碳酸酐酶与临床医学

碳酸酐酶是一类含锌的蛋白酶,共发现了10种同工酶及三种碳酸酐酶相关蛋白,广布于人体各组织,能可逆性地催化C02的水合反应,参与调节pH、离子运输等多种生理过程,碳酸酐酶的缺乏和异常将可能会导致一系列的疾病。     

碳酸酐酶靶向性抑制剂甲苯磺烷唑胺对机体缺氧耐力的影响

目的:探讨甲苯磺烷唑胺对提高小鼠缺氧耐力的影响及其机制.方法:将健康昆明小鼠放入缺氧装置瓶中,测定密闭缺氧存活时间;将雄性昆明小鼠放入梯形笼中,置于小动物低压舱进行减压低氧,测定小鼠减压低氧存活时间;观察小鼠组织碳酸酐酶Ⅱ(CAⅡ)活性改变.采用预防给药方式,研究碳酸酐酶靶向性抑制剂甲苯磺烷唑胺对提高低氧耐力的作用.结...     

从天然提取物或分离部位中以碳酸酐酶II为靶点的抗骨质疏松活性筛选

目的是以碳酸酐酶Ⅱ(CAⅡ)为靶点筛选其抑制剂,以期寻找抗骨质疏松活性样品。实验是在96孔酶标板上对来源于178个科、608个属、1020种动植物2919个提取物或分离部位样品在CA-Ⅱ模型上进行了批量筛选。结果表明在10μg/ml浓度下发现了来源于40个科、61个属、72个种的100个样品有活性,其中5个样品的IC50小于2．50μg/ml,22个样品的IC50在2．51—5．00μg/ml范围,73个样品的IC50在5．01—10．00μg/ml范围。通过以上工作我们认为以碳酸酐酶Ⅱ为分子靶点的体外筛选方法稳定、方便、快速、微量、有效,特别适用于天然产物的抗骨质疏松活性筛选。     

碳酸酐酶的生物学研究进展

碳酸酐酶（ＣＡ）是一组参与体内酸碱平衡调节及离子交换等过程的含锌金属酶。迄今至少发现８种同工酶,各同工酶的催化活性、生理功能及其对抑制剂的敏感性有明显差异。其中ＣＡⅡ、Ⅳ分布广泛,功能多元化。ＣＡⅡ的生物学结构研究表明,Ｈ９４、Ｈ９６、Ｔ１９９、Ｈ６４、Ｌ１９８等是酶催化活性的主要氨基酸残基,其中１９８位残基还与酶和抑制剂的亲和力、酶在催化ＣＯ２水化反应中的ｐＨ依赖性有关。此外,类固醇及某些表面活     

内皮素-1通过L-型钙通道的Ca^2＋内流和钙致钙释放诱导心肌细胞内[Ca^2＋]的增加

本研究利用fura-2-AM荧光成像和膜片钳技术,发现内皮素-1（Endothelin-1,ET-1）可显著提高大鼠分离心肌细胞内钙离子水平（[Ca^2＋]i）,激活心肌细胞钙通道．ETA受体阻滞剂BQ123能够消除ET-1提高[Ca^2＋]i的效应,而ETB受体阻滞剂BQ788对该效应无影响,用ryanodine受体阻断剂ryanodine（10μmol／L）预处理,可以使ET-1诱导的[Ca^2＋]i的增加抑制46.7％,蛋白激酶A（PKA）的抑制剂、蛋白激酶C（PKC）的抑制剂和血管紧张素Ⅱ-型受体（ATI receptor）的抑制剂都能够抑制ET-1诱导的[Ca^2＋]i的增加,本研究发现ET-1能够提高全细胞L-型钙通道电流的幅度,增加L-型钙通道单通道的开放概率．并且BQ123完全阻止了ET-1诱导的L-型钙通道开放概率增加的效应．本研究证明了ET-1通过一系列机制调节钙超载,包括L-型钙通道的激活,钙致钙释放（CICR）,ETA受体,PKC,PKA和血管紧张素Ⅱ-型受体也参与到了这个途径中。     

大鼠睾丸镉毒性相关蛋白质组学研究

镉是对动物与人的生殖系统均具有毒性的环境污染物。为深入系统地探讨镉毒性机制,应用二维电泳与质谱联用技术对镉暴露大鼠睾丸组织蛋白表达谱进行了差异分析。实验结果表明,碳酸酐酶Ⅰ和Ⅱ、肉碱棕榈酰转移酶Ⅱ、电压依赖阴离子通道2、二氢硫辛酰胺脱氢酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂3、类似CREM转录调控元件激活因子等蛋白质与镉毒性相关,其中与能量代谢有关的蛋白质被镉诱导后显示表达下调。维生素C对镉毒性有明显的缓解作用。     

