人类新型Krüppel类转录因子hBKLF的cDNA克隆、亚细胞定位及表达特征

人胎肝cDNA文库FLD4585克隆可能编码一种造血相关的转录因子,本文旨在从22周孕龄人胎肝中获得其编码基因的全长cDNA序列,分析其编码蛋白的功能域、基因组结构、染色体定位、亚细胞定位及表达谱特征.采用5′RACE方法获得FLD4585克隆全长;生物信息学方法确定hBKLF基因结构、染色体定位及功能域特征;GFP融合蛋白技术确定hBKLF亚细胞定位;Northern 杂交、RT-PCR、Western印迹方法分析其表达谱.结果获得了FLD4585克隆编码的hBKLF cDNA全长序列,它含1810 bp,编码345个氨基酸,与小鼠BKLF同源,C端含3个特征性C2H2结构的锌指,是KLF转录因子家族的新成员.hBKLF基因跨越33 kb,含6个外显子和5个内含子,位于4号染色体4p15.2～p16.1.GFP-hBKLF融合蛋白在COS-7细胞中呈细小点状分布于核内,核仁区无分布.hBKLF含有两个转录本,大小为4.4 kb～7.5 kb和1.35 kb～2.4 kb.大转录本在成人及胎儿组织广泛表达,小转录本在外周血白细胞、肝脏和骨髓表达量最高,红系和粒系细胞均表达hBKLF.hBKLF表达量随肝脏发育成熟而下降,随红系、粒系成熟而升高.以上研究提示hBKLF可能是一种在体内广泛发挥作用的转录因子,在造血的调控中可能有重要作用.     

人类新型Krueppel类转录因子hBKLF的cDNA克隆、亚细胞定位及表达特征

人胎肝cDNA文库FLD4585克隆可能编码一种造血相关的转录因子,本文旨在从22周孕龄人胎肝中获得其编码基因的全长cDNA序列,分析其编码蛋白的功能域、基因组结构、染色体定位、亚细胞定位及表达谱特征。采用5′RACE方法获得FLD4585克隆全长;生物信息学方法确定hBKLF基因结构、染色体定位及功能域特征;GFP融合蛋白技术确定hBKLF亚细胞定位;Northern杂交、RT-PCR、Western印迹方法分析其表达谱。结果获得了Fld4585克隆编码的hBKLFcDNA全长序列,它含1810bp,编码345个氨基酸,与小鼠BKLF同源,C端含3个特征性C2H2结构的锌指,是KLF转录因子家族的新成员。HBKLF基因跨越33kb,含6个外显子和5个内含子,位于4号染色体4p15.2-p16.1。GFP-hBKLF融合蛋白在COS-7细胞中呈细小点状分布于核内,核仁区无分布。HBKLF含有两个转录本,大小为4.4kb-7.5kb和1.35kb-2.4kb。大转录本在成人及胎儿组织广泛表达,小转录本在外周血白细胞、肝脏和骨髓表达量最高,红系和粒系细胞均表达hBKLF。HBKLF表达量随肝脏发育成熟而下降,随红系、粒系成熟而升高。以上研究提示hBKLF可能是一种在体内广泛发挥作用的转录因子,在造血的调控中可能有重要作用。     

人甲状腺受体相互作用蛋白15基因全长cDNA的克隆及其特性

通过生物信息学分析及RT PCR技术 ,从人垂体cDNA文库中克隆到甲状腺素受体相互作用蛋白 15(hTRIP15)的全长cDNA ,长度 1963bp ,编码 4 4 3氨基酸 ,同时克隆该基因不同剪接方式所形成的新的异构体 ,长度 1984bp ,编码 4 50氨基酸 .与基因组序列比较显示该基因具有 12个外显子 ,5号外显子 3′端具有 2个剪切的接点 (-ag) .搜寻UniGene数据库作染色体定位于D15S146 D15S117,该基因在生物进化上具有较高的保守性 ,从单细胞藻类到人类均有该基因同源物表达 ,亚细胞定位为核内 .Northern杂交显示 ,该基因具有 3种不同大小的转录本 ,分别约为 2 0、3 5及 4 0kb ,且在人体各组织中均有一定表达 ,其中骨骼肌、心脏及肾脏组织为高表达 .半定量RT PCR显示在一些内分泌组织均有表达 ,以肾上腺较高 .     

