多核苷酸合成的研究——改良三酯法化学合成脱氧十二核苷十一磷酸 d-CATGAATTCATG

本文报道一种简便的化学合成多聚脱氧核苷酸的三酯法以及自身互补的脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG 的化学合成,这种方法包括:(1)直接使用容易制备的O~5',N-保护的脱氧核苷-3'-对氯苯磷酸二酯的钡盐和过量的N-保护的脱氧核苷缩合,高效地合成保护的二聚体三酯中间物DmtN'(?)N'OH(N'表示d-T,d-BzA,d-_(an)C 或d-_(ib)G;(?)表示对氯苯磷酸二酯)。(2)二聚体三酯中间物3'端的羟基和过量的对氯苯磷酰双三唑反应,得到几乎定量产率的磷酸化中间物DmtN'(?)N'(?)OH。(3)采用均三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂。试剂十分稳定,具有容易制备和缩合能力强的优点。(4)硅胶短柱层析方法应用于各个三酯中间物的分离纯化,层析过程可在3小时内完成。通过脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG 的化学合成,证明这是一个快速合成多聚脱氧核苷酸的有效途径。首先,我们合成不同的二聚体三酯中间物,并依次缩合,得到八聚体d-_(HO)A~(Bz)(?)A~(Bz)(?)T(?)T(?)C~(An)A~(B(?))(?)T(?)G_(OBz)~(ib)和四聚体磷酸化中间物d-DmtC~(An)(?)A~(Bz)(?)T(?)G~(ib)(?)OH(产率70～94%)。然后,将上述四聚体和八聚体片段进一步缩合,并用浓氨水、80%醋酸脱除所有保护基,经葡聚糖凝胶G-75和DEAE-葡聚糖凝胶A-25二次柱层析纯化,得到脱氧十二核苷十一磷酸。顺序分析的结果证明合成的产物具有正确的结构。此外,产物能被限制性内切酶EcoRI 识别并水解得到预期的结果。     

脑啡肽基因的合成 Ⅰ.d-GATCCTAGA的合成

本文报道了脑啡肽基因下链二十六核苷酸中九核苷酸d-GATCCTAGA的合成。合成系采用改良的三酯法,即先合成d-_(Dmt)G_?~(ib)A_?~(Bs)T_(?OH)、d-_(Dmt)C_?~(An)C_?~(An)T_(?OH)和d-_(Dmt)A_?~(Bs)G_?~(ib)A_(OBs)~(Bz)三个片段,然后由d-_(Dmt)A_?(Bs)G_?~(ib)A_(OBz)~(Bz)脱去5′-Dmt基后依次同d-_(Dmt)C_?~(An)C_?~(An)T_(?OH)和d-_(Dmt)G_?~(ib)A_?~(Bz)T_(?OH)向5′端延伸缩合得到产物d-_(Dmt)G_?~(ib)A_?~BsT_?C_?~(An)C_?~(An)T_?A_?~(Bs)G_?~(ib)A_((OBs)_o)~(Bs) d-_(Dmt)G_?~(ib)A_?~(Bs)T_(?OH)和d-_(Dmt)C_?~(An)C_?~(An)T_(?OH)是通过d-_(Dmt)G_?~(ib)A_(?OH)~(Bs)和d-_(Dmt)C_?~(An)C_(?OH)~(An)分别同过量的d-T缩合,然后再用对氯苯磷酰双三唑对产物的3′-OH进行磷酰化得到。d-_(Dmt)A_?~(Bs)G_?~(ib)A_(OBz)~(Bs)则是由d-_(Dmt)A_?~(Bz)G_(?OH)~(ib)同d-A_(OBs)~(Bs)反应得到。在所有的缩合反应中,都采用2,4,6-三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂,缩合产物都以硅胶短往层析分离纯化。除保护的九核苷酸未进行硅胶柱层析纯化之外,各中间片段经硅胶柱层析纯化后的收率都在75%以上。合成的全保护九核苷酸用浓氨水和80%醋酸相继脱去全部保护基后,以DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析(含7M尿素)分离纯化,经去盐后得到d-GATCCTAGA,收率31.7%。产物的5′-OH用~(32)P标记后,同系层析均一,蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后,作电泳-同系层析双向图谱,证明核苷酸排列顺序正确。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅰ.十脱氧核糖核苷酸的化学合成

