不同抗生素对雪莲愈伤组织生长的影响

以雪莲叶片为外植体,探讨了卡那霉素(kanamycin,Kan)、潮霉素(hygromycin B,Hyg)、羧苄青霉素(car-benidillin,Car)3种抗生素对雪莲愈伤组织诱导、生长及分化的影响,以确定农杆菌介导的遗传转化研究中筛选剂和抑菌剂的最适浓度。结果表明:40mg/L的卡那霉素已抑制雪莲愈伤组织生长,当卡那霉素为50mg/L时,愈伤组织的生长基本停止;8.0mg/L潮霉素能够有效抑制雪莲愈伤组织的生长,当潮霉素为20mg/L时则生长的愈伤组织块较小、褐化、甚至死亡。同时,低浓度(0.5～2.0mg/L)的潮霉素可以提高雪莲愈伤组织的分化率;作为农杆菌抑菌剂,不同浓度羧苄青霉素对雪莲愈伤组织生长的影响差异极显著,当羧苄青霉素的浓度超过400mg/L时对雪莲愈伤组织的出愈及生长均有明显的抑制作用。     

金山绣线菊遗传转化体系的建立

以金山绣线菊愈伤组织为受体材料,采用组织培养的方法,在附加不同浓度TDZ的1／2MS培养基上诱导培养,获得再生植株。在附加0．03mg·L^-1 TDZ的培养基上获得了92．5％不定芽的再生率,且再生芽发育良好。选择抗生素筛选试验的结果表明：金山绣线菊愈伤组织对潮霉素较为敏感,在培养基中添加浓度为5～35mg·L^-1的潮霉素均对愈伤组织分化影响较大,潮霉素浓度为5mg·L^-1时,4N时间可使外植体全部褐化死亡;在培养基中添加0～100mg·L^-1的卡那霉素,不同浓度卡那霉素均对愈伤组织分化产生一定程度的影响,当卡那霉素浓度为80mg·L^-1时,愈伤组织基本不发生分化。由此确定卡那霉素为绣线菊遗传转化中适用的选择抗生素,最适选择压为80mg·L^-1。抑菌抗生素的筛选试验结果表明：200mg·L^-1的头孢霉素和200mg·L^-1。的羧苄霉素都能有效抑制农杆菌菌株LBA4404的生长,却对金山绣线菊愈伤组织的芽分化影响不大,可确定为适宜的抑菌抗生素。利用农杆菌介导法对金山绣线菊愈伤组织进行遗传转化,得到卡那霉素抗性植株164株,并初步确定预培养1d、菌液稀释10倍、侵染4min、共培养2d为金山绣线菊最优遗传转化体系,为金山绣线菊的基因工程育种奠定基础。     

药用野生稻TAC克隆转化籼稻的体系初探

采用已构建的药用野生稻TAC文库,比较研究4个籼稻品种在不同培养基的诱导率及愈伤组织对潮霉素抗性。通过2种不同诱导方法产生的愈伤组织,将携带药用野生稻大片段DNA的TAC克隆转化到籼稻品种中的结果表明,除了‘粤香占’以外,其它3个品种在心诱导培养基中添加微量B,后,其愈伤诱导率最高。不同品种的潮霉素筛选适合浓度存在差异,其中‘华粳籼74’的适合筛选浓度为50mg．L-1,‘粤香占’为40mg．L-1。用预培养5d的愈伤组织进行遗传转化,在潮霉素筛选之前先以头孢拉定抑菌处理的,容易获得转基因植株。4个品种中以‘粤香占’的抗性愈伤组织筛选率和分化率最高,分别为22．58％和14．86％。分子检测11株转基因水稻的结果表明,其中8株含有抗性标记基因。据此认为,药用野生稻TAC文库在水稻创新育种中可能有一定的利用前景。     

抑菌剂和筛选剂对香蕉受体系统的影响

本研究将抑制农杆菌生长的两种抑菌剂头孢霉素和特泯丁,以及3种筛选剂潮霉素B、卡那霉素和PPT除草剂,以不同浓度添加到香蕉的3种受体系统中,研究它们对香蕉组织生长与分化的影响.实验结果表明:不同抑菌剂和筛选剂对香蕉再生体系的影响程度不同,不同香蕉再生体系对相同抑菌剂和筛选剂的敏感性也不同,因此不同香蕉再生体系需要选择不同的抑菌剂与筛选剂的最佳的配比和组合配比.3种筛选剂在香焦的3种再生体系中的筛选能力顺序都为:PPT＞潮霉素B＞卡那霉素.     

