Qβ RNA 复制酶中亚基的共表达对β亚基溶解性的影响

在体外RNA和蛋白质合成及自复制系统的研究中,Qβ RNA复制酶作为以RNA为模板的RNA聚合酶,是比较重要的应用酶种之一。该酶由4个亚基组成,其中只有 β亚基是由病毒基因编码,而其他3个亚基都是宿主蛋白。利用普通表达载体合成Qβ复制酶时,得到的β亚基几乎都是不溶性蛋白,从而影响了Qβ复制酶的活性和产率。为尝试提高β亚基的溶解性,构建含有β亚基基因的表达质粒pBAD 33rep,同时利用pET21a(+)为表达载体表达其他3个亚基进行共表达研究。不同亚基组合的共表达结果通过SDSPAGE分析表明,当β亚基与EFTuTs亚基共表达时,溶解度有一定的提高,而且可溶性部分也具有复制酶活性。通过调节共表达诱导物浓度,相对增强可溶性β亚基的表达,可溶性Qβ复制酶酶量得到相应的提高。     

猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用

了研制高活性的重组猪β干扰素,对PoIFNβ成熟蛋白第3、7和164位的3个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏嗜性改造并构建了酵母表达载体pPICZαAPIB。pPICZαAPIB经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X33。多株PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了PoIFNβ, 其中B1株酵母的PoIFNβ产量最高,约为2.5×10.5U/mL,其表达量约为60μg/mL,比活为4.17×10.6U/mg。将发酵上清液用PEG20000浓缩后进行SDSPAGE和Western blot检测,结果表明表达产物是分子量约为28kDa和25kDa蛋白的混合物,两者均可与PoIFNβ阳性抗血清发生特异反应。表达产物比PoIFNβ理论推导分子量（约20.8kDa）大,推测可能是表达产物发生了不同程度的糖基化。重组PoIFNβ对伪狂犬病毒在细胞中增殖可呈现抑制作用,并且rPoIFNβ对伪狂犬病毒在MDBK细胞上早期增殖的抑制效果最为明显。     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶基因在工业啤酒酵母中的整合和表达

用PCR合成的瑞氏木霉（T.reesei）β-内切葡聚糖酶Ⅰ（EGⅠ）的cDNA, 构建了由酵母醇脱氢酶 （ADH1）启动子和终止子引导表达、β-内切葡聚糖酶自身信号肽序列引导分泌、由酵母rDNA序列引导同源整合的酵母YIP型β-内切葡聚糖酶表达分泌质粒pA15PET。采用pA15PET与酵母YEP型G418抗性表达质粒的共转化,将EGⅠ表达单元整合到已整合有α-乙酰乳酸脱羧酶（α-ALDC）表达单元的啤酒酵母工程菌BE9711的染色体rDNA序列中,获得同时表达胞内α-ALDC和胞外β-内切葡聚糖酶的啤酒酵母工程菌。     

原核表达的天花粉蛋白和另外两种蛋白具有体外抗真菌活性

将天花粉蛋白、烟草几丁质酶和烟草β１,３葡聚糖酶的结构基因分别克隆到原核表达系统中进行表达,对三种基因的原核表达产物的粗提取物分别进行体外抗菌活性检测,发现三种蛋白质均有抗真菌活性。三种蛋白中任意两种蛋白的组合,其抗真菌活性显著高于单一组分的抗真菌活性。三种蛋白共同作用时,获得了更好的抗真菌效果     

