人源核受体hLRH-1 的表达纯化及多克隆抗体制备

目的：制备抗人源核受体hLRH-1 的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础。方法：构建含有hLRH-1基因全长克隆的 原核表达载体pET507a-hLRH-1 并用IPTG 诱导其在Rosseta2 菌株中表达重组蛋白His-hLRH-1,经亲和层析纯化后按常规方法 免疫新西兰兔制备多克隆抗体,并用Western Blot 对其特异性进行鉴定。结果：原核表达载体pET507a-hLRH-1经测序证实构建 成功,将其转化大肠杆菌Rosseta2菌株后成功诱导表达重组蛋白His-hLRH-1,经纯化免疫新西兰兔后得到抗hLRH-1 多克隆抗 体,Western blot 证实抗体具有高度特异性。结论：成功表达His-hLRH-1 重组蛋白并制备出多克隆抗体,为进一步用于hLRH-1 的 免疫学检测及其功能研究奠定了基础。     

棉铃虫(Helicoverpa armigera)FK506结合蛋白基因的克隆、表达与纯化

为了深入了解FK506结合蛋白基因的作用和探索调控棉铃虫CYP6B6的表达机制,基于单酵母杂杂交结果采用RT-PCR的方法从棉铃虫的中肠cDNA中扩增得到了FK506结合蛋白基因,将测序正确的目的片段克隆至原核表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21中用异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导表达,通过镍柱离子亲和层析纯化目的蛋白。用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达和纯化结果,并用Western blotting进行验证。结果表明,克隆得到的目的基因大小为327 bp,编码108个氨基酸残基,预测蛋白质分子量和等电点分别是11.78 kD和7.87。氨基酸序列分析表明该序列具有完整的开放阅读框,且没有信号肽。重组质粒pET32a-FKBP在大肠杆菌BL21中获得表达,主要以可溶性形式存在,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,Western blotting检测发现纯化的目的蛋白大小正确且纯度高。     

人Neuritin在原核表达系统的构建及表达纯化

Neuritin是一种新发现能促进神经突起和轴突分支的蛋白,为了更清楚的研究它的生物学功能,我们在已克隆Neuritin cDNA的基础上, PCR扩增出Neuritin ORF,与原核表达载体pET32a重组后,成功的构建了Neuritin原核表达质粒pET32a-Neuritin。重组质粒转化BL21大肠杆菌, IPTG诱导后,表达产物用SDS-PAGE 和Western blot证实系Neuritin,用镍离子亲和层析的方法获得了纯化的Neuritin蛋白。     

人钙周期蛋白结合蛋白（hCacyBP）基因的克隆与表达

筛选cDNA文库得到了人的钙周期蛋白结合蛋白基因 ,将此基因的全编码区克隆到原核表达载体pET2 8上 ,诱导目的蛋白质表达以后将重组蛋白质用亲和层析的方法进行纯化 ,得到了纯度很好的重组的目的蛋白质 ,以此作为抗原免疫动物 ,得到抗钙周期蛋白结合蛋白的特异多克隆抗体。Western印迹的结果表明 ,该基因在小鼠多种组织中广泛表达 ;免疫组化的结果表明 ,BT32 5细胞诱导分化后钙周期蛋白结合蛋白分布有变化 ,由分布于胞质中转向分布于胞核和核周胞质     

沙门菌毒力基因spvB的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建沙门菌毒力基因spvB的原核表达载体,诱导表达纯化SpvB蛋白并以其为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗体。方法:利用生物信息学软件对SpvB进行分析,选取抗原性较高、易表达的氨基酸序列作为克隆序列,以携带spvB基因的鼠伤寒沙门菌为模板,PCR扩增目的片段后与原核表达载体pET28a(+)连接;将质粒pET28a-SpvB转化大肠埃希菌BL21(DE3)后诱导表达并纯化。目的蛋白免疫小鼠,制备抗SpvB多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性。结果:成功构建spvB原核表达载体,经IPTG诱导结果显示,重组蛋白表达且主要存在于包涵体中,将纯化后的蛋白免疫小鼠Western blot检测血清中抗体与SpvB特异性结合。结论:获得具有免疫原性的SpvB蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