人ob基因克隆及其亚细胞定位的研究

目的:旨在克隆人肥胖(obese,ob)基因的全长cDNA序列,与EGFP重组构建融合蛋白表达载体,并分析其亚细胞水平的定位.方法:提取人脂肪细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增出人ob基因cDNA,并克隆至真核表达载体pEGFP-CI,重组质粒转染NIH-3T3细胞,荧光显微镜分析EGFP-ob融合蛋白的亚细胞定位.结果:克隆的ob基因cDNA为501bp,共编码167个氨基酸,与GenBank公布的人ob基因序列一致,荧光显微镜分析表明,重组的EGFP-ob融合蛋白主要分布于NIT-3T3的细胞质中.结论:成功克隆了人OB基因的cDNA序列,构建人OB基因的真核表达载体pEGFP-CI-ob,融合蛋白EGFP-ob定位于NIH-3T3细胞质中.     

人类PKNOX1基因一种新剪接型全长cDNA的克隆与表达分析

为了寻找新的Down’s综合征相关基因,利用生物信息学分析与实验技术相结合的方法,从定位于Down’s综合征关键区内(21q22．3)的EST(GenBank登录号H77399)出发,从人类睾丸组织cDNA文库内克隆到含同源盒结构域转录因子PKNOX1的一种新剪接型全长cDNA,命名为PKNOX1B,GenBank登陆号AYl42115。PKNOX1B基因跨越58．4kb,全长cDNA约2．8kb,有11个外显子和10个内含子,编码405个氨基酸残基的酸性蛋白质,分子量为44．628kDa,等电点6．28。PKNOX1B与PKNOX1的前9个外显子及9个内含子完全相同,由于PKNOX1B在第10与11外显子之间发生了差异剪接,以致其在3’端cDNA序列被截短约2kb,所编码的蛋白质在C端较PKNOX1短30个氨基酸残基。但PKNOX1B保留了与PKNOX1完全相同的同源盒结构域,因而它可能与其他含同源盒结构域基因家族成员一样参与了发育的遗传调控。RT-PCR结果显示PKNOX1B除骨髓组织外在人体组织广泛表达。在睾丸组织中PKNOX1可见5kb,2．9kb,2kb 3种转录本,而在其他组织中仅发现2个较大的转录本,2kb的转录本在睾丸组织呈现特异性的表达,它有可能参与了精子的发生过程。     

小鼠新分泌蛋白基因mBolA1的克隆与鉴定

采用生物信息学工具预测与实验相结合的方法得到了一个新的小鼠分泌蛋白基因mBolA1。该基因定位于染色体3F2,cDNA全长为730bp,编码137个氨基酸的蛋白,该蛋白含有一个保守的BolA结构域,等电点为9.05。用RT-PCR方法从鼠的混合cDNA库中克隆到mBolA1。Western blot实验表明mBolA1能从瞬转的COS 7细胞中分泌到细胞培养液中。亚细胞定位显示mBolA1定位于细胞浆,且与高尔基体不共定位,提示它是个非经典分泌途径的分泌蛋白。RT PCR显示mBolA1在组织中广泛表达。它的具体功能有待进一步研究。     

人牛精浆蛋白相关新基因的cDNA克隆、定位和表达

为了研究牛精浆 (bovineseminalplasma ,BSP)蛋白及其相关蛋白在受精及受精卵发育中的重要作用 ,寻找BSP蛋白相关新基因 .采用cDNA末端快速扩增 (RACE)技术 ,克隆了一个BSP蛋白相关基因的cDNA序列 .应用辐射杂种细胞系 (RH)技术进行了基因染色体定位 .通过RT PCR检测了该基因在人体各组织中的表达情况 .并将该基因编码的蛋白进行了原核表达 .新基因的cDNA长度为 10 5 2bp ,其开放阅读框架 (ORF)编码了一个含 2 2 3个氨基酸残基的蛋白质 ,氨基酸序列中含有 4个纤连蛋白Ⅱ结构域 ,与BSP蛋白在结构上具有一定的相似性 ,称其为人BSP相关蛋白 (humanBSP relatedproteins ,HBRP) .该基因定位于染色体 19q13,在大肠杆菌中表达为 5 2kD的融合蛋白 .研究结果提示 ,应用RACE方法克隆了一种新的人类与BSP蛋白相关的基因 ,推测其编码蛋白是与BSP蛋白功能相关的结合蛋白 ,通过基因重组技术大量获得表达蛋白 ,对进一步研究新蛋白的生物学功能具有重要的意义 .     