不同异源启动子与MDV gB启动子及其复合启动子的活性比较

为了选择适宜的启动子调控外源基因的表达,以改善马立克氏病病毒为载体的重组病毒的免疫保护力。将hCMV立即早期启动子及增强子、SV40早晚期启动子及增强子或hCMV立即早期增强子的部分序列分别与马立克氏病病毒（MDV）自身的囊膜糖蛋白B基因（gB）启动子核心部分在体外杂合,分别构建复合启动子PhCMVgB、P SVgB或PengB;将这些启动子与虫荧光素酶报告基因相连,构建表达载体。利用脂质体将以上质粒与内标质粒（pSVβLacZ）共转染鸡胚成纤维次代细胞,于转染后48h,将细胞刮下来,利用荧光素酶测定试剂盒和β半乳糖苷酶测定试剂盒分别测定转染细胞的荧光素酶和β半乳糖苷酶的活性,通过荧光素酶和β半乳糖苷酶活性的比值获得虫荧光素酶的相对活性,利用虫荧光素酶的相对活性进行启动子的活性比较。结果表明,复合启动子相对马立克氏病病毒自身的gB启动子,活性有不同程度的提高,其中复合启动子PhCMVgB的活性最高,而复合启动子PSVgB和PengB的活性相当;但与商业强启动子相比,复合启动子活性要弱一些或相当。因此,从某种意义上讲,这些复合启动子既具有gB启动子的一些特性,又有商业强启动子的一些特性,为以马立克氏病毒为载体的新兴疫苗的开发奠定了基础。     

NAC1上游调控区表达特征及其与侧根激素诱导的关系

从拟南芥(Arabidopsis thaliana）中克隆到与侧根原基发生相关的转录因子基因NAC1上游调控区序列,构建由该序列驱动β-葡聚糖苷酶基因(GUS)的植物表达载体并转化烟草(Nicotiana Tabaccum),经筛选获得了在根组织高GUS活性而地上部痕量表达的转基因烟草植株。对转基因植株进行GUS活性和染色分析,结果表明NAC1上游调控区驱动的GUS基因表达具有根部组织特异性,在侧根顶端分生组织区、侧根原基基部和幼嫩侧根基部表达。用IBA,GA₃,GA₄₊₇处理转基因植株根部,NAC1上游调控区驱动的GUS表达均增强,表明生长素、赤霉素可显著诱导NAC1上游调控区的表达,并参与侧根发生的调控。     

芒果生长素反应因子类蛋白的cDNA克隆和表达

通过SSH法获得了一个与不定根形成相关的差异表达的cDNA片段,其推导的氨基酸序列与拟南芥的生长素反应因子(ARF)类蛋白具有较大的同源性,因此将它命名为MiARF。用所设计的基因特异引物进行3′RACE扩增获得包含完整读码框架(ORF)的MiARF1（GenBank登录号为AY255705）和MiARF2（GenBank登录号为AY300808）。MiARF1全长为3272bp,其中,ORF含2523bp,5′非翻译区（5′UTR）含285bp, 3′非翻译区(3′UTR)含464bp。由该序列所推导的氨基酸序列与拟南芥ARF2（BAB10162）的ID值为64%, E值为0,在DNA结合区域（DBD）、III和IV区域的同源性更高,ID值均大于80%。MiARF2cDNA全长为1474bp,其中ORF含981bp,5′非翻译区含285bp, 3′非翻译区含208bp,由该序列所推导的氨基酸序列与拟南芥ARF2（BAB10162）的ID值为84%,E值为e-151。 MiARF2仅具有DBD保守区并与MiARF1的基本相同,但缺乏III和IV区域。Virtural Northern 杂交表明：MiARF2在生根的组织中表达水平高, 而在非生根的组织中未见表达;MiARF1在生根及非生根的组织中均有表达。     

来源于酸热脂环酸杆菌的嗜酸性α-淀粉酶的表达研究

从嗜酸耐热的酸热脂环酸杆菌Alicyclobacillusacidocaldarius中克隆到α_淀粉酶的基因 (amy) ,该基因全长 390 3bp ,编码130 1个氨基酸 ,理论分子量约 140kD。将基因amy分别克隆到大肠杆菌E .coli表达载体pET-2.2b(+)和毕赤酵母P .pastoris表达载体pPIC9α ,并在大肠杆菌和毕赤酵母中得到了表达 ,表达产物具有淀粉酶的活性。对酵母中表达的酶蛋白AMY进行了纯化 ,并初步研究了它的酶学性质 ,它的作用最适pH3.2 ,在pH 2.5～4.6范围内 ,酶活性保留 50%以上 ,它的最适温度65℃ ,在 70℃下处理 30min ,酶活性维持50%以上 ,基本保留了天然酶蛋白的耐热性和嗜酸性。位于基因amy内部 +1174～+3288bp的基因片段amy′全长 2115bp ,编码705个氨基酸 ,在E .coli表达后依然具有淀粉酶的活性。     

