海藻酸裂解酶高产菌株Microbulbifer sp.SH-1的分离、鉴定及其产酶条件优化

【目的】筛选一株海藻酸裂解酶高产菌株,并通过优化产酶条件提高海藻酸裂解酶活性。【方法】以海藻酸钠为唯一碳源的培养基,对福建漳州滨海土壤中的微生物进行筛选和分离,获得海藻酸裂解酶高产菌株;依据形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析对目的菌株进行鉴定;然后通过单因素和正交试验对其产酶条件进行优化。【结果】十六烷基吡啶(CPC)染色得到4株透明圈与菌落直径比值(D/d)3的菌株;DNS法测定4菌株发酵液中海藻酸裂解酶活力,其中菌株SH-1的海藻酸裂解酶活性最高,达到315.52 U/mL;经形态、生理生化和16S rDNA测序鉴定,将其命名为Microbulbifer sp. SH-1;通过单因素和正交试验优化,确定该菌株最适产酶培养基为:海藻酸钠10 g/L,NaCl 5 g/L,(NH_4)_2SO_45g/L,MgSO_40.2g/L,K_2HPO_41g/L,FeSO_40.02g/L。对培养条件的进一步优化结果发现,在初始pH 7.5、温度32°C条件下,以1%的接种量将SH-1菌株接入50 mL优化培养基中,240 r/min转速下振荡培养24 h,SH-1菌株产酶最大活性可达757.90 U/mL,比优化前提高了2.4倍。【结论】SH-1最佳产酶条件的建立,为海藻酸裂解酶的大规模制备以及更深层次研究提供了试验基础和理论依据。     

海藻酸分解菌研究进展

海藻酸分解菌是一类能够自身合成海藻酸裂解酶,能够降解并同化海藻酸的微生物。海藻酸分解菌是海藻酸裂解酶的重要来源,其产生的海藻酸裂解酶具有种类多、反应条件温和、酶活高和易于大规模生产等优点,并且在生物、医疗、化工等领域有重要的应用价值。在过去的几十年里,海藻酸分解菌一直作为海藻酸裂解酶生产者的角色被研究和应用。但随着近年来能源危机的加剧,以海藻酸等海藻生物质为原料转化生物能源成为解决能源危机的潜在途径,因此,海藻酸分解菌又有了崭新的研究领域,即海藻酸分解菌利用海藻酸发酵生产生物能源。本文从海藻酸分解菌及其海藻酸裂解酶的种类和特性、海藻酸分解菌的代谢以及海藻酸分解菌基因工程等方面,介绍海藻酸分解菌的研究现状,并展望未来的发展趋势。     

海藻酸裂解酶异源表达研究进展

海藻酸裂解酶是通过β-消除反应切断海藻酸分子中的糖苷键,产生非还原性端具有不饱和双键的糖的酶.通常作为制备海藻酸寡糖的工具酶,广泛应用于医疗、食品和生物质能源等领域的研究.介绍了海藻酸裂解酶异源表达的研究现状、存在的问题和发展的趋势.     

褐藻胶裂解酶基因的克隆表达及重组酶酶学性质

【目的】克隆交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)BYS-2的褐藻胶裂解酶基因,实现其在大肠杆菌细胞中异源表达,对分离纯化的重组酶进行酶学性质研究。【方法】以交替假单胞菌BYS-2菌株基因组DNA为模板,克隆得到褐藻胶裂解酶基因alg738,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-alg738,诱导表达,表达产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应p H为8.0,在p H 6.0-9.0范围内37°C保温1 h仍能保持84%以上的相对酶活力,具有较好的p H稳定性;最适反应温度为45°C,热稳定性实验显示在37°C下保温60 min其残余酶活力仍达66.6%;在5 mmol/L浓度下,Na~+、Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶具有明显的促进作用,Ni~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Hg~(2+)、Zn~(2+)、EDTA、β-巯基乙醇、SDS具有明显的抑制作用。动力学参数Km、Vmax分别为1.11 g/L和0.011 g/(L·min),底物特异性分析表明该重组酶为偏好聚甘露糖醛酸钠(Poly M)裂解作用的双功能酶。【结论】重组褐藻胶裂解酶具有良好的酶学特性,为褐藻胶裂解酶的开发应用打下基础。     