重组人FOXL2基因的原核表达和纯化研究

目的通过pET32a（＋）原核表达载体,表达重组人叉头框蛋白L2（human forkhead box12,FOXL21）。并且进行纯化和鉴定。方法从正常人血液中提取基因组DNA,利用PCR扩增FOXL21目的基因片段,构建FOXL21原核表达重组质粒[pET32a（＋）-FOXL21]并转化E．coli的BL21（DE3）菌株,IPTG诱导重组蛋白表达,经HisTrap FF亲和层析柱纯化,再通过SDS—PAGE和Western印迹鉴定。结果成功克隆到大小为1131bp的人源FOXL21基因片段并准确插入表达载体pET32a（＋）,0．1mmol／LIPTG诱导转化菌8h可表达大量的FOXL21蛋白,并可经HisTrap FF柱亲和层析得到高度纯化。结论成功获得纯化的66kD重组人FOXL21蛋白,为后续进行FOXL21蛋白的功能研究奠定了基础。     

跨膜逆向转运蛋白NHXFS1多克隆抗体的制备及应用

NHXFS1基因是通过DNA家族改组（DNA family shuffling）技术,以拟南芥、水稻和菊花的液泡膜Na＋/H＋逆向转运蛋白基因（NHX1）为亲本获得的活性显著增强的新基因。为制备该蛋白的多克隆抗体,对该蛋白进行跨膜结构分析,选取跨膜蛋白的C末端为靶标,并将其克隆到原核表达载体pET32a中,成功构建了原核融合蛋白pET32a-NHXFS1-抗原表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。通过镍柱亲和层析纯化该融合表达蛋白,获得了纯度约为80%的纯化蛋白,用于免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。ELISA实验表明,该抗体的效价达到1：128 000,提取表达NHXFS1蛋白的酵母液泡经该多克隆抗体Western blot检测,证明该抗体具有较好的NHXFS1蛋白特异性。NHXFS1多克隆抗体的制备为进一步认识NHXFS1新蛋白结构与功能以及植物耐盐分子生物学的研究奠定了基础。     

冠状病毒HcoV-229E S1蛋白的原核表达及鉴定

目的克隆表达冠状病毒HcoV-229E S1基因片段,表达S1蛋白。方法合成冠状病毒HcoV-229ES1蛋白特异性基因片段并克隆入pET21a原核表达载体,转化BL21（DE3）菌,经IPTG高效诱导表达得到重组蛋白,用金属螯合亲和层析纯化,并通过Western blot对表达的重组蛋白进行鉴定。结果获得了主要以包涵体形式存在的目的蛋白,Western blot鉴定其为S1基因片段蛋白。结论成功构建了HcoV-229E S1蛋白的表达载体,并在BL21（DE3）中得到了高效表达,为下一步表达蛋白免疫原性及疫苗抗病毒保护性测定打下了基础。     

树鼩IgE高亲和力受体α亚基的原核表达、抗体制备及鉴定

目的:原核表达树鼩IgE高亲和力受体α亚基(FcεR1α)并制备抗体,为研究树鼩过敏反应动物模型奠定基础。方法:提取树鼩肝脏及脾脏组织RNA,用巢式PCR法扩增树鼩FcεR1α基因,连接至pMD-19T载体后进行DNA测序,将测序正确的目的片段与表达载体pET30a(+)连接,构建重组表达质粒,转入表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化;将纯化的蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;Western印迹检测多克隆抗体的特异性,ELISA检测多克隆抗体的效价。结果:调取了树鼩FCεRIα基因,并将该序列去信号肽的胞外结构(第26～213氨基酸)构建到pET30a(+)载体上,通过IPTG诱导表达并纯化了FCεRIα蛋白,蛋白纯度在90%以上。ELISA效价检测结果表明免疫动物制备的多克隆抗体效价为100 000,且该抗体能够检测到真核细胞表达的树鼩IgE FCεRIα蛋白。结论:在大肠杆菌中表达并纯化获得树鼩FcεRIα,免疫动物制备了多克隆抗体。     

弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白的融合表达和纯化

目的：原核表达重组弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为其功能研究奠定基础。方法：用PCR方法从弗氏2a志贺氏菌2457T株染色体中扩增YciD蛋白编码序列,经过纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,构建重组载体pET32a-yciD,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得工程菌株,对其表达和纯化条件进行优化;利用Western Blot检测融合蛋白的表达。结果：构建了YciD蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;经Ni-NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的YciD蛋白;Western Blot表明,此蛋白可与His标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为进一步对其进行功能研究奠定了基础。     

APOBEC3G蛋白的原核表达及纯化

目的：原核表达重组APOBEC3G蛋白,为其功能及免疫原性研究奠定基础。方法：提取H9细胞全细胞基因组RNA,通过RT-PCR获得目的基因,经纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,并对表达条件和纯化条件进行优化;利用Western Blot分析鉴定目的蛋白。结果：构建了APOBEC3G蛋白的原核表达载体Apo-His-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性蛋白形式存在;经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,获得了高纯度的重组APOBEC3G蛋白,蛋白浓度可达1．2mg／mL;Westem Blot显示获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化了可溶性APOBEC3G蛋白,为进一步对其进行免疫原性和功能研究奠定了基础。     

人胱硫醚β合成酶原核表达纯化及鉴定

目的：构建人胱硫醚β合成酶（human cystathionineβ-synthase,hCBS）基因原核表达载体,在E.coli BL21（DE3）中表达,并进行纯化和酶活性检测。方法：以胰腺细胞cDNA文库为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增hCBS基因蛋白编码区的全序列,克隆入原核表达载体pET32a（＋）,构建重组质粒pET32a（＋）-hCBS。经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因后与人CBS基因（基因bank号：BT007154.1）完全一致,转入E.coli BL21（DE3）中,由IPTG诱导表达融合蛋白。结果：经SDS-PAGE、Western blot分析,证明诱导表达的蛋白为重组人CBS（rhCBS）。再由Ni-NTA树脂亲和层析,并脱盐冷冻干燥后获得重组rhCBS（约19 mg/L培养物）,并测得其比活力约为57 kU/g。结论：成功地表达纯化出具有功能活性的重组蛋白rhCBS,为进一步研究该酶的相互作用蛋白以及其在生物学和临床科学的作用奠定了基础。     

肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中的表达及应用研究

目的:克隆、表达和鉴定肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)P1蛋白羧基端基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法 在成功克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段并测序的基础上,将基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/P1(3 520~4 563bp),转化大肠杆rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni^2＋亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用ELISA和Western blotting方法检测其抗原性。重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体。结果 重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,蛋白质纯度达95％以上。ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。并成功获得两株高效价单克隆抗体。结论:本研究成功克隆和表达了肺炎支原体P1蛋白羧基端基因序列,制备了抗肺炎支原体P1蛋白单克隆抗体,为肺炎支原体诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。     

白喉毒素无毒突变体CRM197基因的克隆与表达

目的构建白喉毒素(Diphtheria toxin)无毒突变体CRM197(Cross-reacting materials 197)的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法以白喉杆菌(ATCC39255)基因组DNA为模版,采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增CRM197基因,插入表达载体pET11b中,构建重组原核表达质粒pET11b-CRM197。经双酶切及测序鉴定正确后,重组质粒被转化入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,结果表明与预期一致;表达的重组蛋白相对分子质量约58 000,并可与鼠抗CRM197单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组原核表达载体pET11b-CRM197,重组的CRM197蛋白在大肠杆菌中得到了表达,为以该重组突变体作蛋白载体制备结合疫苗奠定了基础。     

