真空渗透法转化油菜及转化种子的筛选

真空渗透遗传转化法首先在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中获得成功, 是一种简便、快速且无需经过组织培养阶段即可获得大量转化植株的基因转化方法。该研究以不同遗传背景的3个甘蓝型油菜(Brassica napus)品种(系)陕3B、L45和Mg23为材料, 对真空渗透遗传转化方法中真空渗透时间和Silwet L-77浓度与遗传转化效果的关系进行了比较, 同时对转化种子的筛选方法进行了优化。结果表明, 卡那霉素(Km)对油菜种子的萌发影响不显著, 但对其生长发育有明显的抑制作用。不同油菜品种对卡那霉素的敏感性不同, 各自的致死浓度也不一样。在0%-0.05%的浓度范围内, 随着Silwet L-77浓度的增加, 在相同的真空渗透时间内, 3个油菜品种的转化率逐渐升高。当Silwet L-77浓度为0.05%时, 10分钟的真空渗透时间可获得最高转化效率, 此时陕3B、L45和Mg23的转化率分别达到1.97%、2.09%和2.30%。     

一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法

Silwet L-77是一种非离子型的表面活性剂,常用于植物的转化。本研究发现,Silwet L-77的加入也可以显著地提高大肠杆菌的转化效率。同时,我们比较了不同培养温度、不同培养浓度(OD_(600)值)及不同冷冻保护剂对感受态细胞转化效率的影响。我们发现,28℃培养E.coli至OD_(600)值为0.55~0.6之间时制备感受态细胞,利用9%的DMSO做为冷冻保护剂冷冻保存感受态细胞,转化时加入0.001 5%~0.002%的Silwet L-77,可以获得最高的转化效率。总之,该研究进一步优化了大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法。     

农杆菌介导巨桉Eg5高效遗传转化

以巨桉(Eucalyptus grandis)无性系Eg5叶片为外植体, 探讨了农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染时间、共培养pH值和共培养时间对瞬时转化效率的影响, 分析了不同筛选策略对遗传转化植株筛选效果的影响。结果表明, 外植体侵染45分钟, 共培养pH值为5.8, 共培养3天所得到的瞬时转化效率最高; 逐步提高卡那霉素(Km)浓度筛选转基因植株有效, 筛选率达到15%, 转化率达到0.26%。经过GUS染色分析和PCR检测, 证实为转基因植株。     

EuFPS基因表达载体构建及对杜仲遗传转化的研究

本实验用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切植物表达载体pSH737和含有目的基因的pUC-FPS,定向连接得到重组质粒pSH-FPS,将其导入农杆菌EHA105.采用农杆菌介导法对杜仲进行遗传转化,研究了卡那霉素(kanamycin,Km)浓度、预培养时间、菌液浓度及侵染时间、乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)浓度、共培养时间等对杜仲遗传转化效率的影响.结果表明,选择无菌苗苗龄15 d的杜仲下胚轴,卡那霉素浓度50mg/L,农杆菌浓度OD600值0.3-0.6,侵染时间8 min,侵染时菌体重悬液中添加50 μmol/L乙酰丁香酮,共培养时间3 d,抗性芽的获得率最高.对再生植株进行GUS检测发现有45%的植株呈阳性.     

‘窄冠白杨1号’遗传转化体系建立与抗虫基因转化

‘窄冠白杨1号’（Populus leucopyramidalis 1）是一种冠形窄、耐盐碱的优良白杨派无性系。由于缺乏其遗传转化体系,因此无法通过基因工程手段对其进行遗传改良。该研究以‘窄冠白杨1号’为材料,建立了农杆菌介导的遗传转化体系,并获得了较高的遗传转化效率。首先将组培苗继代培养不同时间段（35、45、55、65 d）,分别取其3种组织（叶片、叶柄、茎段）以对比分化能力的强弱,确定了继代45 d后的叶片具有最强的分化能力,其增殖倍数为8.77。随后,使用继代45 d后的叶片作为遗传转化的材料,研究不同侵染条件对转化率的影响,设立了菌液浓度、侵染时间和共培养时间各3个梯度的正交试验,对这3个因素进行最佳水平筛选,通过PCR检测和GUS染色鉴定转基因株系。结果表明‘窄冠白杨1号’遗传转化体系的最佳组合为：菌液浓度OD600=0.4,侵染时间15 min,共培养时间2 d,在该组合下转化率最高可达54.23%。最后,利用该遗传转化体系获得了转BtCry3Aa抗虫基因‘窄冠白杨1号’株系,证明该体系可以做为‘窄冠白杨1号’遗传改良的有效方法。     

农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系优化

本研究以GUS基因在子叶节区的瞬时表达为依据,通过探讨影响农杆菌转化效率的因素,优化了大豆子叶节非组织培养遗传转化体系;利用该体系对冀豆16号进行Bar基因的遗传转化,并使用针刺法对转基因植株进行草铵膦筛选.结果表明,侵染液中附加3％蔗糖、OD600=0.6、以脱脂棉作为菌液附着介质同时不添加表面活性剂Silwet L-77、侵染1次的GUS阳性率最高达到62.13％.草铵膦抗性植株经PCR检测获得T0阳性植株10个,转化率为2.5％.经PCR和RT-PCR鉴定共获得3株T1阳性植株,初步证明目的基因已整合到大豆基因组中.     

