乳糖作为棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白表达诱导剂的可行性研究*

乳糖不仅可以诱导棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白表达,而且表达量与IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)作为诱导剂时相比,并不低于后者,这样大规模生产棉龄虫颗粒体病毒增效蛋白的成本就可能被降低。乳糖的最适浓度经优化为2.2％～2.5％(W/V)。对乳糖的不同除菌处理表明:0.70×10~5Pa 15min蒸汽灭菌的乳糖可以诱导此增效蛋白表达,这种处理比滤膜过滤除菌更为方便和经济,因此就为棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白的生产提供了经济实用的前景。     

冠状病毒糖基化呈现的α-半乳糖表位能增强COVID-19疫苗的免疫原性

正新型冠状病毒SARS-CoV-2上的多糖链及S蛋白形成了一层聚糖屏障(glycan-shield),掩盖了抗原肽,减少了抗原呈递细胞(APC)对灭活病毒或S蛋白疫苗的摄取。对灭活流感病毒和重组HIV疫苗gp120的研究表明,糖基化聚糖屏障呈现的α-半乳糖表位(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R)能够利用天然抗半乳糖抗体增强疫苗效力,这在能够产生抗半乳糖的小鼠中进行了评估。α-半乳糖表位是天然抗半乳糖抗体的配基,     

婴幼儿腹泻与乳糖不耐受关系的研究

目的研究婴幼儿腹泻乳糖不耐受的发生率;轮状病毒肠炎与乳糖不耐受的的关系;婴幼儿腹泻去乳糖饮食的疗效。方法采用醋酸铅法检测粪便乳糖的含量。应用ELISA双抗体夹心法测定粪便轮状病毒抗原抗。分组观察婴幼儿腹泻去乳糖饮食的疗效。结果婴幼儿腹泻乳糖不耐受的发生率为62.5%。其中<1岁乳糖不耐受的发生率为70.59%;>1岁乳糖不耐受的发生率为42.86%,0.010.05。婴幼儿腹泻乳糖不耐受去乳糖饮食有效率93.33%;对照组有效率53.33%,P<0.01。结论(1)婴幼儿腹泻时乳糖不耐受发生率高达62.5%;(2)RV肠炎时可合并继发性乳糖不耐受,继发性乳糖不耐受可能加重腹泻症状,是使腹泻时间延长的重要原因;(3)婴幼儿腹泻时乳糖不耐受给去乳糖饮食疗效肯定。     

粉纹夜蛾新细胞克隆株Tn5B-40的研究(英文)

从Tn5B1-4细胞系中克隆并筛选出了新克隆株Tn5B-40,测定分析结果表明,该克隆株对病毒(AcNPV)的敏感性和生长特性与原始细胞无显著差异,但在重组蛋白表达方面,无论对β-半乳糖苷酶还是碱性磷酸酶都明显地高于野生型细胞系,其中β-半乳糖苷酶在第6天的表达为原始细胞株的2倍,碱性磷酸酶的表达在第9天最高为原始细胞株的1.4倍。因此,该细胞是一株高产病毒和高表达重组蛋白的新克隆株。     

人乳头瘤病毒6b型(HPV-6b)的上游调控区在大肠杆菌中也具有增强子样的效应

采用痘苗病毒7.5k、11k及N2启动子,以大肠杆菌β-半乳糖苷酶(β-lac)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)作为标记基因,构建了大肠杆菌增强子样序列的系列检测载体。采用上述检测载体发现人乳头瘤病毒6b(Human papillomavirus type 6b,HPV-6b)上游调控区(Upstream regulating region,URR)中540bp的Sau3A-Nar Ⅰ片段,在大肠杆菌中对痘苗病毒启动子控制的CAT基因的表达有明显的增强作用,可使基因表达提高4～5倍;对β-lac基因的表达可提高3～6倍。根据这一片段的插入方向增强基因表达水平有所不同。     

水痘疫苗新型疫苗冻干保护剂的研究

目的:开发出新型号水痘疫苗保护剂替代现行含明胶、人血白蛋白疫苗保护剂,提高病毒保护效果及疫苗受种人群使用安全性。方法:(1)选取右旋糖酐、乳糖、甘露醇等辅料按不同配方进行制备疫苗保护剂。(2)使用不同配方制备的疫苗保护剂,应用细胞工厂水痘疫苗制备工艺进行生产水痘疫苗。(3)使用不同配方制备的疫苗保护剂生产的水痘疫苗与现行疫苗保护剂生产的水痘疫苗进行对比。结果:对比试验结果显示,使用右旋糖酐、乳糖、甘露醇等制备的疫苗保护剂,与现行疫苗保护剂比较无差异。结论:使用右旋糖酐、乳糖、甘露醇等制备的疫苗保护剂比较现行使用的疫苗保护剂,由于不含明胶及人血白蛋白,因此使该疫苗冻干保护剂的安全性、可靠性有所提高,并且疫苗冻干保护剂的成本将有所下降。     

