经胶质瘤细胞系U251的凋亡﹑增殖﹑迁移和侵袭的研究

为了研究EphA2对神经胶质瘤细胞系U251在增殖、凋亡、迁移和侵袭方面所起的作用,用RT-PCR方法检测正常脑组织标本与两种恶性胶质瘤细胞系中EphA2 mRNA表达水平,然后用化学合成的针对EphA2基因的小干扰RNA(siRNA)下调该基因的表达,以检测其在U251中的生物学功能．证实了EphA2基因在正常脑组织标本中的表达水平远低于两种恶性胶质瘤细胞系．把体外化学合成针对EphA2基因的小干扰RNA(siRNA- EphA2)转染入U251细胞后,Western blot, 实时定量 RT-PCR检测到U251细胞中EphA2蛋白及mRNA表达水平都明显降低,并且细胞增殖受到显著抑制,同时出现了明显的细胞凋亡．伤口愈合实验(检测细胞迁移能力),Transwell小室实验(检测细胞侵袭能力)均表明,下调EphA2的表达后,细胞的迁移和侵袭能力较阴性对照组显著减弱．上述结果表明,在神经胶质瘤U251细胞中,EphA2与其恶性增殖及高度侵染性相关,可作为分子治疗的有效靶点．     

miR-195通过下调IGF-1R的表达抑制胶质母细胞瘤的增殖和迁移

目的:探讨miR-195对胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)增殖和迁移的影响,并阐明其分子调控机制。方法:采用qRT-PCR检测不同级别胶质瘤中miR-195的表达。将miR-195转染至胶质瘤U251细胞后,应用qRT-PCR验证转染效率,MTT及划痕实验检测U251细胞的增殖及迁移能力的改变,qRT-PCR及Western blot检测胰岛素样生长因子1受体(Insulin-like growth factor 1receptor, IGF-1R)的mRNA和蛋白表达;利用质粒转染过表达miR-195后,同时过表达IGF-1R,再应用MTT及划痕实验检测U251细胞的增殖及迁移能力的变化。结果:随着胶质瘤级别的增加,miR-195的表达逐渐降低,各级别胶质瘤中miR-195的表达差异有统计学意义(P0.05)。体外转染miR-195至U251细胞24、48、72 h后,转染组细胞活力和迁移能力均较对照组显著降低(P0.05),细胞中IGF-1R的mRNA和蛋白的表达也明显减少(P0.05);通过转染IGF-1R过表达质粒可显著逆转miR-195过表达对U251细胞增殖及迁移的抑制作用。结论:miR-195可能通过下调IGF-1R的表达,进而抑制胶质母细胞瘤的增殖和迁移。     

TGIF2调控胶质瘤细胞的增殖和迁移

目的探讨TGIF2在胶质瘤中的表达及其对A172胶质瘤细胞增殖和迁移的影响。方法原位杂交技术检测TGIF2 mRNA在小鼠胚胎不同时间点脊髓中的表达;用GSE16011数据库和中国人临床样本检测TGIF2在胶质瘤样本和非癌脑组织中的表达水平;利用shRNA技术下调A172胶质瘤细胞TGIF2的表达后,分别通过CCK-8分析、划痕试验、凋亡蛋白检测研究TGIF2对胶质瘤细胞增殖、迁移和凋亡的影响。结果原位杂交显示,TGIF2 mRNA特异性表达在小鼠E11.5和E13.5脊髓的室管膜区域;TGIF2 mRNA在胶质瘤样本中的表达显著高于非癌脑组织;沉默TGIF-2的表达能显著抑制A172细胞的增殖和迁移能力,促进细胞凋亡。结论 TGIF2mRNA在胶质瘤中高表达;TGIF2可以增强细胞的增殖和迁移能力,抑制细胞凋亡,可能是脑癌诊疗的一个潜在的靶点基因。     

siRNA沉默SIRT1基因对宫颈癌细胞HeLa增殖和凋亡的影响

化学合成靶向SIRT1基因的小干扰RNA,脂质体法转染人宫颈癌细胞株HeLa,观察小干扰RNA沉默SIRT1基因对HeLa增殖及细胞凋亡的影响。在优化siRNA SIRT1转染条件的基础上,应用RT-PCR和Western blot分别检测各组SIRT1 mRNA、SIRT1蛋白及凋亡相关蛋白的表达;CCK-8法检测细胞增殖抑制率;Hoechst荧光染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果表明,siRNA SIRT1转染细胞组SIRT1 mRNA水平和蛋白表达量明显低于对照组;siRNA SIRT1转染组细胞增殖受抑制,细胞凋亡率明显增加;凋亡相关蛋白P53、P21表达上调,Survivin表达下调。上述结果表明:siRNA SIRT1诱导的HeLa细胞凋亡与P53、P21、Survivin通路关系密切,但siRNA SIRT1诱导HeLa细胞凋亡的详尽机制有待进一步研究。     

