无绿藻PCR ITS1-ITS2基因分型法的建立及应用

目的建立无绿藻(Prototheca)PCR ITS1-ITS2基因鉴定分型方法,并通过系统发育树以研究各型别无绿藻菌株间的亲缘关系。方法抽提5株无绿藻临床分离菌株的DNA,通过特异性引物扩增ITS1及ITS2区后,根据该区域核苷酸片段的差异进行基因分型,借助MEGA6.0软件建立系统发育树,并通过SSU rDNA测序加以验证。结果 5株菌株中,1株鉴定为P.zopfii hydrocarbonea,2株鉴定为P.wickerhamii。虽然由于数据库中缺乏P.zopfii portoricensis菌株ITS序列导致1、2号菌株不能被鉴定,但ITS区系统发育树中这两株菌仍被归为P.zopfii中独立的一簇,与SSU rDNA系统发育树相近,证明此分型方法无误。结论 PCR ITS1-ITS2基因分型法可作为一种有效基因分型方法用于鉴定和监测无绿藻感染。     

昆诺阿藜链格孢叶斑病病原及其生物学特性

为明确昆诺阿藜链格孢叶斑病病原,在山西省昆诺阿藜种植区采集典型症状的标本分离病原菌,选择代表性菌株LGB-b和LGB-h对其形态学、分子生物学、致病性及生物学特性进行了研究。综合形态学和多基因系统发育(Alt a 1、endoPG 和OPA10-2)分析,确定昆诺阿藜链格孢叶斑病病原为Alternaria alternata。致病性测定发现接种6 d后病斑呈灰绿至黄绿色,表面具有灰棕至灰褐色霉层,周围具黄绿色晕圈,与田间症状基本一致。菌株LGB-b和LGB-h均可侵染昆诺阿藜、藜和台湾藜。菌株LGB-b菌丝生长的最适培养基为V8 蔬菜汁琼脂培养基(V8)、温度为25-30 ℃、水活度≥0.98、pH为6-7;分生孢子萌发的最适水活度≥0.98、pH为6-7。菌株LGB-h菌丝生长的最适培养基为马铃薯胡萝卜琼脂培养基(PCA)、温度为20-25 ℃、水活度≥0.98、pH为6-7;分生孢子萌发的最适水活度≥0.98、pH为7-8。     

菠萝蜜黑腐病病原菌的形态学与分子鉴定

为明确菠萝蜜黑腐病的病原菌和分类地位,本研究从海南保亭地区采样,经过田间调查、菌株分离纯化和致病性鉴定,以形态学特征为基础,结合病原菌的ITS序列和EF1-α序列,联合两基因建立系统发育树,最终鉴定该病害的病原.结果 显示:病原菌LTHD006菌丝生长速度快,初期白色絮状,较薄,后期菌丝开始变黑,菌落也开始致密,且与Lasiodiplodia theobromae (ID:CBS175.26)聚为一个分支,支持率为100％,最终将菠萝蜜黑腐病的病原菌鉴定为可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae).该病害在国内为首次简略报道,研究结果为菠萝蜜黑腐病发病规律和防治的进一步研究提供理论基础.     

1株产纤维素酶木霉菌种的鉴定

对自行筛选分离的1株木霉菌进行形态学及分子生物学鉴定。采用CTAB法抽提其基因组总DNA,利用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增菌株rDNA ITS区序列,扩增产物纯化后进行测序。测序结果在GenBank中进行同源性搜索,并下载部分具有代表性种的ITS序列,利用软件MEGA4构建分子系统发育树,通过序列分析,并结合形态学鉴定该菌属于半知菌亚门,丝孢纲,丛梗孢目,木霉属,康宁木霉(Trichoderma koningii)。     

基于ITS条形码序列的刺桐姬小蜂分子鉴定

【目的】刺桐姬小蜂Quadrastichus erythrinae Kim体型小,传统的形态学鉴定方法难以快速准确识别。【方法】本研究测定了刺桐姬小蜂的rDNA ITS1和ITS2序列,根据18S rDNA部分序列,利用MEGA的最大相似法(Maximum Likehood)构建系统发育树。根据刺桐姬小蜂ITS1和ITS2序列设计了特异引物,应用特异引物对单只刺桐姬小蜂进行PCR扩增,可稳定地扩增出明显的目的DNA条带。【结果】研究表明,基于ITS基因的DNA条形码技术可以用于刺桐姬小蜂的快速准确鉴定。【结论】因此,采用ITS1和ITS2区的特异性引物可对刺桐姬小蜂进行快速分子鉴定。     

