抗破伤风类毒素单抗可变区基因的克隆及在大肠杆菌中表达的三种工程抗体

我们采用RT-PCR,从小鼠杂交瘤细胞中扩增并克隆了抗破伤风类毒素(TT)抗体轻、重链可变区,重链Fd区基因,测定了其VH、Vk序列。并在大肠杆菌中表达了Fd片段,ELISA分析的结果表明Fd片段具有抗原结合的能力,但特异性很差。进一步采用SOE,和PCR技术,将VH、VK基因与ScFv连接片段组装成单链抗体(ScFv)基因片段,以及将人重链CH1和Fab基因连接片段组装成Fab基因片段。将它们分别插入含噬菌体fd外壳蛋白3基因的phagem-id pHEN 1中,在辅助噬菌体M 13-VCS作用下,噬菌体表面表达了抗TT的噬菌体单链抗体(phage-ScFv)与噬菌体Fab(phage-Fab),经ELISA检测,表明它们都能与TT特异结合。     

抗癌胚抗原单链抗体基因与核心链霉亲和素基因融合在昆虫细胞中的表达

将抗癌胚抗原单链抗体基因与核心链霉亲和素基因融合插入昆虫杆状病毒供体质粒 pFastBacHTa中 ,在粉纹夜蛾Tn 5B1 4细胞中进行表达。SDS PAGE分析结果表明 ,表达产物分子量为 4 1kD左右 ,Western印迹分析结果表明 ,以HRP标记的生物素进行蛋白质印迹在 4 1kD处可见表达条带 ,表明融合蛋白能特异性的与生物素结合 ,放射免疫分析表明重组杆状病毒表达产生的ScFv CS蛋白能特异性结合癌胚抗原     

重组抗人活化血小板单链抗体-尿激酶原导向溶栓剂的基因构建及表达

为了获得特异性高的导向溶栓药物,应用PCR技术,得到抗人活化血小板单抗(SZ-51)的Fab′基因片段。再用酶切方法,将Fab′中CH1基因片段替换成合成的连接分子(linker)基因,构建成单链抗体基因,并插入到人尿激酶原分泌肽基因及低分子量单链尿激酶(scu-PA-32k)之间,最终构建成重组抗人活化血小板单链抗体-尿激酶原融合蛋白基因。此融合蛋白基因在昆虫细胞中得到表达。纯化的表达产物SDS-PAGE鉴定,其分子量约为60kD,与预期值相符。其比活为9000IU/mg蛋白。ELISA法初步证明此重组的融合蛋白具有与活化血小板抗原结合特异性。     

人源抗TNF—α抗体Fab基因的单链化及其表达和纯化

构建人源抗TNF－α单链抗体基因,并尝试其在E.coli中的表达和纯化,采用人工接头,按VH－linkerVL的结构将人源抗TNF－a的VH,VL基因拼接成单链抗体（ScFv)基因,并将构建好的ScFv基因插入表达载体pQE30,转染E.coli M15,以IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂纯化表达产物,构建的ScFv基因长723bp, 列分析表明,该序列拼接正确,SDS－PAGE显示,用重组的pQE30转化的M15菌经诱导后,有相对分子质量（M）约为52000的外源蛋白表达,Ni-NTA树脂纯化的表达产物纯度大于90％,因此,成功地构建了人源抗TNFa的ScFv基因,并在E.coli DH5a中表达和纯化的该基因的产物。     

抗A型肉毒毒素人源三结构域抗体的重组设计与表达

以获得的抗A型肉毒毒素人源单链抗体ScFvB17为模板 ,PCR扩增抗体ScFv基因的重链可变区 (VH)和轻链可变区 (Vκ) ,以重链恒定区 1(CH1) 5′端 12个氨基酸的序列作为连接肽 ,构建成三结构域抗体分子 :VH_连接肽_Vκ(VH Vκ)。重组VH Vκ抗体分子在大肠杆菌中得到高效表达 ,其表达量占菌体总蛋白质的 34%以上。表达的蛋白质在菌内形成包含体 ,采用镍柱金属鏊合层析法对该包含体进行纯化 ,得到了纯度高达 95 %的VH Vκ。ELISA等实验结果显示 ,重组设计并制备的三结构域抗体蛋白VH Vκ不但可以特异识别毒素抗原 ,具有与原母本单链抗体ScFv相同的抗原特异性 ,而且具有了更高的相对亲和力和稳定性。     

抗TNF-α单链抗体的表达及其纯化

克隆抗人肿瘤坏死因子(TNF-α)鼠源单抗的可变区基因以构建其单链抗体(ScFv)表达载体,实现在大肠杆菌的表达,并进行ScFv的可溶性纯化与鉴定。采用RT-PCR技术,以前导肽序列的引物从1个分泌抗人TNF-α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆抗体轻链、重链可变区基因(VL,VH),构建ScFv基因,将ScFv基因片段与pGEX-4T-1表达载体连接,在大肠杆菌中表达并采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)进行可溶性纯化,最后鉴定其生物活性。结果显示,得到了功能性重排的轻、重链可变区基因,分别构建了VH和VL不同连接顺序的HLL(VH-Linker-VL)和LLH(VL-Linker-VH)两种ScFv,LLH的表达量较HLL的高,但亲和力不及HLL。采用Sarkosyl溶解包涵体,对目的蛋白进行可溶性纯化,蛋白纯度达到90%,纯化后的蛋白经ELISA和WB证明ScFv维持了亲本抗体与TNF-α特异性结合的能力,且具有细胞毒中和活性。实验中研究探索了一种新颖的,操作简单,省时的裂解、纯化方案,实现了单链抗体经原核系统的表达后得以可溶性纯化。     

