烟草MARs的分离及其功能分析

从烟草基因组中克隆到两条新的MAR片段（M14和M17）,序列分析表明,它们具有90%AT-box,A-box,T-box,碱基非配对区域,拓扑异构酶Ⅱ识别位点,弯曲DNA序列,复制起始序列和ATATTT等典型的MAR序列特征,并与原有MAR序列的特征不同。将它们分别构建到植物表达载体pCAMBIA2301 GUS基因（uidA）表达盒一侧及两侧,通过农杆菌介导转化烟草。组织化学染色法定性检测GUS活性表明,带有M14和M17的uidA基因在转基因烟草中稳定表达。GUS活性的定量检测表明,表达载体上uidA基因一端或两端连接有MAR的转化烟草中,GUS的表达水平与对照相比都有了明显提高,而uidA基因两侧连有MAR的载体提高表达水平的效果优于一端连有MAR的载体,可使GUS活性增强3.14倍,但不同转化个体之间表达水平的差异仍然明显。上述结果表明,所得DNA序列为两条新的MAR片段,并且具有提高转基因表达水平的功能。     

棉花半乳糖苷酶基因启动子的分离及其在转基因烟草中的表达

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, EC 3.2.1.23)由植物中广泛分布的一类糖基水解酶组成, 被认为与细胞壁多糖的代谢相关. 棉花(Gossypium hirsutum) β-半乳糖苷酶基因已被成功分离, 被命名为GhGal1. RNA杂交实验显示该基因在棉花纤维发育的伸长期优势表达. 为了分析GhGal1基因的时空表达调控, 本研究构建了GhGal1启动子区域(1770 bp)与β-葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase, GUS)基因融合的双元载体, 通过农杆菌转化烟草植株. 对转基因植株分析的结果表明: 此转基因果实中的GUS活性比阴性和阳性对照的活性高. GUS组织定位分析表明: β-半乳糖苷酶基因能在根组织的分生区、子叶、维管束组织、果实和表皮毛中表达. 此外, 调控区域的序列分析揭示该序列含有一些果实/种子特异表达以及与表皮毛表达相关的保守元件. 这些结果显示了GhGal1启动子在转基因烟草植株中的时空表达特征, 并提供了GhGal1基因参与棉花纤维发育的一些重要线索.     

玉米核基质结合区在烟草中对外源转基因表达水平的影响

为研究核基质结合区(matrix attachment region, MAR)在转基因植物中的功能,将来自玉米基因组的MAR序列构建在植物表达载体T-DNA中, 并将报告基因β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase, GUS)基因(uidA)插入两段MARs序列之间.将此载体与不包含MARs序列的植物表达载体分别转化烟草(Nicotiana tabacum L.).GUS活性检测表明,MARs可以显著提高外源基因uidA在转基因烟草中的表达水平,平均表达水平提高2倍,最高单株活性可达10倍.并且转基因植株GUS活性高低与稳定mRNA的量成正比,表明MARs在转录水平提高基因表达.     

豌豆核基质结合区的分离及其在转基因烟草中的功能分析

从豌豆基因组中分离出一段具有核基质结合区(matrix attachment region,MAR)特征的DNA序列,与已知序列相比,获得的序列中部缺失了115bp的重复序列.重复序列上、下游两段序列与已知序列相对应的序列有较高的同源性,并具有A-box,T-box和TATAAA等典型的MAR序列特征.为验证此DNA序列的功能,以β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因(uidA)作报导基因构建了植物表达载体,通过农杆菌介导转化了烟草.GUS定量检测表明,由于此DNA序列的存在,uidA基因的平均表达水平提高了2倍,最高的单株可达6倍.上述结果表明,该DNA具有MAR序列的特征序列,并且具有增加转基因表达的功能.     

油菜质膜水孔蛋白BnPIP1基因启动子区的克隆及初步的功能分析

利用双链接头介导PCR的染色体步行技术, 克隆了油菜质膜水孔蛋白BnPIP1基因上游1.6 kb的调控区域(GenBank登录号为AF472487). 序列分析表明, 该片段中含有种子萌发特异性序列及维管束特异性序列. 将其全长片段及5′端不同长度的缺失片段与gus(uidA)基因连接构建植物表达载体, 转化烟草. GUS组织化学染色表明, 全长1.6 kb片段具有较强的启动子活性. GUS染色主要分布在细胞迅速增生的部位及维管束组织中. 启动子缺失试验的GUS染色结果表明, -1610~-1030 bp区段的缺失使gus基因的表达明显变弱, 推测该区段含有启动子的正调控元件; -1030~-902 bp可能存在强烈抑制基因表达的负调控元件; -902~-19 bp的片段亦可驱动gus基因的高水平表达.     