片球菌素pediocin PA-1基因在大肠埃希菌中的融合表达

目的构建编码细菌素pediocin PA-1基因片段的原核表达载体,诱导表达,鉴定表达产物。方法重组DNA技术构建原核表达载体pET32-papA,IPTG诱导表达,用金属亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE与Westernblot对表达的重组蛋白进行鉴定。结果双酶切和测序鉴定显示papA片段插入正确,诱导表达后获得分子量为19 kD的融合蛋白,表达量为25%,用金属亲和层析的方法获得纯化的片球菌素pediocin PA-1。结论papA基因片段编码的蛋白质能在原核细胞中正确表达,为下一步研究该功能域的生物活性奠定了基础。     

HIV-1 Vpu蛋白的原核表达、鉴定和纯化

目的：克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）Vpu蛋白,为其功能及免疫学研究奠定基础。方法：PCR扩增Vpu基因,纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,免疫印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化蛋白。结果：构建了HIV-1Vpu蛋白的原核表达载体Vpu-pET32a,并在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白呈可溶性形式存在,免疫印迹检测显示为目的蛋白,经Ni—NTAAgarose纯化获得了高纯度的目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达了可溶性HIV-1Vpu蛋白,为进一步进行HIV-1Vpu蛋白的免疫原性和功能研究奠定了基础。     

铜绿假单胞菌LexA蛋白的纯化及免疫活性分析

目的：对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的LexA蛋白进行表达、纯化,并检测其免疫活性。方法： lexA基因片段插入表达载体pET32a(+),在E.coli BL21(DE3)中表达。包涵体经洗涤并用8M尿素溶解,镍离子亲合柱层析为第一步纯化,Superdex 75凝胶过滤层析作为第二步精细纯化,HPLC测定蛋白的浓度,将纯化的LexA蛋白经注射途径免疫家兔,制备兔抗LexA血清,采用免疫双扩、ELISA及Western Blot分析LexA的免疫活性。结果：LexA以包涵体形式表达,经镍离子亲合柱层析和凝胶过滤层析二步组合纯化目的蛋白,经HPLC测定目的蛋白的最终纯度为98.97%,表达及纯化的LexA具有良好的免疫活性。     

金黄色葡萄球菌isdb基因的克隆表达及其小鼠免疫试验

为了研究金黄色葡萄球菌表面Isdb蛋白的免疫原性,应用PCR方法扩增出金黄色葡萄球菌Wood46株的isdb 基因并进行序列分析,再将isdb 基因插入到pET32-a(+) 载体上,构建了pET32-a(+)-isdb重组质粒,将重组质粒转化到宿主菌大肠埃希菌BL21中并诱导表达和纯化Isdb蛋白。用纯化的Isdb蛋白免疫小鼠,检测小鼠血清中抗体水平;在二次免疫之后的第2周,用金黄色葡萄球菌Wood46、HLJ23-1株对小鼠攻毒,每组8只小鼠。研究结果发现：isdb基因在不同菌株中高度保守;Isdb蛋     

抗山羊ΔfosB基因表达产物抗体的制备及应用

ΔfosB是fosB基因的自然截短型,稳定存在于许多组织中,在脂肪细胞和成骨细胞的形成和分化中起到重要作用。ΔFosB蛋白可能与钙在骨和乳腺中的代谢有关,并且调控钙从骨向乳腺转移的信号通路。将奶山羊的ΔfosB基因亚克隆到pET32a载体得到pET32a-ΔfosB原核表达载体,IPTG诱导其在大肠杆菌中表达,纯化融合蛋白免疫兔子制备多克隆抗体。ELISA检测显示抗体效价达1:51200,Western blotting结果显示制备的抗体能特异性检测原核表达的ΔFosB蛋白以及在HEK-293细胞中表达的ΔFosB蛋白。进一步的组织差异表达检测表明ΔFosB在山羊的乳腺、骨髓、脑髓、肌肉、心脏、肝和肺组织中均有表达。