梭梭肌动蛋白基因HaACT1全长的克隆与表达分析

根据本实验已克隆得到的梭梭肌动蛋白基因Ha ACT1部分序列,通过5'RACE技术获得HaA CT1的cDNA全长序列。序列分析表明,该基因c DNA全长序列1 534 bp,其中5'UTR序列为75 bp,3'UTR序列为325 bp,开放阅读框序列为1 134 bp,编码376个氨基酸。该序列与Gen Bank中收录的其它植物Actin基因核苷酸序列的相似性均在84%以上,并且它们的氨基酸序列的相似性达95%以上,Gen Bank登录号为KM886609。根据得到的c DNA序列设计全长引物,进一步克隆了Ha ACT1的基因组DNA序列,由4个外显子和3个内含子组成。利用半定量和绝对荧光定量PCR对Ha ACT1的表达进行分析,发现该基因在梭梭的不同组织及各种非生物胁迫下均能稳定表达,适合作为梭梭中其它功能基因表达研究中的内参基因。     

白桦肌动蛋白(Actin)基因全长cDNA克隆与序列分析

以白桦(Betula platyphylla Suk.)次生木质部为材料,用改良CTAB方法提取总RNA。根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物后进行RT-PCR,并采用RACE技术扩增出Actin基因全长序列。该基因cDNA全长1 785 bp,序列分析表明,该基因编码区1 134 bp,编码377个氨基酸,5′非编码区157 bp,3′非编码区495 bp。所得序列与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性高达96%以上。此基因已在GenBank注册（EU588981）。根据高等植物肌动蛋白相似性构建了进化树,表明白桦肌动蛋白与蓖麻肌动蛋白之间的亲缘关系最为密切,在进化中分化时间最为接近。     

银杏叶绿体petD基因的克隆与表达

根据黑松、云杉、菠菜与玉米叶绿体petD基因序列设计引物,以银杏叶绿体基因组DNA为模板,PCR扩增克隆了银杏叶绿体petD基因（GenBank登录号为DQ923066,命名为GbpetD）的序列。序列分析显示,GbpetD基因组DNA序列编码区长1243bp,含1个内含子和2个外显子,其外显子序列编码177个氨基酸。相似性比对显示,该基因编码区序列与云杉、台东苏铁、黑松、莴苣、木薯、北美落叶松的petD基因核苷酸同源性为84％-99％,氨基酸序列同源性为85％-93％。系统进化树分析结果表明GbpetD蛋白质与黑松、北美落叶松、云杉、苏铁等裸子植物的petD蛋白质聚类关系最近。半定量RT—PCR分析表明,GbpetD基因在银杏叶和茎中表达,在叶中表达量最大。     

茶树肌动蛋白基因（CsActin1）全长cDNA克隆与生物信息学分析

以茶树（Camellia sinensis）萌动芽为材料,根据茶树萌动芽芽抑制消减杂交文库中分离得到的肌动蛋白（actin）基因的5′-片段设计引物,利用3′-RACE技术克隆了其cDNA全长序列,该基因cDNA全长1 470 bp,命名为CsActin1（GenBank登录号HQ235647）。序列分析表明,CsActin1开放阅读框长1 134 bp,编码377个氨基酸,5′非编码区100 bp,3′非编码区236 bp。推测的蛋白质分子量为41.70 kD,等电点约为5.31,具有肌动蛋白家族的特征信号序列（YVGDEAQs.KRG和WIAKaEYDE）和肌动蛋白相关蛋白的特征信号序列（LLTEApLNPkaNR）。CsActin1与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在80%以上,氨基酸序列相似性在95%以上。与其它植物肌动蛋白的进化树分析结果表明,茶树肌动蛋白与杨树的两个肌动蛋白间的亲缘关系最为密切。并对推导的蛋白结构进行了分析。     

谷子肌动蛋白基因的克隆及序列分析

以谷子 (Setariaitalica)为材料 ,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物 ,用 5’RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序 ,序列分析结果表明 :谷子肌动蛋白基因的编码区长 1 1 3 1个核苷酸 ,编码了 3 77个氨基酸 ;所得序列 (命名为MIAc)与GenBank中注册的肌动蛋白基因序列的相似性均在 6 0 %以上 ,与其它肌动蛋白氨基酸序列的相似性达 89%以上。根据高等植物肌动蛋白序列相似性重建了进化树 ,表明谷子肌动蛋白与水稻肌动蛋白异型体RAc2和RAc3之间的亲缘关系最为密切 ,在进化过程中分化时间最为接近     