BST-2参与HCMV感染诱导的恶性胶质瘤细胞增殖和迁移

为探讨BST-2蛋白是否参与人巨细胞病毒(HCMV)感染导致的恶性胶质瘤细胞增殖和迁移,以HCMV AD169株感染U251细胞,通过细胞划痕愈合实验检测HCMV感染对U251迁移的影响;通过Western-blot方法检测HCMV感染对BST-2蛋白表达的影响;通过CCK-8、细胞划痕愈合和transwell方法检测HCMV感染后下调BST-2对U251细胞增殖和迁移能力的影响。结果显示,HCMV感染可促进U251细胞迁移并高表达BST-2,沉默BST-2后可抑制由HCMV感染诱导的细胞增殖和迁移。结果证实HCMV感染可促进胶质瘤细胞U251增殖迁移,BST-2参与了HCMV感染导致的恶性胶质瘤细胞增殖和迁移。     

ADAM17调控Hippo信号转导通路对人脑胶质瘤细胞增殖和迁移的影响

为探讨去整合素-金属蛋白酶17(disintegrin and metalloproteinase 17,ADAM17)对人胶质瘤细胞增殖和迁移的影响及其调控机制,该研究用ADAM17 sh RNA质粒转染ADAM17高表达的胶质瘤细胞U87MG、U251MG,用过表达ADAM17载体转染ADAM17低表达细胞SW1783,q-PCR和Western blot检测ADAM17表达水平的变化,同时检测ADAM17和Hippo信号通路中相关蛋白质表达水平,CCK-8法分析细胞增殖能力并绘制生长曲线,划痕实验检测细胞迁移率。结果表明,下调ADAM17后,U87MG、U251MG细胞增殖和迁移能力减弱,而Hippo信号通路中MST2、p-MOB1、p-YAP蛋白表达水平升高;上调ADAM17后,SW1783细胞增殖和迁移能力增强,而MST2、p-MOB1、p-YAP蛋白表达水平降低。结果说明,ADAM17在脑胶质瘤细胞的增殖和迁移中发挥了重要作用,这可能是通过抑制Hippo信号通路来实现的,MST2被抑制,p-MOB1水平降低,从而YAP的磷酸化水平也降低,促进了胶质瘤细胞的增殖和迁移。     

芳姜黄酮对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞迁移、侵袭及凋亡的影响和机制研究

为研究芳姜黄酮(Ar-Turmerone)对人鳞状细胞癌A431细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及机制。实验采用CCK-8法检测抑制率,吉姆萨染色观察细胞形态,划痕实验和Transwell小室实验研究细胞迁移和侵袭能力的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率。此外,通过实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)与蛋白质印迹法(western blot)法检测mRNA和蛋白表达。siRNA阻断Notch1,Hes1和PTEN,检测相应的下游mRNA和蛋白的表达变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果发现,芳姜黄酮可以抑制A431细胞增殖,使细胞形态发生改变,抑制细胞体外迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。经过芳姜黄酮处理后,Notch1,Hes1,PTEN的mRNA和蛋白表达升高。沉默Notch1,Hes1 mRNA和蛋白表达低于单纯给药组,而沉默Hes1,PTEN mRNA和蛋白表达也低于单纯给药组;沉默PTEN后,与单纯给药组相比,细胞死亡率降低。总之,芳姜黄酮可以抑制人鳞状细胞癌A431细胞的增殖并促进其凋亡,且具有抑制体外迁移和侵袭的作用,其促进细胞凋亡的机制是通过Notch1/Hes1/PTEN途径实现的。     

HSV-1感染对神经胶质瘤细胞神经生长因子及其受体表达的影响

神经生长因子(NGF)主要由神经胶质细胞产生,通过特异的靶细胞表面的神经生长因子受体介导产生生物学效应,与神经细胞的生长发育、分化和凋亡等密切相关。单纯疱疹病毒1型(HSV-1)作为一种嗜神经病毒,易造成神经细胞、神经胶质细胞凋亡或死亡。本实验以U251人神经胶质瘤细胞为研究对象,观察HSV-1感染致U251细胞凋亡的过程中NGF及其受体的变化情况。结果发现U251细胞是HSV-1的容许细胞;HSV-1感染致U251细胞凋亡过程中,NGF及其低亲和力受体p75NTR出现表达强度随时间先增强后减弱的趋势,而高亲和受体Tr-kA持续低表达。推测HSV-1感染致神经细胞凋亡中可能调控了神经营养因子的表达。     