猪细小病毒VP2与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在干酪乳杆菌表面共表达

将分别编码猪细小病毒(PPV)主要免疫保护性抗原VP2蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因插入乳酸杆菌细胞表面表达载体pPG中, 成功构建了重组表达载体pPG-VP2-LTB, 将其电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393, 获得了表达猪细小病毒VP2-LTB融合蛋白的重组乳酸菌表达系统, 经2%乳糖诱导, SDS-PAGE和Western-blot检测表明, 有大小约78 kD的蛋白得到了表达, 具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性, 全细胞ELISA结果表明, LTB同     

XJ—160病毒复制子型表达载体的构建

D-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成。本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxjl60。为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达。结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因。本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础。     

解脂耶氏酵母细胞表面展示乳糖水解酶高效水解乳糖

乳糖是婴幼儿获取能量的重要碳源之一,但乳糖需要在乳糖酶的作用下水解成半乳糖与葡萄糖后才能被吸收。缺少乳糖分解酶的婴幼儿在摄入含乳糖的食品后,未被消化的乳糖会直接进入大肠,刺激大肠蠕动加快,造成一系列不适应症状即乳糖不耐症,我国属于乳糖不耐症高发国家。因此,解决乳糖的体外水解问题对减轻该症状有重要的意义。研究通过将β-半乳糖苷酶(也称为乳糖水解酶)表面展示在食品安全微生物解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞表面,通过培养获得该酵母,然后直接利用酵母细胞来水解乳糖生成半乳糖与葡萄糖。采用该工程酵母细胞(HCY10),能在24小时内完全水解50g/L的乳糖,生成半乳糖与葡萄糖。该方法具有高效、简便的优点,能为乳糖的高效水解提供一条新的途径。     

培养山羊痘病毒常用细胞在X-gal环境中的显色差异分析*

目的：为筛选出表达LacZ基因重组山羊痘病毒的适宜培养细胞系。方法：将常用于培养山羊痘病毒(GPV)的乳仓鼠肾细胞(BHK21)、羊肾细胞(SK)和羔羊睾丸细胞(LT)培养至单层,之后单层细胞用含X-gal的培养基继续培养,观察比较各细胞在X-gal环境中呈现的蓝色。提取单层细胞的RNA,进行LacZ基因的RT-PCR,回收PCR产物、连接载体、转化E.coli,挑阳性克隆测序分析。将单层细胞继续培养72 h,检测各细胞产生的β-半乳糖苷酶。结果：随着培养时间的延长,固体培养的BHK21、LT细胞孔中胶颜色变蓝且逐渐加深,显微镜观察可见细胞蓝斑,而SK细胞、空白、无X-gal孔中的胶未变色,镜检无细胞蓝斑;液体培养的单层细胞逐渐脱壁,培养液未见蓝色。RT-PCR产物电泳条带与预期分子量大小相符,测序结果显示目标DNA与LacZ基因序列相似性值达100%,表明3种细胞均有LacZ基因的转录本。β-半乳糖苷酶测定结果显示3种细胞均表达此酶,细胞产酶能力比较为BHK21>LT>SK,尤以SK细胞产β-半乳糖苷酶量极低。结论：显色差异法筛选出的羊肾细胞适宜培养表达LacZ基因的重组山羊痘病毒,结果可为山羊痘病毒新型疫苗研发提供一些参考。     

XJ-160病毒复制子型表达载体的构建

XJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成.本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxj160.为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达.结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因.本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础.     

甜菜坏死黄脉病毒RNA3序列分析及在大肠杆菌中的表达

以G1株系的甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)RNA3为模板,以Oligo(dT)_(15)为引物合成cDNA第一链,以RNA3特异引物合成cDNA第二链。然后将双链DNA克隆在pGEM3zf(+)载体中。通过限制性内切酶图谱分析,构建了五个亚克隆,完成全序列1776bp的序列测定(不含Poly(A)尾巴)。对核苷酸序列和推测的氨基酸序列分析结果发现,RNA3含三个开放阅读框架(ORF),分别编码三个多肽,即P25、P4.6和蛋白N。与法国F2株系RNA3在核昔酸水平上的同源率达96.8％,相应的CRF F25、ORF P4.6和ORFN编码多肽的同源率分别为93.6％、93.2％和92.3％。P25含一个钉指结构(zinc finger),和酸性及碱性区域;蛋白N为疏水蛋白。ORF以外的两端序列高度保守,且3'端可形成双发卡结构(double hairpin motif),说明这段序列在病毒侵染或复制中有十分重要的作用。进一步将RNA3 eDNA体外定点突变后使P25 ORS 与卢-半乳糖苷酶基因位于同一阅读框架以表达卢-半乳糖苷酶和P25融合蛋白,在诱导产物中检测到卢-半乳糖苷酶与P25的融合蛋白已在大肠杆菌中得到表达。     