虾夷扇贝β-actin基因的克隆和序列分析

为进一步研究虾夷扇贝功能基因的表达调控。利用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了健康虾夷扇贝外套膜和肾脏两种组织的cDNA文库。对随机选取的4009个克隆进行5′端测序,比对,筛选出1条β肌动蛋白同源序列,对此EST序列两端进行扩增、测序,得到肌动蛋白基因cDNA全长序列。肌动蛋白基因cDNA全长1536bp(不包括polyA),5′端非编码区84bp,3′端非翻译区321bp,阅读框1131bp,编码377个氨基酸。在基因组DNA中,该基因被一个内含子分为两段,内含子位于第41和第42个氨基酸之间,长度为1498bp。系统发育分析显示该肌动蛋白属于β类型。本研究得到的虾夷扇贝β-肌动蛋白基因可以被用于作为定量某种虾夷扇贝mRNA的标准,这为继续研究虾夷扇贝其它功能基因,及其分子生物的进一步研究、促进其他相关分子发育和系统进化研究奠定了基础。     

来源于Aspergillus candidus的乳糖酶基因的克隆及序列分析

从一株产乳糖酶的亮白曲霉(Aspergillus candidus)中克隆到了乳糖酶基因组DNA及cDNA序列(EMBL ACCESSION No. AJ431643),序列分析表明,乳糖酶基因组DNA序列长3458bp,其中含有8个内含子,cDNA编码区长3015bp,共编码1005个氨基酸,前19个氨基酸为信号肽序列,氨基酸序列中共含有11个潜在的糖基化位点。将此基因与不同来源的乳糖酶基因序列进行比较发现,该基因与绝大多数乳糖酶基因同源性较低。虽与米曲霉ATCC 20423的乳糖酶序列同源性较高,但其在酶学性质上更优于后者,亮白曲霉的乳糖酶基因可能是一个具有更广阔的生产应用前景的新基因。      

谷子肌动蛋白基因的克隆及序列分析

以谷子（Setaria italica）为材料,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物,用5'RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序,序列分析结果表明：谷子肌动蛋白基因的编码区长1131个核苷酸,编码了377个氨基酸;所得序列(命名为MIAc)与GenBank中注册的肌动蛋白基因序列的相似性均在60%以上,与其它肌动蛋白氨基酸序列的相似性达89%以上。根据高等植物肌动蛋白序列相似性重建了进化树,表明谷子肌动蛋白与水稻肌动蛋白异型体RAc2和RAc3之间的亲缘关系 最为密切,在进化过程中分化时间最为接近。     

甜菜胞质型谷氨酰胺合成酶基因组DNA的克隆

以甜菜叶片为材料,用CTAB法提取基因组DNA.以分段PCR法扩增得到了完整的甜菜胞质型谷氨酰胺合成酶(GS1)基因组DNA.采用RT-PCR法扩增此GS1基因(GS1)的cDNA序列应用于对照.获得了长度为9 606bp的完整的GS1 DNA序列和长度为1 068 bp的GSI cDNA序列.分析GS1基因组DNA序列表明,它包含13个外显子,被12个内含子分隔开.其外显子区与已公布的GS1 mRNA序列的相似性达99.5%.RT-PCR法获得的cDNA序列与已知的GS1 mRNA序列相似性达99.6%.而2次实验中GS1基因组DNA外显子区与GS1 cDNA序列的相似性达99.9%.GenBank登录号为EU370974.     

滨梅2个肌动蛋白cDNA片段的克隆与表达

目的:克隆耐盐碱果树滨梅的肌动蛋白基因actin,为该物种优异性状基因的功能鉴定提供内参.方法:利用一对actin简并引物克隆滨梅actin cDNA片段,对其进行序列和表达分析.结果:得到2条743 bp的cDNA片段,两条核苷酸序列相似性为82％,命名为PmAct1和PmAct2并在GenBank登录(分别为JX855160和JX855161);序列比对发现2条actin片段氨基酸序列与其他植物同源性均在96％以上;根据不同果树Actin相似性构建进化树,表明2个滨梅actin明显分为两种类型,但均与蔷薇科果树亲缘关系较密切;半定量RT-PCR表达谱发现PmAct1可能为组成型表达类型,而PmAct2特异地在根和叶组织中表达量较高.结论:首次获得了2个滨梅actin基因,为该物种其他功能基因的挖掘和表达分析奠定了基础.