非洲哈茨木霉LMNS-M9的鉴定、生物学特性及其对藜麦的促生作用

【背景】藜麦作为风靡全球的功能性食品,其种子内生非洲哈茨木霉的研究尚未见报道。【目的】从藜麦种子中筛选出有抑菌活性的内生真菌,分析其抑菌和促生作用。【方法】通过形态学及ITS、tef1和rpb2基因序列等方法对筛选出的内生真菌进行鉴定;采用平板对峙和平板倒扣等方法测定内生真菌的抑菌活性;利用盆栽试验测定内生菌株对藜麦生长的影响。【结果】综合形态学特征和系统发育分析结果,确定菌株LMNS-M9为非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)。30℃、pH 5.0和镁离子适宜菌株LMNS-M9菌丝生长和产孢;葡萄糖、乳糖、蛋白胨、磷酸二氢钾适宜菌株LMNS-M9菌丝生长;葡萄糖、硝酸铵、磷酸氢二钾适宜菌株LMNS-M9产孢。菌株LMNS-M9对Botrytis cinerea、Ascochyta caulina、Fusarium citri、Alternaria alternata和Trichothecium roseum的抑制率分别为12.53%、51.96%、52.38%、59.25%和62.04%,挥发物的抑制率分别为35.86%、61.54%、33.33%、41...     

不同品系杜氏藻的多相特征研究

杜氏藻(Dunaliella)是一类独特的嗜盐单细胞真核微藻, 为对该藻不同地理来源各品系间的特征进行总结及分类鉴定, 挖掘特色品系, 研究搜集国内外20株不同品系的杜氏藻, 利用PCR扩增内部转录间隔区(ITS)和细胞色素C氧化酶(cox2-3)基因, 生物信息学软件构建系统发育树对其进行分子鉴定; 形态学方法对其显微结构进行观察, 利用生理生化研究方法对杜氏藻盐胁迫下的4个代表性指标(最大光合效率、中性脂含量、β-胡萝卜素含量和3-磷酸甘油磷酸酶活性)进行了测定。结果表明, 20株供试藻均属杜氏藻属, ITS和cox2-3的系统发育结果相似, 均聚为两大簇, 各品系间亲缘关系较为接近; 成熟期的D13细胞最大, D14细胞最小并呈长颈形, 颜色以绿色或黄绿色为主, 鞭毛和眼点各异; D6和D10生长周期短, D18耐盐性最强; D7最大光合效率最高, D6和D18中性脂干重最高, D11的β-胡萝卜含量最高, D7的3-磷酸甘油磷酸酶活性最强。研究结果可为国内外杜氏藻资源的分类鉴定、特色资源的保护、开发与利用奠定基础。     

紫芝蛛网病病原菌鉴定及其生物学特性

2021年6月,广西南宁一紫芝培养基地出现疑似蛛网病危害。为明确引起紫芝蛛网病的病原菌,采用组织分离法对病样进行分离纯化,利用多位点基因(ITS,RPB2,TEF1)系统发育学分析、形态学特征观察和致病性测定对分离纯化后的菌株进行鉴定,并开展病原菌的生物学特性研究。明确引起广西南宁紫芝蛛网病的病原菌为凸出枝葡霉Cladobotryum protrusum。该菌菌丝生长的最适培养基为PDA,最佳碳、氮源分别为可溶性淀粉和酵母粉,最适生长温度为25℃,pH为6,黑暗有利于菌丝生长。这是首次报道由C. protrusum引起的紫芝蛛网病。     