卵巢癌抗独特型单链抗体的人源化——抗独特型微抗体的构建与表达

为了降低人抗鼠抗体反应 ,获得满意的免疫原性 ,将模拟人卵巢癌抗原的抗独特型单链抗体人源化 .采用重叠PCR和基因工程的技术 ,将 6B11ScFv基因的轻链和重链颠倒 ,成为 6B11VL VH.再与人IgG1铰链区和CH3区的基因进行融合 (VL VH CH3) ,构建抗独特型微抗体的原核表达载体 .转化E .coliBL2 1(DE3)后用IPTG诱导表达 .经SDS PAGE分离显示 ,在 5 0kD左右处有一诱导蛋白带 .不连续非变性凝胶电泳显示 ,表达产物分子量为 10 0kD左右 .采用ELISA、竞争抑制实验、West ern印迹对其进行活性测定 .结果表明 ,人源化的抗独特型微抗体具有特异性双价结合卵巢癌单克隆抗体COC16 6 9和识别人免疫球蛋白IgG1的活性 ,成功地将鼠源的scFv的人源化     

双价和双特异性Diabody的构建及表达

单链抗体(ScFv)是由一个重链可变区(V_H)、一个轻链可变区(V_L)经连接肽(linker)连在一起构成的单价小分子抗体,为使其能组装成双价,我们对一个抗人红细胞的ScFv进行了改造,将其连接肽由17个氨基酸[SR(GGGGS)_3]缩短为6个氨基酸(SRGGGS),强迫不同分子间的V_H和V_L组合成F_V,从而形成双价小分子抗体(Diabody),在大肠杆菌中分泌表达后,显示:①具有血球凝集活性:抗人RBC ScFv虽可与RBC结合,但不能产生凝集     

全人源抗肝癌噬菌体单链抗体库的构建与筛选鉴定

体外致敏并用EBV转化肝癌患者的PBMC．用PCR分别扩增VH和VL基因并组成ScFv基因．将ScFv基因与载体fuse5连接后,电击转化大肠杆菌MC1061,构建噬菌体呈现型ScFv库．用人肝癌细胞及人肝细胞对初级噬菌体抗体库进行亲和富集及phage-ELISA筛选．筛选获得的阳性克隆进行ELISA及免疫组化鉴定并测序．结果表明,经EBV转化的4例肝癌患者PBMC,ELISA检测均有抗肝癌抗体产生,经多次PCR,扩增出6种VH（γ、μ）和9种VL（κ、λ）基因,经连接组成54种ScFv基因．将ScFv基因与载体连接后,导入大肠杆菌MC1061,得到库容为1．0×10^8的初级噬菌体抗体库,全长ScFv基因的插入率为80％．用人肝癌细胞系HepG2和人肝细胞系QSG-7701对抗体库进行三轮正负淘选和富集后,从中随机挑取533个克隆进行ELISA筛选,得到179个阳性克隆,阳性率为33．6％．将179个阳性克隆进一步进行其他细胞系的鉴定,发现克隆A82对肝癌细胞系HepG2、人胚肾上皮细胞系HEK293呈强阳性反应,免疫组织化学结果显示与人肝细胞癌组织有特异性反应,而不与正常肝组织反应．且A82的相对亲和力为2．4mol／L,解离常数Kd为5．32×10^-9mol／L,显示其亲和力较高．对克隆A82进行测序分析,结果表明：A82全长742bp,含linker cDNA序列45bp,重链可变区基因与人胚系IgVH3-23有94.3％的同源性,轻链可变区基因与人胚系IgV4-2有94．9％的同源性,V．D．J分别属于VH3-23-D2-21-JH6-linker-V4-2-JL2．由上述结果可见,应用体外抗原致敏方法和EBV转化技术联合噬菌体抗体库技术,构建了库容量达1×10^8的全人源抗肝癌单链抗体库,通过细胞ELISA和免疫细胞化学鉴定,获得的噬菌体抗体克隆A82具有较强的特异性,为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础．     

卵巢癌抗独特型单链抗体3D_5ScFv的高效表达

对 3D5卵巢癌抗独特型单链抗体进行原核系统的高效表达 .采用DNA重组技术 ,将 3D5ScFv克隆到原核表达载体pTMF中 ,重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;IPTG诱导表达 ,SDS PAGE鉴定蛋白质的分子量约为 2 8kD ;通过直接ELISA、竞争抑制实验和Western印迹分别检测其活性 .3D5ScFv以包涵体的形式获得高效表达 ,占菌体总蛋白 36 % ,变性复性后蛋白的纯度大于 90 % ,表达蛋白能与卵巢癌抗体OC12 5特异性结合 ,并能有效抑制卵巢癌抗原CA 12 5与卵巢癌抗体OC 12 5的特异性的结合 .3D5ScFv在原核系统中获得了高效表达 ,并具有较好的活性 ,为抗独特型抗体的人源化改造提供必要的元件