棉花微管蛋白基因GhTub1在纤维细胞中的特异表达

以陆地棉(Gossypium hirsutum )纤维发育前期和中期的胚珠及纤维细胞为材料构建cDNA文库, 通过ESTs分析获得了一个β-微管蛋白家族成员(GhTub1). 以该cDNA的3′-UTR为探针, 利用Northern杂交方法, 对GhTub1基因在棉花不同器官及棉纤维不同发育阶段的表达进行了分析, 发现该基因的表达具有棉纤维细胞特异性. 在纤维发育过程中, GhTub1转录产物的累积主要发生在纤维细胞延伸阶段, 在纤维延伸速度最快时达到高峰. 利用裂殖酵母系统, 对GhTub1的细胞内功能进行了初步分析, 发现该基因在酵母中过量表达能使其细胞显著伸长或分支. 这些实验结果暗示GhTub1基因可能在纤维细胞的极性延伸中具有功能.     

甜菜银叶病菌的PCR检测

本研究用16S23S rDNA间的ITS 序列通用引物L1（5′AGTCGTAACAAGGTAGCCGT3′）和L2 （5′ GTGCCAAGGCATCCACC3）扩增甜菜银叶病菌（Curtobacterium flaccumfaciens pv. betae,Cfb）和其它相近细菌的基因组DNA;并对其PCR产物进行回收、克隆和测序,将所获序列和其它已报道的细菌内源转录间隔区(Internally Transcribed Spacer,ITS)序列进行多重比较后设计出Cfb的特异性引物B1（5′GGCCTCGTGTTGTCCCTTATC3′）和B2 （5′GTCACCAATCAACAACCCGAG3′）。此引物可以从Cfb中扩增出387bp 的特异性片段,而其余参试的21个细菌PCR反应结果均为阴性。该方法可以应用于病害防治工作中的Cfb快速、可靠的检测。     

组织纤溶酶原激活剂突变体乳腺表达载体构建及在转基因鼠中表达的研究

通过PCR方法从羊肝总DNA中获得了羊β-乳球蛋白(BLG)基因第一和第二内含子,以羊β-乳球蛋白基因(BLG)5′区5kb为调控序列,构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体(La-tPA)载体。对540枚小鼠受精卵进行显微注射,经PCR和Southern blot检测,获得6只整合有人La-tPA的转基因小鼠,整合率为32%。同时研究了转基因在小鼠体内的表达。Northern blot分析表明,在一些转基因鼠乳腺中表达出La-tPA。在基因鼠乳汁中检测出La-tPA的表达达6μg/mL。这为未来利用转基因动物生产La-tPA提供依据。     

新型抗肿瘤转移多肽-三聚β肽(β３)在大肠杆菌中的表达及其抗粘附作用

自行设计了抗肿瘤转移多肽－三聚β肽（β3）,人工合成了β3的基因片段,构建了β3的表达质粒pET-His-β3,在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达。在用IPTG诱导15h后可见明显的His-β3融合蛋白的表达,表达产物约占细胞总蛋白的4％,占细胞总不溶性蛋白的10％。每升pET-His-β3/BL21(DE3)plysS细菌培养液用金属螯合琼脂糖凝胶6B FF分离后可回收纯度为92.2%的β3产物约20mg。所表达出的β3肽对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞及人肝癌高转移细胞株HCCLM6细胞与纤连蛋白（fibronectin, FN）粘附具有特异的抑制作用,呈现剂量效应相关关系和时间效应相关关系,抑制作用强于β肽（β1）、3倍浓度的β1（3×β1）和GRGDS。研究结果表明：pET-His-β3/BL21(DE3)plysS是β3适合的表达系统;表达的β3肽具有特异的抗肿瘤细胞粘附作用。     

人可溶性血管内皮细胞生长因子受体Flt-1基因在链霉菌中的克隆表达

应用RTPCR技术,从人脐静脉内皮细胞中扩增出编码人可溶性血管内皮细胞生长因子 (VEGF)受体Flt1胞外区前四个结构域的基因片段,亚克隆至pUCl8质粒进行测序,将目的基因片段连接至链霉菌表达载体pSGLgpp,获得重组质粒pSGLgppF,将其转化至Streptomyces lividans TK24, 获得基因工程菌株Sreptomyces lividans (pSGLgppF),对其培养上清液进行SDSPAGE及Western blot分析,结果 显示,在636kD处有特异性条带出现,表明sFLT1在链霉菌中获得了成功表达,受体配基结合实验显示表达产物与VEGF可特异性结合,表明其具有配基结合生物活性。     