siRNA干涉PIM-3表达对胶质瘤细胞增殖和糖代谢的影响

目的:利用小干扰RNA(siRNA)在胶质瘤细胞干涉PIM-3的表达,观察细胞增殖能力和代谢的变化,并探讨相关机制。方法:转染PIM-3 siRNA入胶质瘤细胞U87-MG和U251,利用MTT实验和平板克隆实验检测细胞增殖能力的变化,利用流式细胞仪测定细胞糖摄取能力,并通过Western印迹检测葡萄糖转运蛋白GLUT1的表达变化。结果:利用siRNA干涉了PIM-3在胶质瘤细胞中的表达;PIM-3表达降低后,细胞增殖能力下降,葡萄糖摄取能力减弱,GLUT1蛋白表达降低。结论:PIM-3对胶质瘤细胞的增殖和代谢重编程具有调控作用,并主要通过影响细胞的糖代谢来实现。     

HCMV感染对恶性胶质瘤U87细胞增殖及ATF5表达的影响

人巨细胞病毒(HCMV)能够诱导肿瘤细胞的恶性转化,但其分子机制尚有待进一步探索。探讨HCMV是否通过调控转录激活因子5(ATF5)的表达变化促进胶质瘤细胞的增殖。采用HCMV AD169株(MOI=5)感染神经胶质瘤U87细胞株,MTT方法观察HCMV感染0、12、24、48 h后细胞的增殖活性。Real-time PCR及Western-blot检测HCMV感染U87细胞后ATF5基因及蛋白的表达水平变化。以慢病毒为载体的靶向ATF5小干扰RNA构建载体,敲低ATF5表达水平后感染HCMV,MTT检测病毒感染细胞的增殖活性变化。HCMV感染神经胶质瘤U87细胞后,与未感染组比较,增值活性明显升高(P0.05),ATF5表达水平上升,表明HCMV感染使胶质瘤细胞增殖活性提高,细胞抗凋亡能力增强。成功构建沉默ATF5细胞系siATF5 U87,HCMV感染siATF5 U87细胞后使细胞增殖活性减弱,抗凋亡能力下降。以上实验结果表明,HCMV感染上调胶质瘤U87细胞ATF5的表达水平,促进细胞的增殖。因此HCMV感染可能通过调控ATF5信号通路增加细胞恶性性状,为治疗胶质瘤提供一个新的思路。     

LncRNA MYU对胶质瘤细胞周期分布、增殖、转移和凋亡以及PI3K/Akt信号通路的影响

摘要 目的：探讨长链非编码RNA（LncRNA）MYU对胶质瘤细胞周期分布、细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响,并初步探讨其作用机制。方法：实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测人脑正常胶质细胞HEB和胶质瘤细胞（U-251MG、A172、SHG139）中LncRNA MYU的表达情况。选取SHG139细胞,分为正常对照（NC）组、si-con组、si-LncRNA MYU组进行转染实验,行RT-qPCR检测转染效果。分别采用流式细胞术、细胞计数试剂盒（CCK-8）、Transwell实验检测沉默LncRNA MYU对SHG139细胞周期分布和凋亡、细胞增殖、细胞迁移和侵袭的影响。蛋白免疫印迹（Western blot）法检测基质金属蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved caspase-3）、Cleaved caspase-9以及磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路相关蛋白表达情况。结果：LncRNA MYU在胶质瘤细胞株中比人脑正常胶质细胞中的表达水平显著升高（P＜0.05）,因此选择表达量最高的SHG139细胞进行转染实验。沉默LncRNA MYU能够显著诱导SHG139细胞G0-G1期阻滞、抑制细胞增殖、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡（P＜0.05）。沉默LncRNA MYU可显著抑制MMP-2、MMP-9、p-PI3K和p-AKT表达并促进Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9表达（P＜0.05）。结论：沉默LncRNA MYU可诱导胶质瘤细胞G0-G1期阻滞,抑制细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,其机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。     