用片段缩合的方法,化学合成了十脱氧核糖核苷酸 d-_(MMT_r)G~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pG~(Bz)_pT_pC~(An)_pC~(An)_pG~(Bz)。各中间片段及最终产物在脱除全部保护基后,均能定量地为桔青霉磷酸二酯酶酶解,并得到预期的碱基比例。将三苯甲基-纤维素柱运用于带MMTr基片段反应混合液的分离,能使情况简化,为进一步在DEAE-纤维素柱上分离纯化创造有利条件。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅰ.十脱氧核糖核苷酸的化学合成

用片段缩合的方法,化学合成了十脱氧核糖核苷酸d-_(MMTr)G_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)G_p~(Bz)T_p~(Bz)C_p~(An)C_p~(An)G~(Bz*)。各中间片段及最终产物在脱除全部保护基后,均能定量地为桔青霉磷酸二酯酶酶解,并得到预期的碱基比例。将三苯甲基一纤维素柱运用于带MMTr基片段反应混合液的分离,能使情况简化,为进一步在DEAE-纤维素柱上分离纯化创造有利条件。     

多核苷酸的合成与研究——Ⅴ.一种由3′端向5′端延伸的脱氧寡核苷酸的化学合成与抽提分离的新方法

化学合成特定顺序的DNA片段,目前除广泛采用三酯方法外,对二酯方法的合成与分离也作了不少的研究。为了用抽提法制备5′端带磷的片段,有些实验室曾采用三苯甲基苯硫乙醇、三苯甲基对胺基苯酚及三苯基苯胺等来保护5′端磷酸基,但这些磷酸上的保护基脱落条件比较复杂,产物回收也不够理想,抽提分离的片段长度一般在二核苷二磷酸。本文则用DMT选择性地保护5′核苷酸的3′羟基,抽提制备了脱氧二核苷二磷酸dpG~(BZ)pA~(BZ)-ODMT和脱氧四核苷四磷酸dpC~(An)pG~(Bz)pG~(BZ)pA~(Bz)-ODMT片段。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅱ.六脱氧核糖核苷酸的化学合成与抽提分离

用均三甲基苯磺酰氯(M8)作缩合剂,合成了二个六脱氧核糖核苷酸(d-_(MMTr)G_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)G_p~(Bz)和d-_(MMTr)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An))*,脱去保护基后经双向同系层析测定核苷酸排列顺序,完全符合实验设计要求(d-G_pA_pC_pG_pA_pG和d-T_pC_pG_pA_pA_pC)。上述二个带保护基的六脱氧核糖核苷酸合成的每一步,都是采用溶剂抽提方法分离的,大大简化了分离的步骤和缩短了分离的时间,便于脱氧寡核苷酸的大量制备。此法也适用于其他带保护基寡核苷酸的制备,不论其三苯甲基衍生物基团在5′端或3′端(例如d-_pG_p~(Bz)A_(ODMTr)~(Bz))。     

限制性核酸内切酶BamH1的识别顺序 dG_pG_pA_pT_pC_pC 的化学合成

本文报道用硅胶柱层析分离二酯法合成产物的新方法及限制性核酸内切酶BamH 1接头dG_pG_pA_pT_pC_pC 的化学合成。其合成路线是:(1)以溶剂抽提法制备MMTrG_p~(Bz)G_p~(Bz)A~(Bz)-OH,其3'-OH 以磷酸氰乙酯和MSCl 反应磷酸化得到MMTrG_p~(Bz)G_p~(Bz)A_p~(Bz)(Ⅰ);(2)用硅胶分离法制备MMTrT_pC_p~(An)C~(An)-OAC,脱去5'-MMTr 保护基后得HO-T_pC_p~(An)-OAC(Ⅱ);(3)Ⅰ与Ⅱ缩合,脱去保护基后制得dG_pG_pA_pT_pC_pC(图2)。硅胶层析法与抽提法比较,前者有较高的分离效力和速度,并且产品中所含色素较少。硅胶层析法和3'-OH 磷酸化方法的应用,加快了DNA 短片段的合成。     