核定位信号筛选系统的构建

建立了一酵母克隆系统用于克隆含核定位信号 (NLS)的蛋白质的基因 .用表达转录因子GAL4 DNA结合域 - p53(GAL4- DBD- p53)融合蛋白的质粒转化酵母 HF7c,使 GAL4- DBD- p53可结合于报告基因的启动子但因无转录激活域而不能激活转录 .构建一酵母穿梭载体 ,可表达无NLS的 GAL4转录激活域 -大 T抗原 (GAL4- AD- LT)融合蛋白 .融合蛋白基因的下游插入一多克隆位点 .将 c DNA文库插入多克隆位点后 ,如果 c DNA片段可编码 NLS,则 GAL4- AD- LT分子可进入细胞核 ,并通过 LT与 p53的相互作用而使 GAL4- AD结合于启动子和激活报告基因的转录 .构建了这一克隆系统的各质粒 ,并用绿色荧光蛋白 (GFP)验证了其对核内蛋白和胞浆蛋白的甄别能力 .这一系统将有助于从 c DNA文库中筛选编码带有 NLS的蛋白质的基因     

香蕉MuMADS1基因表达产物的亚细胞定位

MuMADS1是从香蕉果实cDNA文库中筛选分离到的一个MADS—box基因．通过生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白可能作为转录因子定位于细胞核中,而且芯片分析表明：该基因在果实成熟早期表达上调．是乙烯的上游调控因子,可能与花的发育、果实发育及成熟相关．为进一步深入研究该基因功能。构建了以绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein．GFP）为报告基因的融合植物表达载体pCAMBIA1304 MuMADS1．利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达．荧光显微镜检测结果表明。该基因表达产物定位于细胞核中．符合转录因子特性．     

一种新型锌指蛋白基因——人ZNF313的克隆、定位及表达

运用正常可育男性和无精症病人睾丸组织的mRNA差异显示和cDNA末端快速扩增（PACE）等方法,从人睾丸组织中分离了一个同时含有指环结构和C2H2结构域的新型锌指蛋白基因——人ZNF313。运用荧光原位杂交（FISH）方法,将该基因定位到人染色体20q13。该基因含6个外显子,编码228个氨基酸。基因组结构分析显示,外显子6含有的2个加尾信号,产生2种不同的3‘端非翻译区。Northern杂交及多组织RT-PCR的结果显示该基因含有0.75kb和2.4kb两种转录本,其中0.75kb转录本在正常睾丸中高表达,而其他组织、无精症患者及胎儿睾丸组织中该基因代表达。结果提示：人ZNF313基因对精子发生和男性可育性可能起重要作用。     

小鼠睾丸和卵巢特异表达基因Zfp474的克隆与特征分析

运用NCBI中的数据库消减杂交(Digital Differential Display,DDD)分析方法,从小鼠睾丸组织中分离了一个含有C2HC／C3H结构的新型锌指蛋白基因——ZIM74(GenBank登录号：AY350709)。通过推导和进一步的RT-PCR实验证实：该基因含4个外显子,gDNA在染色体上跨度29869bp,定位于小鼠染色体18D1。cDNA编码一个含347个氨基酸的新蛋白,带有C2HC／C3H结构域。Northern杂交结果显示：该基因含有2．37kb大小的唯一转录本,主要在睾丸中强表达,卵巢中有表达,而在其他组织中该基因无表达。结果提示：Zfp474基因对精于发生和卵母细胞的发育可能起重要作用。     

龙眼体胚发生过程生长素响应因子DlARF5a的克隆及表达分析

以龙眼松散型胚性愈伤组织为材料,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得生长素响应因子ARF5acDNA全长序列,利用实时荧光定量法检测其在龙眼体胚不同发育时期的转录水平,并将其与绿色荧光蛋白(GFP)构建成亚细胞定位载体侵染洋葱表皮细胞。结果表明:龙眼ARF5a(命名为DlARF5a,GenBank登录号为KF739401)的cDNA序列全长为3 322bp,其中开放阅读框为2 829bp,212bp 5′非编码区,258bp 3′非编码区,编码942个氨基酸。生物信息学预测显示,DlARF5a编码蛋白具有B3、Auxin-resp和AUX-IAA保守区与结构功能域,中间区域富含谷甘氨酸、丝氨酸和亮氨酸,是一个定位于细胞质的具有促进转录活性功能的水溶性蛋白。系统进化树分析表明,该基因编码的氨基酸序列与大豆的亲缘关系最近。qRT-PCR检测显示,DlARF5a在龙眼球形胚和鱼雷形胚时期表达显著增强,而在6个发育阶段中子叶形胚的表达量最低,推测DlARF5a参与龙眼体胚中鱼雷胚时期的形态建成。共聚焦显微镜观察结果显示,未添加外源生长素IAA的DlARF5a蛋白定位于细胞质中,而经外源生长素处理的DlARF5a蛋白在细胞膜、细胞质和细胞核中均有表达,推测龙眼生长素响应蛋白DlARF5a能够响应外源生长素IAA而改变其在细胞中的空间位置。     