ADAR1 shRNA对人胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究ADAR1 shRNA对人胶质瘤细胞U87细胞增殖和凋亡的影响。方法:通过构建ADAR1-shRNA的干扰质粒,经脂质体法转染胶质瘤U87细胞系,通过荧光倒置显微镜观察转染效率,选择转染效率最高的细胞系。取转染48h细胞,采用RT-PCR和Western-blot分别检测ADAR1 mRNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测其细胞凋亡率,MTT法检测细胞增殖情况。结果:①经ADAR1-shRNA转染48h后的转染效率最高,此时U87细胞系中ADAR1 mRNA及蛋白的表达均被显著抑制,较阴性对照组及空白组均明显降低(P0.05)。②在转染ADAR1-shRNA后,细胞凋亡率为(28.14%±3.76%),明显高于阴性对照组(3.20%±1.57%)和空白组(2.80%±1.49%),细胞增殖率较阴性对照组及空白组明显下降(P0.05)。结论:通过shRNA抑制ADAR1的表达能明显促进人胶质瘤细胞U87细胞的凋亡和抑制其增殖,ADAR1基因可能成为治疗治疗胶质瘤的新靶点。     

泛素偶联酶2C促进肺癌细胞增殖和迁移与抑制细胞衰老

泛素偶联酶2C与多种肿瘤细胞的增殖密切相关,但其与肺癌发生和发展的关系尚不明确。 本研究以肺癌A549细胞为材料,通过RT-PCR、Western印迹、免疫荧光、SA-β-Gal细胞衰老染色、细胞划痕和Trans-well实验,阐明UBE2C与肺癌细胞的增殖、衰老和迁移能力的关系。结果显示,UBE2C在肺癌细胞中的表达明显高于正常细胞。利用基因修饰技术瞬时过表达或靶向沉默UBE2C后,在肺癌A549细胞中,UBE2C的mRNA和蛋白质水平显著增加3.5倍或减少0.5倍,显著促进或抑制细胞增殖,进而减少或增加细胞的凋亡率。过表达UBE2C后,显著抑制细胞衰老;但沉默UBE2C后,则增加细胞衰老。此外,过表达UBE2C后,下调转移相关基因E-钙黏着蛋白的mRNA和蛋白质表达水平,且上调波形蛋白基因的表达水平,进而促进肺癌细胞的迁移。但靶向敲除UBE2C后,上调E-钙黏着蛋白,同时下调波形蛋白表达水平,进而抑制肺癌细胞的迁移。本研究的开展将明确UBE2C在肺癌中的作用及其机制,为以UBE2C为靶点,提高病人生存期提供了理论基础。     

沉默FBI-1基因对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响

本研究旨在观察短发夹状RNA (short hairpin RNA, shRNA)介导的人类免疫缺陷病毒短转录诱导物连接因子1 (FBI-1)基因沉默对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响。用qRT-PCR和Western blot分别检测FBI-1、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3和Survivin的mRNA和/或蛋白的表达水平;采用shRNA干扰技术沉默MDA-MB-231细胞中FBI-1基因的表达;用CCK-8法以及克隆形成实验检测细胞增殖;用流式细胞术检测细胞凋亡;用裸鼠皮下成瘤实验检测细胞的成瘤能力。结果显示,MDA-MB-231细胞的FBI-1 mRNA和蛋白的表达水平明显高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A;经shRNA靶向沉默FBI-1基因表达后,细胞增殖能力明显降低,细胞凋亡率显著增高,伴随Bcl-2和Survivin蛋白表达明显下调、Bax蛋白表达显著上调和Caspase 3活化,MDA-MB-231细胞的裸鼠皮下成瘤能力受抑制。以上结果提示,靶向沉默FBI-1基因表达可以抑制MDA-MB-231细胞增殖,诱导细胞凋亡并抑制细胞的裸鼠皮下成瘤能力。     

siRNA介导的NFBD1表达沉默对HeLa细胞增殖与凋亡的影响

NFBD1,也称MDC1,是1个参与细胞内DNA损伤后细胞应答反应的重要分子．为探讨NFBD1在细胞增殖和凋亡中的作用及其作为分子靶点用于肿瘤治疗的潜在价值,本研究采用siRNA技术抑制NFBD1的表达,并观察了其对人宫颈癌细胞HeLa细胞增殖和细胞凋亡的影响．半定量RT-PCR和蛋白质印迹分析结果表明,筛选到的短链NFBD1 siRNA能有效抑制内源NFBD1的表达,抑制程度约100％．细胞生长曲线分析结果表明,siRNA介导的NFBD1表达沉默导致HeLa细胞生长增殖的显著抑制．FACS分析结果表明,NFBD1表达抑制导致sub-G₁峰的出现,同时蛋白质印迹分析观察到了caspase 3和PARP（poly-ADP-ribose polymerase）的剪接激活,表明NFBD1表达抑制诱发了细胞凋亡．在该凋亡过程中,P-53及其下游靶分子Bax和Puma的表达水平均没有发生明显变化,但Noxa的表达在mRNA和蛋白质水平上均显著上调,强烈提示该凋亡过程很可能是1个不依赖P53的凋亡途径,且Noxa的转录激活在该凋亡过程中可能起着重要作用．这些结果表明,NFBD1参与细胞生长增殖和凋亡的调节,是一个潜在的肿瘤治疗新靶点．     