棉花半乳糖苷酶基因启动子的分离及其在转基因烟草中的表达

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, EC 3.2.1.23)由植物中广泛分布的一类糖基水解酶组成, 被认为与细胞壁多糖的代谢相关. 棉花(Gossypium hirsutum) β-半乳糖苷酶基因已被成功分离, 被命名为GhGal1. RNA杂交实验显示该基因在棉花纤维发育的伸长期优势表达. 为了分析GhGal1基因的时空表达调控, 本研究构建了GhGal1启动子区域(1770 bp)与β-葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase, GUS)基因融合的双元载体, 通过农杆菌转化烟草植株. 对转基因植株分析的结果表明: 此转基因果实中的GUS活性比阴性和阳性对照的活性高. GUS组织定位分析表明: β-半乳糖苷酶基因能在根组织的分生区、子叶、维管束组织、果实和表皮毛中表达. 此外, 调控区域的序列分析揭示该序列含有一些果实/种子特异表达以及与表皮毛表达相关的保守元件. 这些结果显示了GhGal1启动子在转基因烟草植株中的时空表达特征, 并提供了GhGal1基因参与棉花纤维发育的一些重要线索.     

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗的构建及其遗传稳定性与免疫效力

以鹅源H5亚型禽流感病毒(AIV)基因组为模板,用RTPCR扩增血凝素（Hemagglutinin, HA）基因,克隆入鸡痘病毒表达载体pFG1175,转染鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞,通过蓝斑筛选和间接免疫荧光检测,获得表达HA基因的重组鸡痘病毒（Recombinant fowlpox virus, rFPVHA）。rFPVHA经鸡胚成纤维细胞连续传15代后,报告基因LacZ和HA基因可稳定表达。用103PFU和105PFU的rFPVHA免疫无特定病原体的(Specific pathogen free, SPF)鸡,免疫后22d 血凝抑制(Hemagglutinin inhibition,HI)抗体监测阳性率分别为0%和20%,但均抵御了H5亚型毒株的致死性攻击,保护率为100%。结果表明,构建了表达HA基因的重组鸡痘病毒,该重组病毒具有良好遗传稳定性,免疫鸡可提供完全保护,显示出了一定的应用前景。     

曲霉与木霉纤维素酶系基因组的属间遗传表达相容性

选用三类典型重组子3a、3b、A7-1和双亲本菌株AspersillusnigerAMSH、TrichodermareeseiQM9414为材料,按照所设计的纤维素酶系基因的通用序列和同工酶分型方法,进行基因组DNA指纹和酶系同工酶多态性比较分析。旨在提供重组子中基因重组的分子证据,阐明远缘双亲本基因组间的遗传表达相容性,并讨论其杂种优势的分子基础。结果发现重组子中基因组DNA指纹的重组特征稳定遗传,并能够相容性增强表达重组后的羧甲基纤维素酶（CMCase）和β-葡萄糖苷酶（βGlase）同工酶组分。纤维素酶系杂种优势的分子基础多样性包括：（1）3b中来自于双亲本部分编码βGlase的基因的杂合迭加和增强表达;（2）3a和A7-1中对应继承双亲本部分编码CMCase和βGlase的基因间协调性增强表达,并导致相应酶组分蛋白合成量的显著增加。由此综合提出了一个由βGlase介导的纤维素酶系活性调节和诱导合成调控的“双重协同增效”模型。此外还建立了考察重组子中杂种优势分子基础及其遗传稳定性的可行方法。     