人组氨酸磷酸酶蛋白PHPT1的细胞定位及其对细胞层状伪足形成的影响

目的:获取人组氨酸磷酸酶蛋白PHPT1基因,并构建其C端GFP融合的真核表达载体,通过瞬时转染观察融合蛋白在细胞内的表达和定位,并研究其定位与细胞层状伪足形成的关系。方法:以人宫颈癌细胞株HeLa cDNA为模板,PCR扩增PHPT1的全长编码基因,克隆到pEGFPN2载体中,构建pEGFP-N2-PHPT1真核表达载体,利用脂质体将构建的载体转染到HeLa细胞中,用激光共聚焦扫描显微镜观察C端GFP连接的PHPT1的细胞定位,并进一步探讨其定位与细胞层状伪足形成的关系。结果:成功构建了PHPT1的GFP融合表达载体pEGFP-N2-PHPT1,并在He La细胞中检测到了融合蛋白的表达,发现其定位与细胞层状伪足的形成密切相关,并可直接影响细胞的运动能力。结论:GFP融合形式表达的PHPT1蛋白在细胞质和细胞核中均有表达,并且定位于细胞层状伪足的前沿,影响细胞层状伪足的形成,从而影响细胞运动。     

马铃薯StPSKRs基因的克隆及其亚细胞定位分析

该研究采用同源克隆与PCR扩增方法,从马铃薯品种‘Desiree’中克隆植物磺肽素受体基因StPSKR1和StPSKR2的全长cDNA,并对其进行生物信息学分析及亚细胞定位分析,为深入研究StPSKR1和StPSKR2基因在马铃薯生长发育和生物胁迫中的作用提供理论依据。结果发现:(1)通过同源克隆与PCR扩增获得StPSKR1和StPSKR2的全长cDNA片段,并将其克隆到pGWB5-GFP载体;测序结果显示这2个基因编码的蛋白质与数据库给定的蛋白质序列保持一致,表明成功克隆到StPSKR1和StPSKR2基因。(2)StPSKR1位于马铃薯1号染色体上,cDNA全长3 042 bp,编码1 013个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为112.16 kD,理论等电点6.27;StPSKR2位于7号染色体,cDNA全长3 135 bp,编码1 044个氨基酸,相对分子量为114.99 kD,理论等电点6.19。(3)生物信息学分析显示,StPSKR1和StPSKR2都属于跨膜蛋白。(4)亚细胞定位结果显示,StPSKR1和StPSKR2均定位于细胞膜上。     

小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因mTSARG3的克隆

从在小鼠隐睾和正常睾丸对照中表达量有明显差异的EST片段 (BE6 4 4 5 37)出发 ,利用GeneScan软件分析该片段所在染色体基因组序列 ,获得一个包含该EST的新基因序列。设计该基因特异性引物从小鼠睾丸cDNA文库中进行PCR扩增 ,分离出小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因mTSARG3(GenBank登录号为AF4 192 92 )。该基因定位于小鼠 7号染色体 7E1 E2区带 ,全长为 11kb ,cDNA全长为 132 8bp ,包含 8个外显子 ,编码由 316个氨基酸组成的、分子量为 36kD的蛋白质。该蛋白质含有DnaJ区和DnaJ- c区 ,与热激蛋白 4 0家族多种蛋白质有较高相似性 ,其中与小鼠DJB4 - MOUSE在 336aa的范围内有 4 6 %的相似性 ,属热激蛋白 4 0家族新成员。多组织RT PCR和Northern印迹结果显示 ,该基因在小鼠睾丸组织高表达 ,转录本大小约为 1.35kb ;Southern杂交结果显示 ,该基因在小鼠正常睾丸和隐睾组织无缺失和重排。实验结果证明成功克隆到了一个小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因mT SARG3。     

丹参转录因子SmMYB52的基因克隆、表达分析和亚细胞定位

MYB转录因子家族是植物界最大的转录因子家族之一,在植物生长发育、响应生物、非生物胁迫方面发挥重要作用.本研究分别从gDNA和cDNA水平上克隆得到丹参R2R3-MYB转录因子亚家族第24亚组的基因SmMYB52的全长序列,该基因序列全长1 041 bp,包含2个内含子序列和879 bp完整的CDS(Gen-Bank登录号:KF059406),编码292个氨基酸.运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析以及生物信息学分析发现,SmMYB52与拟南芥MYB转录因子AtMYB93亲缘关系最近.利用RT-qPCR测定SmMYB52基因在各器官中的表达,结果显示该基因在根、茎、叶和花中均有表达,根中表达量最高,茎中最低.构建融合表达载体分析SmMYB52蛋白的亚细胞定位,结果显示SmMYB52在细胞核和细胞膜中均有分布.本实验为进一步研究SmMYB52在丹参中的生物学作用提供了科学依据.     