NAC1上游调控区表达特征及其与侧根激素诱导的关系

从拟南芥(Arabidopsis thaliana）中克隆到与侧根原基发生相关的转录因子基因NAC1上游调控区序列,构建由该序列驱动β-葡聚糖苷酶基因(GUS)的植物表达载体并转化烟草(Nicotiana Tabaccum),经筛选获得了在根组织高GUS活性而地上部痕量表达的转基因烟草植株。对转基因植株进行GUS活性和染色分析,结果表明NAC1上游调控区驱动的GUS基因表达具有根部组织特异性,在侧根顶端分生组织区、侧根原基基部和幼嫩侧根基部表达。用IBA,GA₃,GA₄₊₇处理转基因植株根部,NAC1上游调控区驱动的GUS表达均增强,表明生长素、赤霉素可显著诱导NAC1上游调控区的表达,并参与侧根发生的调控。     

烟草tga1a基因的表达对外源基因在植物中表达的影响

烟草DNA结合蛋白TGA1a可特异地作用于CaMV35S增强子的激活序列as-1(-83~-63), 并表现为转录激活功能. 为了研究tga1a基因的表达对外源基因在植物中表达的影响, 将它置于维管束特异性启动子rolC下游, 并与CaMV35S启动子控制的报道基因串联成一种反式调控系统, 构建了植物表达载体, 同时, 以CaMV35S和rolC分别控制的报道基因构建植物表达载体为阳性对照. 通过农杆菌介导方法转化烟草和分子鉴定, 证明报道基因存在于转化烟草基因组中, 分别测定了不同转基因单株的GUS活性, 结果表明: rolC控制下的tga1a的表达显著增强了CaMV35S控制下的报道基因表达, 其GUS活性明显高于CaMV35S或rolC单独调控报道基因的转化植株, 单株的最高GUS活性达到两个阳性对照的10倍以上. 组织化学定位证实该串联系统使GUS蛋白主要集中在维管束组织. 这一研究结果为提高外源基因在转基因植株中的表达水平和外源基因的组织特异性表达创立了一个新模式.     

玉米醇溶贮藏蛋白基因启动子PCR扩增及其驱动GUS基因在转基因烟草种子中的表达

以玉米(Zea mays L.)黄化苗为材料,利用PCR技术扩增了玉米19kDa醇溶贮藏蛋白基因(zein)起始密码子上游启动子片段,序列分析结果表明,克隆的-1～-694片段具有19kDa zein启动子特点,与同一家族中其它基因的对应区段同源性达90％以上。将此启动子插入pPKGT的GUS基因及NOS终止子上游构成表达载体。经农杆菌转化烟草(Nicotiana tabaccum Var.samsum),得到了转化植株。转化的烟草的PCR扩增及Southern杂交证明目的片段已整合到烟草基因组中。转基因植株的GUS活性检测表明,在叶、根中无GUS活性,GUS活性只存在于种子中。转基因植株烟草种子经冷冻切片,GUS底物Xgluc活体组织染色证明GUS活性只存在一层介于种子胚乳与种皮之间的细胞中。     

玉米核基质结合区在烟草中对外源转基因表达水平的影响

为研究核基质结合区 (matrixattachmentregion ,MAR)在转基因植物中的功能 ,将来自玉米基因组的MAR序列构建在植物表达载体T_DNA中 ,并将报告基因β_葡糖醛酸酶 (β_glucuronidase ,GUS)基因 (uidA)插入两段MARs序列之间。将此载体与不包含MARs序列的植物表达载体分别转化烟草 (NicotianatabacumL .)。GUS活性检测表明 ,MARs可以显著提高外源基因uidA在转基因烟草中的表达水平 ,平均表达水平提高 2倍 ,最高单株活性可达 10倍。并且转基因植株GUS活性高低与稳定mRNA的量成正比 ,表明MARs在转录水平提高基因表达。     

核基质结合区在转基因烟草中对转基因表达的影响

为研究核基质结合区 (matrixattachmentregions,MARs)在转基因植物中对外源转基因 (transgene)表达的影响 ,将来源豌豆 (PisumsativumL .)的MARs序列构建在报告基因 β_葡糖醛酸酶 (β_glucuronidase ,GUS)基因 (uidA)的两侧形成植物表达载体。将此载体与不包含MARs序列的植物表达载体经根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens(SmithetTownsend)Conn)介导转化烟草 (NicotianatabacumL .)。GUS活性检测表明 ,MARs可以提高外源uidA基因的表达水平。和不包含MARs的转化植株相比 ,MARs序列的存在可以使uidA基因的平均表达水平提高 2倍 ,最高的可达 5倍     