苹果园鳞翅目夜蛾科DNA条形码鉴定

为了检验DNA条形码在鳞翅目夜蛾科蛾类鉴定中的可行性,本文对采自北京昌平苹果园内的夜蛾科14种71头蛾类标本分别提取了DNA,并扩增了线粒体cox1及核基因28S,利用系统发育树、遗传距离、阈值等方法进行了鉴定和比较分析。同时,检验了目前BOLD系统的鉴定成功率。实验表明,基于cox1基因和BOLD系统的鉴定成功率达到了100%,而基于28S则很低,为64.8%。用不同方法构建的系统发育树,鉴定结果均相同。93%的种内遗传距离小于1%,94%的种间遗传距离为大于3%,种内种间的遗传距离形成明显的3%阈值现象。     

云南常见药用石斛DNA条形码筛选

选择云南省内常见的12种药用石斛，采用分子生物学鉴定技术筛选其适用的DNA条形码序列。以12种药用石斛共36个样品为材料，提取样品总DNA，对核基因片段ITS和ITS2、叶绿体基因片段psbA-trnH和matK序列进行扩增、测序，结合GenBank下载部分石斛序列；利用生物信息学软件进行序列分析和系统发育分析。结果表明，4条序列扩增和测序成功率均为100%；4条序列没有明显的Barcoding Gap，但ITS序列与ITS2序列的种内和种间重叠部分较少，有偏向两端的趋势；系统发育树显示，ITS和psbA-trnH序列能成功区分12种云南常见的药用石斛，ITS2序列未能区分长距石斛(Dendrobium longicornu)和矮石斛(D. bellatulum)，matK序列仅区分6种石斛。建议以ITS和psbA-trnH序列作为云南药用石斛鉴定序列，为药用石斛的种源鉴定提供理论依据。     

云南芒果采后炭疽病病原菌的鉴定及室内生防菌的筛选

随着对云南芒果需求量的增加,其种植面积日趋扩大,并不断引入新品种,这也导致云南省芒果炭疽病害发生日趋加重。为了有针对性地开展芒果炭疽病的生物防治,采用组织块分离法分离芒果采后炭疽病病原菌,通过形态学观察初步鉴定,并遵循柯赫氏法则对病原菌进行验证。随后,利用rDNA-ITS序列和系统发育树分析明确病原菌的分类学地位。最后,采用5种生防细菌对病原菌进行拮抗试验。通过对芒果采后炭疽病病原菌进行分离鉴定,确定胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)是引起云南芒果采后炭疽病的病原菌,该菌株内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列长度为536 bp,登录号为MH744668;5株生防细菌对芒果炭疽病病原菌都有一定的抑菌作用,具有较好的生防开发潜能,其中抗生素溶杆菌L-44的抑菌效果最好,抑制率达53.7%。研究结果为云南省芒果采后病害的生物防治提供了新的思路。     

1株产漆酶白腐真菌的筛选和鉴定

从不同的生境采集生物样品,利用Bavendamm反应反复筛选产漆酶的白腐真菌。利用真菌通用引物对ITS1/ITS4扩增菌株rDNAITS区序列,对扩增产物进行测序。测序结果在GenBank中进行同源性搜索,下载部分具有代表性种的ITS序列进行序列比对,利用软件MEGA4构建分子系统发育树,通过序列分析,并结合形态学鉴定出4220为香栓孔菌(Trametes suaveolens)。     

米尔顿姬小蜂rDNA ITS1和ITS2的序列分析及其分子鉴定

本研究测定了米尔顿姬小蜂Anselmella miltoni Girault的rDNA ITS1和ITS2序列,以探讨其分子鉴定方法。米尔顿姬小蜂的ITS1和ITS2侧翼区（18S和5.8S）序列相对稳定,ITS1和ITS2序列存在种间差异。根据18S rDNA部分序列,利用DNAMAN的Maximum Likelihood方法构建了与膜翅目其它科的系统发育树。根据米尔顿姬小蜂ITS1和ITS2序列设计了特异性引物,应用特异性引物对样品进行了PCR扩增,扩增效果理想,采用上述特异性引物可从单头米尔顿姬小蜂稳定地扩增出明显的目的DNA条带。因此,可以采用ITS1和ITS2区的特异性对米尔顿姬小蜂进行快速的分子鉴定。     