白蚁肠道元基因组来源高温β-葡萄糖苷酶Bgl17的酶学性质

【目的】对短角球白蚁(Globitermes brachycerastes)肠道元基因组文库中筛选得到的一个新型β-葡萄糖苷酶编码基因bgl17进行酶学性质研究。【方法】通过克隆与异源表达得到纯的Bgl17酶蛋白,根据Bgl17对底物的水解活性测定其稳定性及动力学参数,利用薄层层析确定其水解产物。【结果】该酶属于糖基水解酶第一家族(GHF1),对其特异性底物4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPGlc)的最适反应温度为70 °C,最适pH为5.0。在最适反应条件下,该酶以pNPGlc为底物比活力为115.69 U/mg,以水杨苷为底物比活力为297.39 U/mg。以pNPGlc为底物时,其动力学参数Km值和Vmax分别为0.81 mmol/L和227.27 μmol/(mL·min)。在稳定性方面,该酶在50 °C处理1 h仍可保持50%的活性,在pH 5.0和6.0条件下,该酶的半衰期为1 h。【结论】该酶在较高的温度下具有较高的活性,且对水杨苷水解活性高,这点不同于已知的β-葡萄糖苷酶,推测其更有利于木质纤维素复杂结构的降解;该酶的最适温度远高于白蚁生存环境温度,可为研究白蚁降解纤维素的机理提供参考。     

褐藻胶裂解酶基因的克隆表达与酶学性质

随着大型褐藻生产燃料乙醇以及褐藻寡糖重大药用价值的发现,褐藻胶裂解酶成为国内外多个领域的研究重点。文中对解藻酸弧菌上与褐藻胶降解相关的5个基因分别进行克隆表达,通过SDS-PAGE和酶活性定量测定,发现该基因簇中的4个基因有降解褐藻胶活性。对酶活最高的rAlgV3进行了诱导条件的优化、酶蛋白纯化及酶性质研究,发现优化诱导条件后重组酶rAlgV3的酶活由2.34×10~4 U/L上升为1.68×10~5 U/L,比优化前提高了7.3倍;对酶性质进行表征发现该酶在4–70℃均有活性,最适反应温度为40℃,在4–20℃酶相对稳定;该酶在pH 6.5-9.0环境下均有较高的酶活,最适pH为8.0;pH稳定性好,在pH 4.5–9.5环境下可以稳定存在;适量的NaCl浓度和Fe~(2+)、Fe~(3+)等离子具有促进酶活的作用,SDS和Cu~(2+)离子可明显抑制酶活力。对该酶的底物特性的研究发现,该酶不仅可以降解褐藻胶中的Poly-M片段,也能降解Poly-G片段,具有广泛底物特性;其降解海藻酸钠主要释放二糖和三糖,是一种内切酶。该酶对于第三代燃料乙醇的发展及褐藻寡糖的生产具有重要作用。     

几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】几丁质是自然界中储藏量仅次于纤维素的有机物,几丁质酶能降解几丁质生成几丁寡糖,实现废弃物的高值化利用,目前菌株产几丁质酶能力低限制了它的生产应用。【目的】克隆弧菌(Vibrio sp.)GR52的几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,对分离纯化的重组几丁质酶进行酶学性质研究。【方法】以弧菌GR52菌株基因组DNA为模板,克隆得到几丁质酶基因GR52-1,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-chi GR52-1,诱导表达的产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应pH为6.0,在pH5.0-10.0范围内37°C保温1 h仍能保持85%以上的相对酶活力,具有较好的pH稳定性;最适反应温度为50°C,在45°C保温1 h其酶活力基本没有损失,在50°C保温1 h其残余酶活力仍达60%;在1 mmol/L浓度下,Cu~(2+)、Ca2+对该酶具有促进作用,Hg+对该酶具有明显的抑制作用;在5 mmol/L浓度下,Ni+对该酶具有一定的促进作用,Mn~(2+)、Co~(2+)、Li~+、Fe~(2+)、Hg~+、SDS(十二烷基硫酸钠)对该酶具有明显的抑制作用。以胶体几丁质为底物时,动力学参数Km、Vmax、kcat分别为0.85 mg/m L、0.19μmol/(m L·min)和7.02 s-1。底物特异性分析表明该重组酶能特异性降解几丁质。【结论】重组几丁质酶具有良好的酶学性质,为几丁质酶的开发应用奠定基础。     