限制性核酸内切酶BamH1真的识别顺序dG_pG_pA_pT_pC_pC的化学合成

本文报道用硅胶柱层析分离二酯法合成产物的新方法及限制性核酸内切酶BamH1接头dG_pG_pA_pT_pC_pC的化学合成。其合成路线是:(1)以溶剂抽提法制备MMTrG_p~(Bz)G_p~(Bz)A~(Bz)-OH,其3'-OH以磷酸氰乙酯和MSCl反应磷酸化得到MMTrG_p~(Bz)G_p~(Bz)A_p~(Bz)(Ⅰ);(2)用硅胶分离法制备MMTrT_pC_p~(An)C~(An)-OAC,脱去5'-MMTr保护基后得HO-T_pC_p~(An)C~(An)-OAC(Ⅱ);(3)Ⅰ与Ⅱ缩合,脱去保护基后制得dG_pG_pA_pT_pC_pC(图2)。硅胶层析法与抽提法比较,前者有较高的分离效力和速度,并且产品中所含色素较少。硅胶层析法和3'-OH磷酸化方法的应用,加快了DNA短片段的合成。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅱ.六脱氧核糖核苷酸的化学合成与抽提分离

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,合成了二个六脱氧核糖核苷酸(d-_(MMT_r)G~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pG~(Bz)和d-(MMT_r)T_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)),脱去保护基后经双向同系层析测定核苷酸排列顺序,完全符合实验设计要求(d-GpApCpGpApG和d.TpCpGpApApC)。上述二个带保护基的六脱氧核糖核苷酸合成的每一步,都是采用溶剂抽提方法分离的,大大简化了分离的步骤和缩短了分离的时间,便于脱氧寡核苷酸的大量制备。此法也适用于其他带保护基寡核苷酸的制备,不论其三苯甲基衍生物基团在5’端或3’端(例如如d-_pG~(Bz)_pA~(Bz)_(-ODMT_r))。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅲ.十三脱氧核糖核苷酸的化学合成

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,d-_(MMT_r)G~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pG~(Bz)先后同d-_pT_pC~(An)_pC~(An)_(-CA(?))和d-_pG~(Bz)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pA~(Bz)_(OAc)反应,脱去保护基后,在7M尿素柱上分离纯化,最后得到产物脱氧核糖十三核苷酸(d-GpApCpGpApGpTpCpCpG_pGpApA)。因上述两步缩合反应所得到的中间产物带有大量芳香族保护基,增强了寡聚核苷酸对离子交换树脂的吸附,给分离纯化工作造成一定困难。我们发现这些带有保护基的寡聚核苷酸在DEAE-葡聚糖A-25(Cl~-型)柱上,用含有3M尿素和40%乙醇的氯化锂溶液洗脱,可以克服这一困难。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅲ.十三脱氧核糖核苷酸的化学合成

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,d-_(MMTr)G_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)G_p~(Bz)先后同d-_pT_pC_p~(An)C_(OAc)~(An)和d-pG_p~(Bz)G_p~(Bz)A_p~(Bz)A_(OAc)~(Bz)。反应,脱去保护基后,在7M尿素柱上分离纯化,最后得到产物脱氧核糖十三核苷酸(d-G_pA_pC_pG_pA_pG_pT_pC_pC_pG_pG_pA_pA)。因上述两步缩合反应所得到的中间产物带有大量芳香族保护基,增强了寡聚核苷酸对离子交换树脂的吸附,给分离纯化工作造成一定困难。我们发现这些带有保护基的寡聚核苷酸在DEAE-葡聚糖A-25(Cl~-型)柱上,用含有3M尿素和40%乙醇的氯化锂溶液洗脱,可以克服这一困难。     

细胞培养中的支原体污染问题(续)

6.放射性同位素自显影方法可用~(?)H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷或尿嘧啶核苷自显影实验检查支原体的污染。此法的简单原理是:无污染的正常细胞在S期(DNA合成期)可摄取大量的胸腺嘧啶脱氧核苷到细胞核中。而当细胞被污染后,培养液的胸腺嘧啶脱氧核苷被支原体的嘌呤嘧啶核苷磷酸化酶     