丹参不同愈伤组织诱导及遗传转化体系优化

为了获得满足不同目的组织培养材料和稳定高效的遗传转化体系,该研究以丹参叶片和茎段为外植体,采用含不同浓度的植物激素(植物生长物质)的Murashige Skoog(MS)培养基,探索诱导丹参产生不同愈伤的条件;采用正交法考察浸染时间、共培养时间、筛选压等对农杆菌介导的丹参遗传转化体系的影响,并根据出芽率及转化阳性率优化丹参遗传转化体系。结果表明:(1)能较快诱导丹参叶片产生愈伤的是MS+0.5mg·L~(-1)6-BA+0.5 mg·L~(-1)2,4-D;诱导茎较快产生愈伤的是MS+0.1mg·L~(-1)NAA+0.5 mg·L~(-1)6-BA;1 mg·L~(-1)反式玉米素(ZR)可能有利于诱导产生含有丹参酮的愈伤组织;1.0 mg·L~(-1)2,4-D较易诱导丹参愈伤组织生根。(2)以卡那霉素为筛选剂时农杆菌GV3101介导的丹参遗传转化的条件为浸染5 min、共培养1 d、卡那霉素30 mg·L~(-1)筛选,经PCR鉴定转基因阳性率为60%;而用10 mg·L~(-1)链霉素筛选阳性率达70%。该研究结果确定了丹参不同愈伤组织诱导条件,明确了以卡那霉素为筛选剂时农杆菌GV3101介导的丹参遗传转化的条件,换用10 mg·L~(-1)链霉素筛选时体系更加稳定、更易操作、更易重复。     

用PEG法把外源基因导入甘蓝型油菜原生质体再生转基因植株

通过PEG处理把外源基因导入甘蓝型油菜原生质体。转化介质中二价阳离子的种类和浓度、携带DNA及PEG溶液的pH值都会影响基因导入效率。以潮霉素抗性和卡那霉素抗性作标记,均成功地筛选到了抗性愈伤组织。相对转化频率分别为1.3%和0.2%。前者明显高于后者。把抗性愈伤组织转到分化培养基上,分化出芽。诱导生根后移栽到土壤中,生长状况良好。酶活性测定和Southern blotting分析表明外源基因已插入到植物细胞基因组中。该遗传转化系统存在的主要问题是抗性愈伤组织分化频率较低。本文对其原因作了初步分析。     

浮萍遗传转化体系的建立和优化

以浮萍为实验材料,成功建立了其稳定的遗传转化体系。实验结果显示:EHA105农杆菌品系对浮萍愈伤组织的侵染效率较高;乙酰丁香酮的最佳作用浓度为100μM;抑菌抗生素的浓度为300 mg/L;潮霉素固体筛选浓度为60 mg/L,液体筛选浓度为1~10 mg/L;采用该体系对浮萍愈伤组织进行转化,得到3株抗性植株,分子鉴定结果表明该抗性植株为转基因植株,说明该遗传转化体系可行,为浮萍基因工程的研发提供参考。     

籼型稻V20B 高效遗传转化体系研究初报

目的:建立籼型杂交稻亲本V20B成熟胚愈伤组织培养的高效遗传转化体系。方法:以V20B的成熟胚作为外植体,研究比较不同培养基、不同生长物质类型及浓度、不同培养条件对愈伤组织诱导、继代、分化的影响。结果:诱导培养基以N6为基本培养基,添加2.5 mg.L-12,4-D和0.2 mg.L-16-BA,光照条件下诱导,成熟胚愈伤组织诱导率达到93.44%;继代培养基以MS为基本培养基,添加2.0 mg.L-12,4-D,黑暗条件下培养;分化培养基以DL为基本培养基,激素配比为2.0 mg.L-1KT、2.0 mg.L-16-BA、0.2mg.L-1NAA、0.2 mg.L-1IAA;采用农杆菌介导法对该体系获得的愈伤组织侵染后能获得的抗性愈伤组织,经PCR检测潮霉素基因转化率为53.89%。结论:建立了适宜于籼型稻V20B的高效组织培养体系。     

潮霉素在大麦遗传转化中的应用研究

以‘B1202’、‘U202’和‘云引1号’3个大麦品种(系)为试材,研究了潮霉素对大麦愈伤组织生长、分化及成熟种子的影响。结果表明:潮霉素对抗性愈伤的适宜筛选浓度为60 mg/L,分化阶段的适宜筛选浓度为40 mg/L,对转基因后代种子筛选以80 mg/L较为适宜,而不同材料对潮霉素的敏感性存在一定程度的差异。通过PCR检测采用农杆菌介导法转化获得的T0和T1代潮霉素抗性苗,结果证实在大麦遗传转化中采用潮霉素进行筛选是可行的。     

根癌农杆菌介导甘蔗遗传转化Bt(cry1Ab)基因北大核心CSCD

以自育甘蔗品种"川蔗23号"诱导的胚性愈伤为受体材料,首次用较低的根癌农杆菌侵染浓度(OD600=0.1左右)与较短的侵染时间(1.5 min)成功实现甘蔗遗传转化Bt(cry1Ab)基因。结果表明,胚性愈伤分化与小芽生根最适潮霉素筛选浓度分别为20 mg/L和30 mg/L;愈伤组织胚性的一致性是影响筛选阶段愈伤再生的重要因素,培养40 d的愈伤组织为转化最适受体;转化材料经连续的潮霉素抗性筛选后,获得65株抗性植株,通过特异性引物的PCR扩增检测,有2株获得阳性条带,初步表明目的基因已整合到甘蔗染色体基因组中。     