菜豆重金属响应基因PvSR2在烟草中的表达及镉抗性分析

重金属特异诱导基因PvSR2(Phaseolus vulgaris stress-related)是从法国菜豆中克隆出来的, 为了研究该蛋白能否提高植物的抗重金属能力, 将PvSR2基因插入到植物转化中间载体pCAMBIA2301中CaMV 35S启动子的下游, 用根癌农杆菌介导的叶盘法将其导入烟草中, 在含有100 mg/L Kan的MS培养基上筛选, 获得了转基因植株. PCR和Southern杂交结果表明PvSR2已整合在烟草基因组中, GUS和Northern分析表明PvSR2在转基因烟草中获得表达. 重金属抗性实验表明: 与野生型烟草相比, PvSR2转基因烟草具有较高的抗重金属镉(Cd)的能力. 组织Cd含量分析显示: 在低浓度Cd (0.5~0.75 mmol/L)处理时, Cd在PvSR2转基因烟草与野生型烟草根中的累积量没有明显的差别, 而在高浓度Cd(0.1 mmol/L)胁迫下, 转基因烟草根中Cd的累积量低于野生型烟草, 说明PvSR2的表达能够提高植物的抗重金属能力, 同时表明PvSR2可能与重金属在植物中的运输和积累有一定关系.     

核基质结构区在转基因烟草中对转基因表达的影响

为研究核基质结合区（matrix attachment regions,MARs）在转基因植物中对源转基因（transgene）表达的影响,将来源豌豆（Pisum sativum L.）的MARs序列构建在报告基因β－葡糖醛酸酶（β-glucuronidase,GUS）基因（uidA）的两侧形成植物表达载体。将此载体与不包含MARs序列的植物表达载体经根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens(Smith et Townsend)Com）介导转化烟草（Nicotiana tabacum L.）。GUS活性检测表明,MARs可以提高外源uidA基因的表达水平,和不包含MARs的转化植株相比,MARs序列的存在可以使uidA基因的平均表达水平提高2倍高的可达5倍。     

羽衣甘蓝胁迫应答基因BoRS1转化烟草的初步研究

将克隆于羽衣甘蓝的胁迫应答基因BoRS<、I>1连入中间载体p35S 2 30 0 ::gus ::noster相应位点,成功地构建了含BoRS1基因的植物双元表达载体p35S 2 30 0 ::BoRS1::noster,并通过农杆菌介导法对烟草进行了遗传转化。PCR检测结果表明目的基因BoRS1已成功地导入并整合到烟草基因组中。RT PCR分析显示,在不同的转基因烟草植株中BoRS1表达量存在差异。转BoRS1烟草的耐干性和甘露醇胁迫研究表明,BoRS1基因的表达对提高植物抗干旱胁迫能力有一定的作用。     

转查耳酮合酶基因矮牵牛共抑制的研究

查耳酮合酶是花色素合成途径的一个关键酶. 将查耳酮合酶基因(chalcone synthase A, chsA)导入矮牵牛(Petunia hybrida)后, 转基因植株的外源与内源chsA基因一起发生共抑制, 导致花色改变. 将β-葡糖苷酸酶基因(uidA)连在chsA基因下游形成融合基因, 通过土壤农杆菌介导的途径转化矮牵牛. 利用GUS组织染色检测到共抑制的发生具有发育特异性, 在花组织发育时期开始发生, 发生的起始需要内源基因与外源基因的相互作用. RNA原位杂交实验表明, 共抑制的发生没有组织特异性, 且初步表明共抑制发生后, RNA可能是在细胞质中发生降解的.     

拟南芥γ-生育酚甲基转移酶 （γ-TMT）启动子的分离及表达特性分

维生素E是一类人体所必需的脂溶性的维生素,具有重要的生理功能。Γ-生育酚甲基转移酶（γTMT）是维生素E生物合成途径中的关键酶之一,催化γ、δ-生育酚甲基化,生成α、β-生育酚。从拟南芥中分离了γ-生育酚甲基转移酶基因1552bp的启动子序列,构建了含有该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得了转基因植株。GUS组织化学染色结果表明,在γ-TMT启动子的驱动下,报告基因GUS在拟南芥的叶、茎以及花均有表达,且在茎尖、雄蕊和幼叶中表达最强,而在根、种子和种荚中则没有检测到GUS基因的表达,表明γ-TMT基因可能仅在拟南芥某些组织中特异性高表达。     