乳糖诱导丙酮酸羧化酶基因在大肠杆菌中的表达及对丁二酸产量的影响

大肠杆菌DC1515是敲除葡萄糖磷酸转移酶(ptsG)、乳酸脱氢酶(ldhA)、丙酮酸甲酸裂解酶(pflA)基因的菌株,具有发酵生产丁二酸的潜力。为进一步提高菌株DC1515的丁二酸生产能力,将枯草芽孢杆菌丙酮酸羧化酶(pyc)基因转入其中。用乳糖代替IPTG诱导pyc表达,确定了最佳乳糖加入时间、乳糖浓度及诱导温度。在此基础上,考察了补加乳糖对丁二酸产量的影响。结果表明:由于ptsG基因缺失,当培养基中葡萄糖浓度达到15g/L时,乳糖诱导作用并不受葡萄糖抑制。优化诱导条件后,pyc过表达菌株的丁二酸产量达15.17g/L,为对照菌株的1.78倍。间歇补加乳糖2次至浓度为1g/L,丁二酸产量可进一步增至17.54g/L。研究结果为以葡萄糖为底物生产丁二酸的过程中乳糖诱导外源基因在大肠杆菌中的表达奠定了基础。乳糖诱导降低了成本,有利于实现丁二酸发酵生产的工业化。     

海枣曲霉β-半乳糖苷酶的催化性质

 通过测定海枣曲霉β-半乳糖苷酶的底物特异性,表明该酶水解对-硝基酚基β-半乳糖苷(PNP-β-gal)的活力最高。该酶水解PNP-β-gal,乳糖和对-硝基酚基β-D-岩藻糖苷(PNP-β-fuc)的相对活力为100,63.1,10.3。不同测定方法的结果均表明,这一PNP-β-fuc水解活性来自β-半乳糖苷酶本身。Hg~(2+)、D-半乳糖和D-半乳糖-r-内酯对该酶有强烈的抑制作用,Ag~+和4mol/l脲也有较强的抑制作用。该酶水解PNP-β-gal和乳糖的Km值分别为1.3及36.2mmol/l,Vmax则分别为478和189μmol.min~(-1).mg~(-1)。Lineweaver-Burk作图法及Dixon作图法均表明D-半乳糖和D-半乳糖酸-γ-内酯对该酶显示竞争性抑制作用,其Ki分别为4和0.9mmol/l。     

不同异源启动子与MDVgB启动子及其复合启动子的活性比较

为了选择适宜的启动子调控外源基因的表达,以改善马立克氏病病毒为载体的重组病毒的免疫保护力。将hCMV立即早期启动子及增强子、SV40早晚期启动子及增强子或hCMV立即早期增强子的部分序列分别与马立克氏病病毒(MDV)自身的囊膜糖蛋白B基因(gB)启动子核心部分在体外杂合,分别构建复合启动子PhCMV-gB、PSV-gB或Pen-gB;将这些启动子与虫荧光素酶报告基因相连,构建表达载体。利用脂质体将以上质粒与内标质粒(pSV-β-LacZ)共转染鸡胚成纤维次代细胞,于转染后48h,将细胞刮下来,利用荧光素酶测定试剂盒和β-半乳糖苷酶测定试剂盒分别测定转染细胞的荧光素酶和β-半乳糖苷酶的活性,通过荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性的比值获得虫荧光素酶的相对活性,利用虫荧光素酶的相对活性进行启动子的活性比较。结果表明,复合启动子相对马立克氏病病毒自身的gB启动子,活性有不同程度的提高,其中复合启动子PhCMV-gB的活性最高,而复合启动子PSV-gB和Pen-gB的活性相当;但与商业强启动子相比,复合启动子活性要弱一些或相当。因此,从某种意义上讲,这些复合启动子既具有gB启动子的一些特性,又有商业强启动子的一些特性,为以马立克氏病毒为载体的新兴疫苗的开发奠定了基础。     