靶向survivin的siRNA对胃癌BGC-823细胞增殖的影响

目的探讨干扰RNA沉默生存素（survivin）基因表达对人胃癌BGC-823细胞增殖和凋亡的影响。方法设计并合成3条靶向survivin的小分子干扰RNA（siRNA）,构建表达性干扰RNA质粒（shRNA）——shRNA-survivin-1、shRNA-survivin-2和shRNA-survivin-3,分别转染胃癌BGC-823细胞,实时定量PCR检测干扰RNA沉默survivin mRNA表达效果,Westernblot观察对胃癌BGC-823细胞survivin蛋白质表达的抑制,MTT（四甲基偶氮唑盐）比色法分析检测细胞生长抑制率,流式细胞计数检测各组细胞周期和凋亡率,探讨干扰RNA对胃癌BGC-823细胞生长的影响。结果在体外,shRNA-survivin-1有效沉默人胃癌BGC-823细胞survivin mRNA的表达,使sur-vivin mRNA相对水平明显降低（P〈0.05）,survivin蛋白质表达抑制,72h细胞生长抑制率达74.92%（P〈0.05）,shRNA-survivin-1使G2/M期细胞百分比明显增加,凋亡率显著增加（P〈0.05）。结论 shRNA-survivin-1可以沉默survivin基因的表达,可以显著抑制胃癌BGC-823细胞的增殖,在一定程度上诱导其自发凋亡。本研究为靶向sur-vivin的RNA干扰在胃癌的基因治疗提供了有力的理论依据和技术储备。     

沉默NHE1抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭能力

钠氢交换蛋白1(sodium hydrogen exchange protein,NHE1)是调控细胞内酸碱平衡的膜蛋白。本研究旨在探究NHE1蛋白的表达对胶质母细胞瘤细胞迁移和侵袭影响。首先采用Matrigel-transwell侵袭实验比较胶质母细胞瘤U87和U251的侵袭能力,并分别分选出两细胞株强、弱亚群;采用反转录-实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)检测U87和U251细胞以及两细胞株强、弱亚群中NHE1 m RNA水平;然后采用靶向NHE1 m RNA的si RNA(si-NHE1)和si RNA阴性对照(si-NC)分别转染U87细胞,RT-q PCR法和蛋白质免疫印迹实验检测两组中NHE1 m RNA和蛋白水平;Transwell实验检测两组细胞的迁移和侵袭能力。结果显示U87细胞的侵袭能力强于U251细胞,NHE1 m RNA在U87细胞表达量是U251细胞中的50.08倍,NHE1 m RNA在两种细胞株的强侵袭性亚群中的表达量分别是弱侵袭性亚群的19.8倍和62.3倍,差异均具有统计学意义(p0.05)。转染si-NHE1可有效降低U87细胞内NHE1的m RNA和蛋白水平。迁移实验中si-NHE1组和si-NC组细胞穿过8μm微孔滤膜数目分别是(188.33±16.04)和(138.00±9.54);侵袭实验中两组细胞穿过数目分别是(207.33±16.56)和(119.67±9.61),两实验数据差异均具有统计学意义(p0.05)。以上研究表明,NHE1在胶质母细胞瘤中的表达呈异质性,其表达水平与胶质母细胞瘤细胞的侵袭能力能正相关。沉默NHE1可显著抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭能力。本研究为解析胶质母细胞瘤的侵袭性生长的特性和临床治疗胶质母细胞瘤提供了新的思路。     

紫草素对人脑胶质瘤U251 细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察紫草素对体外培养的人脑胶质瘤U251细胞的增殖和凋亡的影响。方法:应用MTT法和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术分别检测2.5、5、10μM/L的紫草素对U251细胞的体外抑杀作用以及凋亡诱导作用,进一步应用Western blot方法检测紫草素对凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax表达水平的影响。结果:紫草素对人U251胶质瘤细胞具有明显的增殖抑制作用,且呈一定的剂量依赖性和时间依赖性。紫草素可明显上调U251细胞Bax的表达,下调Bcl-2的表达,与对照组相比存在显著性差异(P0.05)。结论:紫草素对人胶质瘤U251细胞具有明显的抑制增殖和促进凋亡作用。