菜凝集素基因的克隆及在转基因烟草中抗蚜性研究

通过PCR从苋属植物千穗谷(Amaranthus hypochondriacus)的总DNA中扩增出苋菜凝集素(AHA)的核基因片段。序列分析结果表明该基因为2453bp,含有一1538bp的内含子和两个分别为212bp和703bp的外显子。采取反向PCR的方法获得仅含该基因的编码区克隆。以此为基础与二元表达载体pBin438构建含内含子与不含内含子AHA基因的植物表达载体pBAHAg和pBAHAc并通过土壤农杆菌介导转化了烟草。转化再生植株的PCR和Southern blot分析表明,AHA基因已整合到烟草的染色体中,有单拷贝和多拷贝的整合。用与AHA蛋白高度同源的ACA蛋白的抗血清进行了免疫斑点(Immunodot blot)检测,结果初步表明转基因烟草有AHA蛋白的表达。虫试结果表明转pBAHAg和pBAHAc烟草对蚜虫的平均抑制率分别达57.2%和48.8%,有的高达90%以上。含内含子和不含内含子的AHA基因在转基因植株中的抗蚜性不同。     

抗草甘膦抗虫植物表达载体的构建及其转基因烟草的分析

构建了含草甘膦抗性突变基因（aroAM12）和人工合成重组Bt抗虫基因（Bts1m）的植物表达载体pCM12_s1m。aroAM12基因的表达由CaMV35S启动子控制,Bts1m基因的表达由2E_CaMV35S启动子和Ω因子控制。通过农杆菌介导,将aroAM12和Bts1m基因转化到烟草中,转基因烟草通过在含草甘膦的MS培养基上筛选而获得。Southern blot分析表明所有经过草甘膦筛选出的转化植株都整合有aroAM12基因,约70%的转化植株同时整合有aroAM12和Bts1m基因。Northern blot、Immunodot blot分析进一步证明整合的两个基因在转录、翻译水平上均进行了表达,不同植株之间表达存在着差异。草甘膦抗性和虫试实验证明,获得的转基因烟草对草甘膦和烟青虫具有很强的抗性。     

表达昆虫特异性神经毒素AaIT基因的转基因烟草的抗虫性

经改造的昆虫特异性神经毒素AaIT基因插入植物高效表达载体得到重组质粒pNGY-2。重组质粒中AaIT基因5＇端与烟草花叶病毒(TMV)的Ω序列3＇端融合,受两个串联的35S启动子控制,通过土壤农杆菌LBA4404介导转化烟草NC89,经NPTⅡ选择后再经GUS染色挑选出阳性再生植株,Southern blotting进一步证实了AaIT基因已经整合到烟草基因组中,对棉铃虫(Heliothis armigera)的抗虫实验表明,转基因烟草有显著的抗虫活性。     

受NaCl诱导的盐藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶cDNA的克隆及其在烟草中的表达

采用快速扩增cDNA末端(RACE)技术, 获得了盐藻(Dunaliella salina)受诱导表达的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶全长cDNA (DsALDP). 蛋白质序列分析发现, DsALDP与许多植物叶绿体的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(AldP)具有较高的同源性(66%~73%). 系统进化分析进一步证明DsALDP与藻类的AldP亲缘关系最近. 就表达谱而言, DsALDP是NaCl诱导下新表达的转录本, 其表达水平随诱导时间的不同而呈显著变化. 筛选的DsALDP cDNA构建到双元载体pBI121并导入农杆菌用以转化烟草, 对4个T₁代转基因植株进行Southern检测, 证明DsALDP已整合入转基因植株的基因组. RT-PCR分析显示DsALDP在这些植株中均得到有效表达. 生物测试表明, T₁-1, T₁-2和T₁-3植株在100~200 mmol/L NaCl下仍保持醛缩酶活性, 且其脯氨酸含量均有不同程度的升高.     

水稻OsBP-73基因表达需要其内含子参与

该实验室以前的研究表明,水稻OsBP-73基因含有2个外显子和1个长度为2 471 bp的内含子.该文报告用OsBP-73基因ATG翻译起始密码子(在第1外显子中)上游序列(1- 818～ 215)与GUS基因构成嵌合质粒pRSSl,将该质粒转化水稻后,在抗性愈伤组织和转基因植株中未能检测到GUS基因的表达.只有用含有完整的内含子及其上游序列(1 818～ 2 844)与GUS基因构成嵌合质粒(p13GNF)时,才能在p13GNF的转基因抗性愈伤组织和植株中检测到GUS基因的表达.实验还证明,单是内含子序列并不能驱动GUS基因在转基因水稻中表达.由此推测:OsBP-73基因的启动子序列驱动基因表达时,需要基因内含子的参与.