南美蟛蜞菊霜霉病病原鉴定及系统发育分析

[目的]为从天敌病原生物方面探索外来入侵植物南美蟛蜞菊的生物防治,对新发现的南美蟛蜞菊霜霉病进行病原鉴定和系统发育分析。[方法]在广东省广州市对南美蟛蜞菊霜霉病的发生及危害情况进行调查,并通过病害症状识别、病原显微形态记录与比较、病原菌及其近似种ITS序列结构比较、LSU序列和ITS序列系统发育分析,对南美蟛蜞菊霜霉病病原进行鉴定和系统发育分析。[结果]南美蟛蜞菊霜霉病在广州零星发生,但该病害在华南农业大学校园内发生较严重,发病率达50%~70%,病情指数为30~35。经鉴定,其病原菌为南美蟛蜞菊单轴霉,是国内一新记录种。基于病原菌LSU序列和ITS序列的系统发育分析显示,侵染菊科植物的单轴霉属菌种聚在一个分枝,亲缘关系密切,与侵染其他不同科寄主植物的单轴霉亲缘关系较远。ITS序列结构比较显示,寄生于菊科向日葵族植物的单轴霉属菌种的ITS2区包含多个重复序列,不同菌种间的ITS2区重复序列相似度不同,说明侵染菊科向日葵簇植物的单轴霉属菌物可细分成多个种,而不是只有向日葵单轴霉。[结论]广州发生的南美蟛蜞菊霜霉病是该寄主上首次正式报道的病害,鉴定的病原菌也是国内一新记录种;寄生在菊科植物上的单轴霉属种类不尽相同,但亲缘关系紧密。     

桑黄真菌分子鉴定及遗传多样性分析

药用真菌桑黄具有明显的抗肿瘤、抗氧化、增强免疫等药理活性,但研究者对其基源还没有达成共识,多种Phellinus属真菌被当作桑黄入药使用。采用rDNA ITS序列分析技术,对桑黄真菌进行分子鉴定及遗传多样性分析。通过rDNA ITS序列分析,成功鉴定出一份混淆样品(Phellinus spp-04),并将中国主要使用的桑黄真菌明确鉴定为P.baumii和P.linteus两种,未检测到P.igniarius的使用。依据rDNA ITS序列计算遗传距离并构建系统发育树,结果表明3种主要桑黄真菌存在明显的遗传分化,在系统发育树中明确聚为3个独立菌种类群。在3种桑黄真菌rDNA ITS序列中,存在颠换、转换及插入/缺失3种类型的变异位点,分别在P.linteus、P.baumii和P.igniarius中鉴定出9、9、8种rDNA ITS单倍型序列,不同单倍型菌种间遗传分歧度变化表现出明显的物种差异性。     

ITS鉴定真菌病原:一例司法鉴定研究实例

本研究选择一例疑似空气污染物伤害松树的司法鉴定案作为研究实例,在现场勘察和初步形态鉴定的基础上,应用ITS序列分析鉴定了对疑似空气污染物伤害松树的病原做了分子鉴定。我们对委托鉴定的疑似空气污染物伤害松树的地及周边地区进行了勘查,现场勘查结果并不支持空气污染物伤害松树的看法。为明确松树枯死的原因,对取样病枝上的疑似病原物进行了显微镜观察和培养性状观察,根据显微镜下孢子的形态和病原菌的培养性状,初步判断导致马尾松枯死的病原可能为拟盘多毛孢属(Pestalotipsis)真菌。为进一步确定病原种类,我们应用分子生物学技术对危害马尾松的病原物进行了ITS分子鉴定。测定了疑似真菌的ITS序列,并进行了比对和系统发育分析。研究结果表明,导致松树枯死的病原菌系韦司梅拟盘多毛孢(Pestalotipsis vismiae)。在本研究案例中,利用真菌ITS序列的系统发育分析,快速、准确地鉴定了真正导致松树枯死的病原,为今后类似司法鉴定案件审理提供了证据鉴定的新手段。     