蔗糖富集环境中蔗糖磷酸化酶的酶学性质研究与改造

【背景】蔗糖富集土壤是蔗糖磷酸化酶的重要来源之一。此酶能以较廉价的蔗糖为底物进行转葡萄糖基反应,改善受体底物的理化性质,因而具有重要的应用价值。【目的】研究蔗糖富集土壤中蔗糖磷酸化酶的酶学性质和转糖苷活性,为其更优质的改造提供材料和理论基础。【方法】将宏基因组中获得的蔗糖磷酸化酶基因克隆到表达载体上构建重组大肠杆菌,诱导表达并进行镍亲和层析纯化蛋白。以蔗糖为底物测量重组酶的基本酶学性质,研究其对糖类底物的转糖苷活性。通过底物通道分析,利用反向PCR技术对其第155位点进行饱和突变,并测定突变体基本酶学性质和转糖苷活性。【结果】纯化的酶蛋白分子量大小约为56 kD,活性状态时以三聚体形式存在。在以蔗糖为底物时,最适温度和最适pH值分别为55°C和6.5;Km和Vmax值分别为23.1±2.4 mmol/L和407.9±8.5μmol/(mg·min),对第155位点进行了定点饱和突变,获得了部分酶学性质或转糖苷活性改善的突变体。【结论】宏基因组中蔗糖磷酸化酶的研究丰富了酶学数据,并通过分子改造获得了部分性质更优的突变体,为转糖苷活性关键氨基酸的研究和该酶的工业应用奠定了基础。     

宏基因组来源耐Mn2+、热稳定细菌漆酶的分子克隆及酶学特性

【背景】漆酶和锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,Mnp)是木质素降解的主要酶,二者有协同效应。Mnp活性依赖于Mn~(2+),而Mn~(2+)是大多数漆酶的抑制剂。【目的】获得耐Mn~(2+)的细菌漆酶用于木质素降解。【方法】构建许昌市某污水河污泥宏基因组文库,通过活性筛选获得细菌漆酶基因lac1542。使用大肠杆菌异源表达Lac1542,研究纯化后的重组蛋白酶学性质并进一步检测了含Lac1542复合酶系降解木质素能力。【结果】测序结果显示lac1542编码一个含513个氨基酸的蛋白。以ABTS为底物Lac1542最适反应pH为4.0,在pH 3.0-6.5范围内酶活性稳定。最适反应温度是75°C,在70°C以下酶活性稳定;100 mmol/L的Mn~(2+)仍能提高酶的活性。动力学参数研究发现,该酶的最适底物顺序为:ABTS丁香醛联氮儿茶酚2,6-DMP愈创木酚。Lac1542/Mnp复合酶系对木质素降解率为47.8%,比单独使用Mnp木质素降解率(22.4%)提高25.4%。Lac1542/Mnp/灰盖鬼伞过氧化物酶(Coprinus cinereus Peroxidase,CIP)复合酶系木质素降解高达71.5%,比Mnp/CIP酶系木质素降解率(48.9%)提高22.6%,加入Lac1542后的复合酶系能明显提高木质素的降解率。【结论】Lac1542的可溶性表达、耐受高浓度Mn~(2+)、热稳定性使得Lac1542可以替代一些经典的真菌漆酶应用于制浆、造纸、纤维素乙醇生产、染料脱色等工业。     

一种海洋琼胶酶的分离纯化、酶学性质研究及降解产物分析

摘要：【目的】对海洋Agarivorans albus QM38菌株所产琼胶酶的纯化工艺和酶学性质进行了研究。【方法】发酵液通过离心、(NH4 ) 2SO4盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析、Sephacry S-100 凝胶过滤等纯化步骤得到SDS-PAGE电泳级纯酶,并用质谱对酶的降解产物进行分析。【结果】得到琼胶酶A,纯化倍数为17.6倍,收率为15.21 %,SDS-PAGE测定其分子量为127.8 kDa。对琼胶酶A进行了进一步的性质分析,其最适反应温度为35 ℃,最适反应pH为7.6,最适底物浓度为0.9 %,多数金属离子为其活性抑制剂。琼胶酶A的降解产物经质谱分析主要为四糖和六糖。【结论】从菌株QM38的发酵液中纯化得到的琼胶酶A具有降解凝胶态琼胶的能力,其分子量与以往报道过的琼胶酶不同。     