用floral dip法对黄瓜遗传转化的初步研究

用floral dip方法进行遗传转化已经在模式植物拟南芥、部分十字花科及豆科植物苜蓿中取得成功,但在黄瓜转化中未见报道.本研究首次采用floral dip法转化黄瓜,结果表明,采用0.05%Silwet-77和含质粒pX6-GAD-GLP-1的工程农杆菌EHA105转化黄瓜自交系P2及2M1,分别收获种子544和1022粒:将收获种子经60 mg/L的卡那霉素筛选,其抗性植株移栽成活后分别进行PCR及斑点杂交检测,在2个自交系中均获得了阳性转化植株,转化率分别为0.55%和0.68%.本研究首次将floral dip法用于黄瓜遗传转化并获得成功,为扩展floral dip法的应用领域、研究floral dip法在葫芦科植物上的应用奠定了基础,同时也进一步完善了黄瓜转基因手段.     

蔗糖转运蛋白基因VvSUC11和VvSUC12双价植物表达载体的构建及在甜菜中的遗传转化

将葡萄Vitis vinifera L.的蔗糖转运蛋白基因VvSUC11和VvSUC12与甘薯Ipomoea batatas L. Lam.的甘薯贮藏蛋白 (Sporamin) 基因的根部特异性启动子命名为SP1和SP2重组。以pCAMBIA2301为起始载体,构建了pCAMBIA2301- SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12用农杆菌介导法转化了甜菜Beta vulgaris L.品种KWS-9103,发现预培养4 d,侵染时农杆菌的浓度OD600值为0.5,附加0.005％表面活性剂Silwet L-77,延迟筛选4 d,转化效率最高,可达42％。对在卡那霉素中分化并生根的甜菜植株进行PCR和RT-PCR检测,证明目的基因已整合到甜菜中并表达,为进一步研究该基因在甜菜Beta vulgaris中的功能奠定了基础。     

不同抗生素对金发草愈伤组织生长分化的影响

该研究以金发草愈伤组织为材料,通过分析比较不同抗生素种类(卡那霉素、潮霉素、头孢噻呋钠和氨苄青霉素)和浓度对金发草愈伤组织生长分化的影响,来确定适用于金发草遗传转化体系中的抗性筛选剂和抑菌剂。结果表明：(1)金发草愈伤组织对卡那霉素很敏感,且其分化率随着卡那霉素浓度的增加显著减少( P＝0.01)。当卡那霉素浓度为10 mg·L-1时,金发草愈伤组织的生长分化受到明显抑制,且有大量的白化苗形成,但分化率仍有36.56％;当卡那霉素浓度为15 mg·L-1时,金发草愈伤组织的分化率为11.94％,只有很少部分的愈伤分化出绿色的丛生苗;当卡那霉素浓度为20 mg·L-1时,金发草愈伤组织基本褐化死亡,分化率仅为2.26％。因此,浓度为15 mg·L-1的卡那霉素适合作为金发草遗传转化体系中的抗性筛选剂。(2)金发草愈伤组织对潮霉素的敏感性要比卡那霉素弱,且潮霉素对金发草愈伤组织分化率的影响小,但毒害作用大。因此,潮霉素不适合作为金发草遗传转化体系中的抗性筛选剂。(3)300 mg·L-1的头孢霉素和氨苄青霉素对金发草愈伤组织生长分化影响很小且能有效抑制杂菌的生长,较高浓度的氨苄青霉素对金发草愈伤组织的抑制作用不太明显。因此,300 mg·L-1的头孢霉素和较高浓度的氨苄青霉素均可作为金发草遗传转化体系中的抑菌剂。该研究确定了适用于农杆菌介导的金发草遗传转化体系中的抗性筛选剂和抑菌剂,为金发草的遗传改良及功能性基因的研究奠定了基础。     

根癌农杆菌介导GUS基因转化玉米芽尖生长点的研究

本试验以玉米(Zea mays)杂交种‘郑单958’的芽尖生长点作为农杆菌侵染受体,以β-葡萄糖醛酸苷酶基因(GUS)作为转化基因,吸水链霉菌草丁膦乙酰转移酶基因(bar)作为筛选标记基因,通过GUS颜色反应,分别从侵染液浓度、侵染时间和真空处理时间三个方面分析了影响GUS基因转化率的因素,初步得出结论:当侵染液浓度(OD600)为0.6、侵染时间2 h、真空处理时间为10 min时,选用杂交种‘郑单958’作为受体材料将会达到较高的遗传转化率。