丹参转录因子SmMYB52的基因克隆、表达分析和亚细胞定位

MYB转录因子家族是植物界最大的转录因子家族之一,在植物生长发育、响应生物、非生物胁迫方面发挥重要作用.本研究分别从gDNA和cDNA水平上克隆得到丹参R2R3-MYB转录因子亚家族第24亚组的基因SmMYB52的全长序列,该基因序列全长1 041 bp,包含2个内含子序列和879 bp完整的CDS(Gen-Bank登录号:KF059406),编码292个氨基酸.运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析以及生物信息学分析发现,SmMYB52与拟南芥MYB转录因子AtMYB93亲缘关系最近.利用RT-qPCR测定SmMYB52基因在各器官中的表达,结果显示该基因在根、茎、叶和花中均有表达,根中表达量最高,茎中最低.构建融合表达载体分析SmMYB52蛋白的亚细胞定位,结果显示SmMYB52在细胞核和细胞膜中均有分布.本实验为进一步研究SmMYB52在丹参中的生物学作用提供了科学依据.     

通过小麦Ms2近等基因系的抑制缩减杂交分析揭示小穗和花药中差异表达基因

以Ms2近等基因系处于减数分裂期的可育小穗cDNA作为驱动因子(driver),以同一时期的不育小穗cDNA作为测验因子(tester)进行缩减杂交(SSH),将扩增后的缩减杂交产物进行克隆,构建了一个包含882个重组克隆的SSH文库.分别以可育小穗和不育小穗的cDNA为探针与SSH文库克隆进行反式Northern杂交,结果显示接近90%的克隆在不育小穗中呈上调表达.对文库中21个克隆插入片段的序列相似性分析表明其中有18个与来源于穗部或减数分裂期的花药cDNA同源.13个克隆的编码产物与已知功能的蛋白质同源,其中5个参与碳代谢活动,4个参与胞内分子的运输,2个蛋白产物参与染色体的构成及染色体的结构变化,1个是生长素抑制蛋白,1个是转录因子.用中国春缺体四体材料对9个克隆进行了染色体定位,其中一个克隆定位于第四染色体同源群,与Ms2所在的染色体同属一个同源群.通过搜索水稻的同源BAC(bacterial artificialchromosome)和PAC(P1 artificial chromosome)克隆,推测另外11个克隆的染色体位置,其中4个克隆可能位于第四染色体同源群.用RNA点杂交对11个克隆进行表达谱分析,其中8个克隆在不育株的小穗和花药中呈上调表达.     

噬菌体显示法克隆RNA结合蛋白cDNA——表达文库的构建

试图用噬菌体显示法(phage display)克隆编码与人白细胞介素6核转录因子的3′非翻译区(NF-IL6 3′UTR)特异结合的蛋白的cDNA.构建了回复系RR细胞的cDNA的噬粒(phagemid)表达文库,并设法除去了cDNA的大部分终止密码子.鉴定表明,该文库中含有各种大小的cDNA插入片段,并能够表达外源cDNA,为用噬菌体显示法克隆RNA结合蛋白基因或cDNA做好了准备.     

利用电子差异展示方法克隆人类睾丸高表达新基因SPATA11

利用NCBI中的电子差异展示(digital differential display,DDD)软件,比较来自睾丸(包括睾丸癌)与来自其它组织的EST文库,从筛查人类睾丸中高表达而在其他组织中不表达或低表达的差异ESTs入手,成功克隆了一个在人类睾丸中高表达的新基因SPATA11．RT-PCR实验证实其在成人睾丸高表达．序列分析表明该基因含4个外显子,基因组跨越2．6kb,定位于19pl3．3．cDNA编码一个含221个氨基酸,相对分子质量为24．5kD的新蛋白．Northern杂交结果显示：该基因含有1．1kb大小的唯一转录本,主要在睾丸中强表达．肝脏、肺、卵巢和肾脏中有微弱表达．而其他组织中该基因无表达．