A Unique Protease Cleavage Site Predicted in the Spike Protein of the Novel Pneumonia Coronavirus (2019-nCoV) Potentially Related to Viral Transmissibility

正Dear Editor,In December 2019, a novel human coronavirus caused an epidemic of severe pneumonia(Coronavirus Disease 2019,COVID-19) in Wuhan, Hubei, China(Wu et al. 2020; Zhu et al. 2020). So far, this virus has spread to all areas of China and even to other countries. The epidemic has caused 67,102 confirmed infections with 1526 fatal cases     

Curcuminoids as inhibitors of thioredoxin reductase: A receptor based pharmacophore study with distance mapping of the active site

Curcumin is the yellow pigment of turmeric that interacts irreversibly forming an adduct with thioredoxin reductase (TrxR), an enzyme responsible for redox control of cell and defence against oxidative stress. Docking at both the active sites of TrxR was performed to compare the potency of three naturally occurring curcuminoids, namely curcumin, demethoxy curcumin and bis-demethoxy curcumin. Results show that active sites of TrxR occur at the junction of E and F chains. Volume and area of both cavities is predicted. It has been concluded by distance mapping of the most active conformations that Se atom of catalytic residue SeCYS498, is at a distance of 3.56 from C13 of demethoxy curcumin at the E chain active site, whereas C13 carbon atom forms adduct with Se atom of SeCys 498. We report that at least one methoxy group in curcuminoids is necessary for interation with catalytic residues of thioredoxin. Pharmacophore of both active sites of the TrxR receptor for curcumin and demethoxy curcumin molecules has been drawn and proposed for design and synthesis of most probable potent antiproliferative synthetic drugs.     

The structure, reproduction and taxonomy of Vidalia and Osmundaria (Rhodophyta, Rhodomelaceae)

Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.     

New or rare chromosome counts in Artemisia L. (Asteraceae, Anthemideae) and related genera from Kazakhstan

Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.     

Comparative morphology of the carpel in the Liliaceae: Hewardieae, Petrosavieae, and Tricyrteae

The young pistils in the melanthioid tribes, Hewardieae, Petrosavieae and Tricyrteae, are uniformly tricarpellate and syncarpous. They lack raphide idioblasts. All are multiovulate, with bitegmic ovules. The Petrosavieae are marked by the presence of septal glands and incomplete syncarpy. Tepals and stamens adhere to the ovary in the Hewardieae and the Petrosavieae but not in the Tricyrteae. Two vascular bundles occur in the stamens of the Hewartlieae and Tricyrtis latifolia. Ventral bundles in the upper part of the ovary of the Hewardieae are continuous with compound septal bundles and placental bundles in the lower part. Putative ventral bundles occur in the alternate position in the Tricyrteae and putative placental bundles in the opposite. position in the Petrosavieae. The dichtomously branched stigma in each carpel of the Tricyrteae is supplied by a bifurcated dorsal bundle.     

肝癌中HBV和HCV基因和抗原的分布及意义

采用原位分子杂交方法检测HCV RNA及HBV X基因;采用免疫组织化学方法研究HCV核心抗原,非结构区C33c抗原及HBxAg在肝细胞肝癌中的定位及分布.结果表明(1)HCV RNA、HBV X基因在肝细胞肝癌组织检出率分别为40%(55/136)和82%(112/136).HCV RNA定位于癌细胞的胞浆内,阳性细胞呈散在、灶状及弥漫分布三种形式;HBV X基因在肝癌细胞中的分布呈胞浆型、核型及核浆型,阳性细胞也呈上述三种分布形式;(2)HCV C33c抗原、核心抗原在肝细胞肝癌中的阳性率为81%(133/164)及86%(141/164).C33c抗原定位于癌细胞及肝细胞的胞浆内;核心抗原既定位于癌细胞核中,又可定位于胞浆中.C33c抗原阳性细胞以灶状分布为主;而核心抗原阳性细