多核苷酸合成的研究——Ⅵ.酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-半分子反密码区中CpUpCpC和CpUpUpI的合成

本文报道用化学方法合成了酵母丙氯酸转移核糖核酸5′-半分子中反密码区的CUCC和cuuI两个四核苷酸片段。CUUI的合成路线是由(HO)I~(Bz)(OBz)_2开始,先同_(MMT)U(OBz)-p缩合并脱去5′-MMT后得到_(HO)U(OBz)-p-I_(Bz)(OBz)_2,然后与_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)-p缩合或者与_(MMT)U(OBz)-p和_(Bz)C_(Bz)(OBz)-p依次缩合得到全保护的四核苷三磷酸,最后用NH_3-甲醇溶液脱去保护基并分离纯化得到CUUI。而用_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)-p同_(HO)C_(Bz)(OBz)-p-C_(Bz)(OBz)_2缩合然后脱去保护基并分离纯化则可得到CUCC。反应缩合剂均采用DCC。合成的CUCC和CUUI均能为牛胰核糖核酸酶完全水解得到预期的碱基组成比例。     

多核苷酸合成的研究 Ⅵ.酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-半分子反密码区中CpUpCpC和CpUpUpI的合成

本文报道用化学方法合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸5'-半分子中反密码区的CUCC和CUUI两个四核苷酸片段。CUUI的合成路线是由_(HO)I~(OBz)_2开始,先同_(MMT)U(OBz)-p缩合并脱去5'-MMT后得到_(HO)U(0Bz)-p-I~(Bz)(OBz)_2,然后与_(B(?))C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)一p缩合或者与_(MMT)U(OBz)-p和_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p依次缩合得至4全保护的四核苷三磷酸,最后用NH_3-甲醇溶液脱去保护基并分离纯化得到CUUI。而用_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(0Bz)-p同_(HO)C~(Bz)(OBz)-p-C~(Bz)(OBz)_2缩合然后脱去保护基并分离纯化则可得到CUCC。反应缩合剂均采用DCC。合成的CUCC和CUUI均能为牛胰核糖核酸酶完全水解得到预期的碱基组成比例。     

用改良三酯法合成富集d-A的脱氧十一核苷酸d-AAACCACCATA

本文报道用改良三酯法合成富集d-A的脱氧十一核苷酸片段d-AAACCACCATA。以TPSCl+Te(1:4)为缩合剂进行片段缩合,反应在1～2小时内即可达到完全。Dmt基的脱除采用ZnBr_2/硝基甲烷溶液,几乎没有发现脱嘌呤副反应。最终的合成产物经核苷酸顺序分析证明具有正确的排列顺序。     

多核苷酸合成的研究 Ⅱ.CpUpCp、GpUp和CpUpCpGpUp的合成

本文报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸3’-端茎区顺序中CpUpCpGpUp五核苷五磷酸的合成。_(HO)U(OBz)-p-NHC_6H_5同_(MMT)GA~(AC)(OAc)-p或_(MMT)G~(iBu)(OiBu)-p用DCC缩合再脱去5’-MMT后可分别得到_(HO)G~(Ac)(OAc)-p-U(OBz)-p-NHC_6H_5和_(HO)G~(iBu)(OiBu)-U(OBz)-p-NHC_6H_(50) _(HO)U(OBz)-p-NHC_6H_5同_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p用DCC缩合再脱去3’-末端磷酸的苯胺保护基得到_(Bz)C~(Bz)(OBz)-pU(OBz)-p,此保护二核苷酸再同_(Ho)C~(Bz)(OBz)-p-NHC_6H_5用DCC缩合,然后再脱去3’-末端磷酸的苯胺保护基得到_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)-p-C~(Bz)(OBz)-p。此保护的三核苷酸同_(Ho)G~(Ac)(OAC)-p-U(OBz)-p-NHC_6H_5用DCC缩合,然后脱去3’-末端磷酸的苯胺保护基和全部酰基保护基并经7M尿素柱层析纯化,最后得到自由的五核苷酸CpUpCpGpUp。产物经纸电泳、薄板层析鉴定为均一,用牛胰核糖核酸酶水解后得到预期的核苷酸组成比例。     