碳酸酐酶在红细胞分化发育过程中的功能研究

目前红系分化调控相关的研究主要集中在细胞因子、转录因子、lncRNA及表观遗传方面,为了对红系分化调控机制进行更加深入的解析,研究了碳酸酐酶在红系分化中的功能。碳酸酐酶可以高效催化二氧化碳的水合,但它在红细胞发育过程中的功能尚不清楚。利用脐带血来源的CD34⁺细胞在体外进行红细胞诱导分化,在分化过程中通过慢病毒介导的基因敲降的方法能够降低碳酸酐酶1和碳酸酐酶2的表达,并使用流式细胞仪检测红细胞的生成和分化效率。研究结果表明,与对照组相比,碳酸酐酶1的表达缺陷使红细胞的晚期分化明显受阻,而碳酸酐酶2的表达缺陷则将红细胞的分化阻滞在早期阶段。研究结果表明,虽然作用窗口不同,但碳酸酐酶1和碳酸酐酶2在红系分化的过程中均发挥着重要的调控作用,这一发现对将来在体外红细胞生成具有指导意义。     

蚯蚓体内一组脱氧核糖核酸酶的酶学性质研究

目的：研究一组新型蚯蚓脱氧核糖核酸酶（earthworm Desoxyribonucleases, EWDs）的主要生化性质。方法：采用SDS-PAGE电泳、MALDI-TOF、酶活性测定等方法。结果：确定了EWD1、EWD2、EWD3(总称为：EWDs)的分子量分别为157.2kDa、69.1kDa和63.5kDa;Km值分别为1.58mg/ml、3.95mg/ml、1.52mg/ml。EWDs在55℃时,酶活性完全丧失。这三种脱氧核糖核酸酶最适pH范围在pH4.0～5.6之间。Mn2＋、Ca2＋是蚯蚓组织脱氧核糖核酸酶EWD1、EWD2、EWD3的抑制剂,Mg2＋对EWD3有较明显的抑制作用。结论：蚯蚓中的EWDs分子量明显大于DNaseⅠ和DNaseⅡ。对EWDs的温度、pH值、激动剂、抑制剂等影响因素的研究,发现这些参数与已发现的DNases相比较有明显差别。这些提示：蚯蚓组织中发现的脱氧核糖核酸酶EWDs具有特殊的酶学特征,不同于DNaseⅠ和DNaseⅡ,是种新型的脱氧核糖核酸酶,但其作用机理和分类有待于进一步的研究和归类。     

嗜热蓝细菌碳酸酐酶基因的异源表达及酶学性质

【背景】碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CAH)因其高效催化CO2转化为HCO3–的能力成为当今碳减排工艺中的研究热点,但因工厂烟道气的温度较高,因此寻求热稳定性高的嗜热碳酸酐酶是碳酸酐酶仿生学固碳的关键所在。【目的】克隆嗜热蓝细菌Thermosynechococcuselongatus PKUAC-SCTE542和SynechococcuslividusPCC6715的碳酸酐酶基因Ecah、Pcah,实现其在大肠杆菌细胞中异源高效表达,并进行初步酶学性质研究。【方法】利用PCR技术获得碳酸酐酶基因cah,构建重组基因工程菌BL21_pETM11_CAH,利用IPTG诱导方法高效表达蛋白,表达产物(CAH)经Ni-Agarose亲和层析柱纯化后,进行酶学性质研究。【结果】从E542、PCC6715中克隆得到大小均为534 bp的碳酸酐酶基因,以CO2为底物,酶催化CO2水合的活性分别为42.6 WAU/mg-protein、47.6 WAU/mg-protein。碳酸酐酶ECAH 50°C处理30 min后,酶活提高了8%,而PCAH却下降了10%。Zn2+、磺胺对两种碳酸酐酶有显著抑制作用,Ca2+对ECAH有轻微激活作用,对PCAH无显著抑制作用。【结论】E542嗜热蓝细菌表达的碳酸酐酶比PCC6715的热稳定性强,符合处理工业高温点源烟道气的CO2的基本要求,丰富了碳减排的嗜热碳酸酐酶基因库。     

丹参酮Ⅱ—A磺酸钠对鼠肝线粒体功能的影响

利用大鼠肝脏线粒体为材料,以琥珀酸为底物,研究了不同浓度的丹参酮Ⅱ－Ａ磺酸钠对线粒体态４、态３呼吸及呼吸控制率,线粒体跨膜电位,线料呼吸链复合体（Ⅱ＋Ⅲ）电子传递及质子转移活性的影响,结果证明丹参酮ⅡＡ－磺酸钠是线粒体呼吸链复合体（Ⅱ＋Ⅲ）的有效抑制剂,文中对丹参酮ⅡＡ－磺酸酸钠在心肌缺血再灌注过程中的保护作用的分子机理进行了讨论。     