碳源对K.fragilis LFS-8611β-D-半乳糖苷酶合成的影响

探讨了碳源对脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)LFS-8611生长、β-D-半乳糖苷酶合成的影响及碳源对该酶合成的诱导作用。脆壁克鲁维酵母(K,fragilis)LFS-8611生长与β-D-半乳糖苷酶合成同步。该菌株生长和产酶的最适碳源为半乳糖,乳糖次之。菌体生物量和酶活力随着培养基中乳糖浓度的增加而增加,乳糖浓度为12mg／mL,菌体生物量和酶活力达到峰值,分别为5．84g／L、19,12U／mL。半乳糖和乳糖对β-D-半乳糖苷酶合成具有诱导作用。诱导物浓度对β-D-半乳糖苷酶的诱导合成有较大影响。半乳糖诱导以山梨醇为碳源预培养的K．fragilis LFS-8611细胞合成β-D-半乳糖苷酶的最适浓度为10mg／mL。     

柞蚕核型多角体病毒基因表达载体系统的构建与基因表达

柞蚕是一种野外饲养的经济昆虫,主要分布在我国东北部山区。柞蚕以蛹滞育越冬,其蚕蛹个大、容易固定、保存时间长、无须饲养、容易运输等优点。利用柞蚕蛹作为生物反应器生产外来蛋白质,可以大规模机械化生产,减少操作上的烦琐和劳动力。本文利用柞蚕核型多角体病毒(AnpeNPV)作为基因表达载体,在柞蚕培养细胞(AnPe细胞)和柞蚕蛹中成功地表达了β-半乳糖苷酶基因（LacZ）,并利用AnPe细胞筛选、纯化获得了AnpeLacZ重组病毒。该重组病毒的β-半乳糖苷酶产量,在TC-100(含10%FBS)培养的AnPe细胞中最高酶活性为感染后第12天的40.9 units/ml,在SF-900Ⅱ培养的AnPe细胞中最高酶活性为感染后第18天的59.9 units/ml,后者表达量稍高,但时间滞后。AnpeLacZ在5℃保存了7个月的柞蚕蛹中,感染后第15天酶活性达到最高,雌蛹14.3 units/g,雄蛹11.7 units/g,雌蛹比雄蛹略高。结果显示,柞蚕核型多角体病毒和柞蚕蛹可以作为一个可以机械化大规模生产的新型杆状病毒基因表达载体系统开发和利用。     

儿童慢性腹泻病因分析

目的探讨儿童慢性腹泻的病因,以提高临床诊治水平。方法选择2005年12月至2010年12月在重庆医科大学附属儿童医院住院的141例慢性腹泻患儿为研究对象,对患儿的临床资料进行回顾性分析。结果本组病例中常见致病因素依次为过敏因素46.2%(24/52)、肠道内感染28.4%(40/141)、乳糖不耐受28.3%(26/92)。共109例明确病因诊断,55.1%(60/109)为多因素共同致病,以肠道内感染合并继发乳糖不耐受,过敏合并继发乳糖不耐受,免疫缺陷合并肠道内感染多见。前4位主要病因诊断为感染性腹泻(24.1%)、过敏性腹泻(17.0%)、乳糖不耐受(7.1%)、炎症性肠病(6.4%)。结论除肠道内感染外,过敏因素、乳糖不耐受等也是儿童慢性腹泻常见致病因素。儿童慢性腹泻常由多因素共同致病,主要病因除感染性腹泻外,过敏性腹泻、乳糖不耐受、炎症性肠病等也是常见病因。儿童慢性腹泻重在病因诊断,针对病因治疗。     

第10届国际生物奥林匹克竞赛(1999)理论试题(三)

(续 2 0 0 0年第 35卷第 7期第 4 4页 )理论试题 B部分 :B部分的所有题目为多项选择题 ,但答案数目不一定 ,可能有一个、几个或全部为正确答案。答题时你必须准确地选出正确答案 ,并在正确选项前的横线上标 。细胞生物学、微生物学和生物工程学4 6　大肠杆菌的乳糖操纵子基因是典型的 (最优秀的 ) ;从此创造了操纵子概念 ,提出操纵子概念的研究者获得了诺贝尔奖金。大肠杆菌乳糖操纵子含有 3个基因 :z.编码 β-半乳糖苷酶 ,y.编码 β-半乳糖透过酶 ,a.编码转乙酰酶。变构乳糖是乳糖的异构体 ,这是通过 β-半乳糖苷酶产生的中间体 ,半乳糖…     

乳糖吸收不良、乳糖不耐受与人体健康关系探讨

由于乳糖在人体生长发育和新陈代谢中发挥着重要作用,乳糖吸收不良(Lactose malabsorption,LM)或乳糖不耐受症(Lactose intolerance,LI)不仅可诱发小儿佝偻病、成人骨质疏松,而且还可造成人体腹泻、影响婴幼儿脑组织和神经系统的构建,对婴幼儿的体格发育和智力发育造成损害。本研究对乳糖不耐受的病因及发病因素、分型、流行病学、临床及实验室诊断方法等作一概述,为临床实践和科学研究提供参考。