基于ITS序列分析仲彬草属植物的亲缘关系

以旱雀麦为外类群,用PAUP 4.0b10软件并采用最大简约法和邻接法对11份仲彬草属物种的ITS区序列进行系统发育分析,两种方法得到的系统发育树基本一致。结果表明:(1)整个ITS序列长度变异范围为596~601 bp;G C含量在所有ITS中的变化范围为61.20%~62.44%;序列间的遗传分化距离为0.003~0.033,平均值为0.015;(2)疏花仲彬草和塔克拉干仲彬草2个物种聚为一支,位于系统发育树的底部,在最大简约法和邻接法分析中分别获得78%和82%的自展支持率,它们之间的亲缘关系较近;(3)形态相似、地理分布一致的物种有聚在一起的倾向,表现出较近的亲缘关系;(4)ITS区序列分析的结果与细胞学、形态学的研究结果基本一致,因此ITS区序列分析能反映仲彬草属种间关系。     

用于灵芝属10个物种快速鉴定的DNA条形码筛选与验证

灵芝栽培品种常出现同名异物或同物异名的现象,依赖于灵芝的形态学特征鉴定物种的传统分类方法不足以鉴定物种的种间和种内差异。为开发简便而准确的分子水平灵芝属物种鉴定方法,以常用于种属鉴定的核糖体内转录间隔区（ITS）、微管蛋白基因（β-tubulin）片段、大亚基核糖体DNA(LSU)片段和基因编码RNA聚合酶Ⅱ第二大亚基（RPB2）片段4个DNA条形码,对灵芝属10个物种的44份菌株进行PCR扩增和测序,比较4个条形码的扩增成功率和变异率,根据种内、种间遗传距离差异分析筛选特异性的DNA条形码间隔（DBG）,并利用单独及联合条形码构建系统发育树验证筛选的DBG鉴定灵芝属物种的准确性。研究结果表明：β-tubulin和LSU片段的PCR扩增成功率均达100%,ITS和RPB2片段分别为95.35%和90.91%;对比ITS和LSU片段,β-tubulin和RPB2片段的种内最大遗传距离分别小于各自的种间最小遗传距离,存在明显的DBG,有利于准确对物种进行种间鉴定;利用ITS、β-tubulin和RPB2片段分别构建的系统发育树均能使灵芝属10个物种的所有个体聚为1个单系分支,而LSU片段不...     

地衣的ITS序列系统发育分析和DNA条形码的初探

目的:构建出地衣植物核糖体rDNA(nrDNA)的ITS序列的系统发育树并探讨地衣植物的DNA条形码.方法:以黑龙江五大连池风景区的地衣植物为材料,采用特异性引物对地衣植物的ITS序列进行Pcr扩增,直接对其Pcr产物进行测序,利用MEGA4.0软件建立地衣植物的ITS序列的系统发育树.结果:根据系统发育分析得出一致性指数CI和维持性指数RI分别为0 5356和0.6602,相同属地衣的样本间即种内的遗传距离 和不同属的样本间即种间的遗传距离(K-2-P)平均值分别为0.030和0.600,种间距离大于种内距离.结论:根据地衣植物样本间的遗传距离(K-2-P)的分析,得出核糖体rDNA的ITS基因对地衣近缘属的分类鉴定上具有一定的参考价值,建议作为地衣分类鉴定的条形码的测试片段.     

海三棱藨草及其近缘种的DNA条形码研究

海三棱藨草[×Bolboschoenoplectus mariqueter(Tang&F. T. Wang) Tatanov]的分类学地位至今尚无定论。为明确海三棱藨草的分类学地位并探讨其与近缘种的关系,该研究分别利用1个核基因(ITS)和5个叶绿体基因(matK、ndhF、rbcL、trnL和trnL-trnF)的DNA条形码序列对海三棱藨草及其近缘种的4种21批样品进行扩增和测序,通过采用相似性搜索算法对单一序列和序列组合的物种鉴定效率进行评价,并基于贝叶斯推断方法构建系统发育树进行鉴定分析。结果表明：(1)ITS+matK序列组合的物种鉴定效率最高,为71.4%,可实现海三棱藨草及其近缘种的种间区分、鉴定。(2)基于ITS+matK序列组合构建海三棱藨草及其近缘种的系统发育树,发现同一物种的样品聚集度较好,海三棱藨草与三棱草属[Bolboschoenus(Asch.) Palla]的物种聚为一支,明显与水葱属[Schoenoplectus(Rchb.) Palla]物种分开,并且海三棱藨草与海滨三棱草[Bolboschoenus maritimus(Linnaeus) P...