莱茵藻胞外碳酸酐酶分子定位与活性诱导

胞外碳酸酐酶是藻类CCM机制和光合作用的一个重要组分 ,藻类从高CO2 转入低CO2 浓度培养时可诱导出胞外碳酸酐酶。应用金标免疫分子定位和pH调节对胞外碳酸酐酶分子定位和CO2 诱导机制进行研究 ,结果表明 :胞外碳酸酐酶主要分布于胞壁空间 (细胞质膜与细胞壁之间 ) ,且细胞壁上也有较多分布 ,细胞壁外分布较少。说明胞外碳酸酐酶能从胞壁空间穿过细胞壁。通过CO2 诱导和pH调节(升高 ) ,均可提高碳酸酐酶活性 ,且pH提高幅度越大 ,胞外碳酸酐酶活性也越大 ,说明胞外碳酸酐酶的CO2 诱导与pH调节有一定关系     

莱茵藻胞外碳酸酐酶分子定位与活性诱导

胞外碳酸酐酶是藻类CCM机制和光合作用的一个重要组分,藻类从高CO2转入低CO2浓度培养时可诱导出胞外碳酸酐酶。应用金标免疫分子定位和pH调节对胞外碳酸酐酶分子定位和CO2诱导机制进行研究,结果表明：胞外碳酸酐酶主要分布于胞壁空间（细胞质膜与细胞壁之间）,且细胞壁上也有较多分布,细胞壁外分布较少。说明胞外碳酸酐酶能从胞壁空间穿过细胞壁。通过CO2诱导和pH调节（升高）,均可提高碳酸酐酶活性,且pH提高幅度越大,胞外碳酸酐酶活性也越大,说明胞外碳酸酐酶的CO2诱导与pH调节有一定关系。     

激光扫描共聚焦显微镜观察胰蛋白酶对肺上皮细胞游离钙离子的影响

目的：研究PAR-2激动剂SLIGKV和tc-LIGRLO、胰蛋白酶及其抑制剂对H292肺上皮细胞[Ca^2＋]i的影响.方法：应用Fluo-3/AM 荧光标记技术和激光扫描共聚焦显微镜（LSCM） 检测不同因素处理的H292肺上皮细胞[Ca^2＋]i.结果：胰蛋白酶、SLIGKV、tc-LIGRLO均能引发H292细胞[Ca^2＋]i的增加,平均荧光强度分别比加入药物前增加267%,60%和37%.胰蛋白酶抑制剂大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）和α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）可以抑制胰蛋白酶诱导的细胞[Ca^2＋]i的增加.结论：PAR-2可以介导H292肺上皮细胞[Ca^2＋]i的释放增加,胰蛋白酶抑制剂可以抑制胰蛋白酶诱导的细胞[Ca^2＋]i的增加.     

微生物碳酸酐酶诱导CaCO_3沉淀的影响因素及生成机理

微生物碳酸酐酶能够加速CO_2的水合反应,对于研究全球碳循环具有重要的意义。选用一种产生胞外碳酸酐酶的细菌,研究了温度、pH值和Ca~(2+)浓度对细菌生长、碳酸酐酶活性的影响。结果表明,25℃碳酸酐酶的活性最高,有利于CaCO_3的沉淀;初始pH值为8.5的偏碱性环境中,CaCO_3沉淀质量最多;当Ca~(2+)浓度为50 mmol/L时,细菌的生长繁殖最好,过低的Ca~(2+)浓度会影响CaCO_3的生成,而过高的Ca~(2+)浓度则会严重影响细菌的生长,降低细菌的活性。最后研究了微生物碳酸酐酶诱导CaCO_3沉淀的机理,碳酸酐酶能够加速CO_2水化成HCO_3~-,在碱性环境中、钙源存在的情况下,与OH~-和Ca~(2+)反应生成CaCO_3沉淀。     