乳腺癌特异性基因1(BCSG1)异常表达的调控机制

从乳腺癌cDNA文库中分离出的乳腺癌特异性基因1(BCSG1, breast cancer-specific gene 1) 又称Synuclein γ, 其表达蛋白广泛分布在神经系统的神经元突触前末稍. 除神经系统外, 正常乳腺组织或良性病变中BCSG1几乎不表达, 而多数浸润性乳腺癌、卵巢癌等肿瘤组织中表达异常增高. BCSG1的异常表达与肿瘤细胞的生长、浸润及转移相关. 为了解BCSG1的转录调控机制及转录因子对调控的影响, 用含启动子的BCSG1片段构建了不同长度的3¢端缺失片段、删除Sp1片段以及突变转录激活蛋白1(AP1, activator protein)位点的BCSG1启动子报告质粒, 并选用乳腺癌细胞系进行瞬时转染, 分析BCSG1启动子活性变化. 研究发现, BCSG1启动子5¢端区序列可决定BCSG1的基础转录活性, 并受Sp1位点调控; 在BCSG1蛋白阴性的乳腺癌细胞中, pGL3-1553的活性显著降低; 在HepG2肝癌细胞中, pGL3-1759的活性显著降低; 内含子1中AP1位点突变或缺失使启动子转录活性明显降低; c-jun和c-fos, 及cAMP效应器结合蛋白(CREB, cyclin AMP-responsive element binding)可以显著增强BCSG1启动子的活性. 这些结果表明, BCSG1的异常表达可能受多种因素影响, 5¢端区序列及Sp1位点决定BCSG1启动子的基础活性; 外显子1中含有可能影响BCSG1异常表达的关键序列; 决定细胞特异性表达的序列可能存在于内含子1中; 内含子中AP1结合位点可以调控BCSG1启动子的活性.     

嗜热毛壳菌内切β-葡聚糖酶的分离纯化及特性

探讨了液体发酵嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophile)产生的内切β葡聚糖酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE\|Sepharose Fast Flow阴离子层析、Pheny1\|Sepharose疏水层析、Sephacry1 S\|100分子筛层析等步骤便可获得凝胶电泳均一的内切β\|葡聚糖酶。经125%SDS\|PAGE和凝胶过滤层析法分别测得所分离纯化酶蛋白的分子量约为67.8kD和69.8kD。该酶反应的最适温度和pH分别为60℃和40～45在pH50条件下,该酶在60℃下稳定;70℃保温1h后,仍保留30%的活性;在80℃的半衰期为25min。金属离子对内切β\|葡聚糖酶的活性影响较大,其中Na+对酶有激活作用;Fe2+、Ag+、Cu2+、Ba2+、Zn2+等对酶有抑制作用。该酶对结晶纤维素没有水解能力。     

水稻EPSP合酶第一内含子增强外源基因的表达

分离并克隆了水稻5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的第一内含子(EPI). 序列分析表明, EPI长704 bp, GC含量为36.2%. 为进一步研究EPI序列在转基因植物中对外源基因表达水平的影响, 将EPI序列插入CaMV35S启动子和报导基因β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase, GUS)基因(gus)之间. 采用基因枪法转化烟草叶片, gus基因瞬时表达表明, EPI序列的存在可以使GUS的表达水平提高. 利用农杆菌法转化烟草, 获得了gus基因稳定表达的植株. GUS活性检测表明EPI内含子的存在可以显著提高GUS基因的表达(P<0.01). Northern blot 分析表明, 在转录水平上gus基因在含EPI内含子的转基因植株中的表达高于不含EPI gus基因的表达, 并且成熟的gus mRNA中EPI被正确剪取掉了, 表明是一种非转译的内含子. GUS定量检测表明, EPI存在可以使GUS的平均表达水平提高3倍, 最高单株可提高6倍.     

多粘芽孢杆菌 (Bacillus polymyxa)β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质分析

从多粘芽孢杆菌 (Bacilluspolymyxa 1794 )中克隆得到 β-葡萄糖苷酶基因bglA。将其构建在大肠杆菌 (Es-cherichiacoli)表达载体pET28a(+)上 ,转化E .coliBL21,获得重组工程菌BL1979。重组表达的 β-葡萄糖苷酶的酶活力达到 247IU mL ,经镍柱纯化后的β-葡萄糖苷酶最适温度为 37℃ ,最适pH值为70 ,该酶经纯化后纯度可达92.7%。用非变性梯度聚丙烯凝胶电泳发现该酶具有多种寡聚体形式 ,经荧光底物活性染色表明这些寡聚体均具有β-葡萄糖苷酶活性.