多核苷酸合成的研究——Ⅱ.CpUpCp、GpUp和CpUpCpGPUp的合成

本文报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端茎区顺序中CpUpCpGpUp五核苷五磷酸的合成。Hou(OBz)-p-NHC_6H_5同_(MMT)G~(Ac)(OAc)-p或_(MMT)G~(iHu)(OiBu)-p用DCC缩合再脱去5′-MMT后可分别得到_(HO)G~(Ac)(OAc)-p-U(OBz)-p-NHC_6H_5和_(HO)G~(iBu)(OiBu)-U(OBz)-p-NHC_6H_5。_(HO)U(OBz)p-NHC_6H_5同_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p用DCC缩合再脱去3′-末端磷酸的苯胺保护基得到_(Bz)C~(Bz)(OBz)-pU(OBz)-p,此保护二核苷酸再同_(HO)C~(Bz)(OBz)-p-NHC_6H_5用DCC缩合,然后再脱去3′-末端磷酸的苯胺保护基得到_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)-p-C~(Bz)(OBz)-p。此保护的三核苷酸同_(HO)G~(Ac)(OAc)-p-U(OBz)-p-NHC_6H_5用DCC缩合,然后脱去3′-末端磷酸的苯胺保护基和全部酰基保护基并经7世尿素柱层析纯化,最后得到自由的五核苷酸CpUpCp--GpUp0产物经纸电泳、薄板层析鉴定为均一,用牛胰核糖核酸酶水解后得到预期的核苷酸组成比例。     

青天葵大极性化学成分研究

对青天葵的化学成分进行研究,从其90%乙醇提取物的水溶部位中分离得到了十一个化合物,并通过波谱手段对其进行了结构鉴定,分别为:异牡荆苷(1)、牡荆苷(2)、橙皮苷(3)、腺苷(4)、2'-脱氧腺苷(5)、2'-脱氧胸腺嘧啶核苷(6)、2'-鸟嘌呤脱氧核苷(7)、烟酸(8)、核黄素(9)、L-色氨酸(10)和阿魏酸(11)。这十一个化合物均为首次从青天葵中分离得到。     

脑啡肽基因的合成——Ⅰ.d-GATCCTAGA的合成

本文报道了脑啡肽基因下链二十六核苷酸中九核苷酸d-GATCCTAGA的合成。合成系采用改良的三酯法,即先合成和三个片段,然后由脱去5'-Dmt基后依次同和向5'端延伸缩合得到产物和是通过和分别同过量的d-T缩合,然后再用对氯苯磷酰双三唑对产物的3'-OH进行磷酰化得到。则是由同反应得到。在所有的缩合反应中,都采用2,4,6-三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂,缩合产物都以硅胶短柱层析分离纯化。除保护的九核苷酸未进行硅胶柱层析纯化之外,各中间片段经硅胶柱层析纯化后的收率都在75%以上。合成的全保护九核苷酸用浓氨水和80%醋酸相继脱去全部保护基后,以DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析(含7M尿素)分离纯化,经去盐后得到d-GATCCTAGA,收率31.7%。产物的5'-OH用~(32)P标记后,同系层析均一,蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后,作电泳-同系层析双向图谱,证明核苷酸排列顺序正确。     

5—氟尿苷的微生物转化

5 氟尿苷 (简称ＦＵＲ)是抗肿瘤核苷药物脱氧氟尿苷 (Ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ ,简称ＤＦＵＲ)的合成中间体。脱氧氟尿苷是一种抗代谢类抗肿瘤药 ,在体内可以部分转化为氟尿嘧啶 (简称ＦＵ) ,二者具有相似的作用途径和抗肿瘤谱。与ＦＵ相比 ,由于ＤＦＵＲ的抗肿瘤活性高且毒副反应小 ,主要用于治疗晚期结直肠癌和各种类型肝癌。在国内 ,采用化学法合成的ＤＦＵＲ业已进入临床研究阶段[1]采用化学合成法生产ＤＦＵＲ时 ,由于反应过程中需将碱基或核糖残基的部分基团进行保护 ,而且产物为多种核苷异构体和其它副产品的混合物 ,需要进一步分离 ,…