线粒体呼吸链复合体Ⅱ＋Ⅲ的电子传递与质子转移的偶联

研究了鼠肝线粒体内膜体呼吸链复合体Ⅱ＋Ⅲ的Ｈ~＋／２ｅ比与Δψ的相关性及其调节因素。证明：（１）用光谱法测得复合体Ⅱ＋Ⅲ的电子传递与质子转移初速度的Ｈ~＋／２ｅ比值接近４,与铁氰化钾脉冲法测得的结果相同。Ｈ~＋／２ｅ随着ΔμＨ~＋升高而逐渐下降。荧光透析法测定不同Ｆｅ~（３＋）还原速率建立的不同Δψ时,证明Ｈ~＋回漏对Δψ和Ｈ~＋泵出速度的依赖性。讨论了呼吸链复合体Ⅱ＋Ⅲ电子传递与质子转移之间的偶联以及“Ｒｅｄｏｘｓｌｉｐ”和“ｐｒｏｔｏｎｌｅａｋ”的现象。（２）抑制剂实验说明线粒体内膜中Ｃａ~（２＋）、Ｐｉ与Ｈ~＋的协同运输系统对线粒体内膜Ｈ~＋泵出及Ｈ~＋回漏作用有一定的调控作用。     

抑制剂K—23对菠菜光系统Ⅱ放氧活性和希尔反应的影响

研究了新的抑制剂K_2 3对波菜 (SpinaciaoleraceaMill.)PSⅡ放氧活性和 2 ,6_dichlorophenolindophenol (DCIP)光还原活性的影响。研究发现 :抑制剂K_2 3在低浓度时对PSⅡ放氧活性有明显促进作用 ,而对DCIP光还原活性的促进作用不太明显。在高浓度时抑制PSⅡ放氧活性和DCIP光还原。对K_2 3的抑制部位进行了初步探讨。     

H2S与Ca^2＋协同增强谷子对Cr^6＋胁迫的耐受

继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后,第三种气体信号分子硫化氢（H2S）对植物体生长发育和环境胁迫应答的调控正在受到越来越多的关注。钙离子（Ca2＋）是重要的第二信使,参与植物对多种胁迫的响应。该实验以谷子这种抗逆性较强的作物为材料,对其响应六价铬（Cr6＋）胁迫过程中H2S和Ca2＋45号的互作进行了研究。结果表明,Cr6＋胁迫显著激活谷子幼苗的H2s产生系统,外源H2S预处理能明显降低Cr6＋胁迫对谷子根尖细胞的损伤,而H2S的合成抑制剂羟胺（HA）预处理,使得Cr6＋对谷子的毒害增强;进一步实验发现,H2S能激活Ca2＋信号下游相关基因的表达,同时Ca＋能增强H2S的产生,表明在植物体内H2S和Ca＋信号存在复杂的联系。该研究也证明,H2S和ca2＋可以通过调节重金属离子转运蛋白增强谷子对Cr6＋的耐受。     

可用于二氧化碳捕获过程的微生物碳酸酐酶的挖掘与改造

二氧化碳排放量的急剧上升引起全球温室效应加剧。碳酸酐酶是地球上反应速率最快的几种酶之一,可以大幅提高CO_2捕获和生物矿化的效率,从而降低大气中CO_2的排放量。但捕获过程在高温条件,而CO_2生物矿化形成CaCO_3的过程则需要碱性条件。因此,迫切需要筛选出既嗜热又耐碱的碳酸酐酶以用于CO_2捕获,极端微生物是这类酶的重要来源之一。文中系统、深入地介绍了目前从极端微生物或利用蛋白质工程技术获取嗜热、耐碱的碳酸酐酶的最新研究进展,同时简要介绍了一些新型固定化碳酸酐酶的方法。最后指出当前研究的重点应致力于拓宽寻找碳酸酐酶的范围,改良蛋白质工程改造技术,研发高效廉价、易于放大的固定化方法,为减轻温室效应、延缓全球变暖这一迫切需要解决的问题提供新思路。     

不同植物的碳酸酐酶活力差异研究

碳酸酐酶是催化二氧化碳的可逆水合反应的一种含锌金属酶。测定不同植物、同一植物不同部位、同一植物同一部位不同时间的碳酸酐酶的活力,研究诸葛菜和油菜碳酸酐酶及其胞外酶活力的差异,初步探讨碳酸酐酶活力与植物抗干旱能力之间的关系。研究结果为诸葛菜的喀斯特适生性的研究提供依据。     

钙信号途径参与小斑病菌致病过程的调控

为确定Ca^2＋信号途径与玉米小斑病菌致病过程的相关性,用可从不同位点阻断Ca^2＋信号转导途径的抑制剂分别处理小斑病菌的分生孢子,结果表明：Ca“螯合剂EGTA、Ca^2＋通道抑制剂Verapamil、影响钙调素与钙调素依赖蛋白激酶作用位点的抑制剂KN-93,随着浓度的增加,对孢子萌发和附着胞形成过程的抑制作用明显增强;同一浓度下,抑制剂对附着胞形成过程的抑制作用大于孢子萌发过程;抑制剂可使附着胞形态明显变小甚至不能形成。以上结果表明钙信号途径参与了玉米小斑病菌主要致病过程的调控。