褐纹报春苣苔组织培养与快速繁殖

褐纹报春苣苔(Primulina glandaceistriata)是一种极具观赏价值的喀斯特地区野生花卉,目前尚未有褐纹报春苣苔组培快繁的研究报道。该研究以褐纹报春苣苔的叶片为外植体,通过两种途径建立其组培快繁体系。结果表明:适宜的不定芽诱导培养基为MS+6-BA 2.0 mg·L~(-1)+NAA 0.10 mg·L~(-1),适宜的不定芽增殖培养基为MS+ZT 2.0 mg·L~(-1)+NAA 0.10 mg·L~(-1)+活性炭0.05 g·L~(-1),增殖系数为11.09;适宜的愈伤组织诱导培养基为MS+TDZ 2.0 mg·L~(-1)+NAA 0.10 mg·L~(-1),适宜的愈伤组织分化培养基为MS+ZT 1.0 mg·L~(-1)+NAA 0.10mg·L~(-1),分化系数为12.46;适宜的生根培养基为1/2MS+IBA 0.1 mg·L~(-1)+活性炭0.05 g·L~(-1)或1/2MS+IBA0.5 mg·L~(-1)+活性炭0.05 g·L~(-1),生根率为100%。该研究结果成功建立了褐纹报春苣苔的组培快繁体系,为今后褐纹报春苣苔的种苗繁殖和遗传转化提供了技术支持。     

速生湿地松良种胚性愈伤组织诱导与增殖

为使速生湿地松良种快速大规模繁殖,对其胚性愈伤组织进行诱导和增殖优化研究。该文以1代湿地松种子园中10个速生湿地松优良无性系(基因型)的未成熟合子胚为外植体,系统研究基因型、合子胚发育阶段、基本培养基、植物生长调节剂种类和浓度等不同因子对胚性愈伤组织诱导效率的影响,探讨胚性愈伤组织的增殖条件。结果表明:基因型、合子胚发育阶段、基本培养基及植物生长调节剂种类和浓度等均对胚性愈伤组织诱导有不同程度的影响。10个基因型均诱导出了胚性愈伤组织,其中以2号基因型诱导率最高,达到25.37%;合子胚发育阶段中,以处于多胚阶段的球果诱导率最高;四种基本培养基中,以在DCR基本培养基上诱导效果最佳;植物生长调节剂浓度及组合中以2,4-D 2.0 mg·L^-1+KT 2.5 mg·L^-1诱导率最高,达到27.78%。湿地松胚性愈伤组织增殖的最佳培养基为在DCR基本培养基上添加0.5 mg·L^-12,4-D、1.0 mg·L^-1KT、500 mg·L^-1CH和300 mg·L^-1L-谷氨酰胺。综上研究结果,为湿地松良种进一步开展成熟胚诱导及植株再生奠定了基础。     

基于响应面设计茎段形成层培养猕猴桃幼苗的优化研究

为降低猕猴桃组培快繁中的污染率,提高其繁殖效率,该文以猕猴桃的幼嫩茎段为外植体,采用两步培养法进行茎段形成层的愈伤及成苗诱导研究,并利用响应面设计软件对NAA浓度、6-BA浓度、低渗处理时间进行了各条件的优化,同时通过组织切片确定愈伤的来源及幼苗的形成方式。结果表明:(1)培养过程中撕除茎段周皮能显著降低污染率,用200～400 mg·L^-1的PVP处理猕猴桃茎段可有效防止去皮茎段的褐化。(2)愈伤诱导的最佳条件为预培养28.3 h、NAA 4.45 mg·L^-1、6-BA 0.28 mg·L^-1,而幼苗形成的最佳条件为预培养26.4 h、NAA 4.84 mg·L^-1、6-BA 0.42 mg·L^-1。这表明形成层愈伤诱导需较长低渗处理时间和较高生长素,而成苗诱导则需较高生长素、激动素及较短的低渗处理时间。(3)组织切片观察结果表明猕猴桃愈伤组织源于形成层干细胞的分裂,且幼苗株源于胚状体的发育。综上结果表明,通过除去猕猴桃嫩茎周皮,外加抗氧化、低渗处理,可有效降低猕猴桃组培快繁中的污染率,提高繁殖系数和胚状体发生率,为猕猴桃种苗的规模化生产提供技术支撑。     

青海野生黑果枸杞再生体系的建立及遗传稳定性分析

以野生黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)的无菌苗叶片作为外植体,建立了两条再生体系:一条是经愈伤组织再分化的间接再生体系,一条是不经愈伤组织再分化的直接再生体系。并采用流式细胞术(FCM)及ISSR分子标记技术对两种途径再生苗进行了遗传稳定性分析。结果表明:(1)最佳愈伤组织诱导培养基为MS+1.5 mg·L-12,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D),诱导率达100%;最佳分化培养基为MS+1.5 mg·L-16-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+0.1 mg·L-1吲哚-3-丁酸(IBA),1 g愈伤组织上的平均不定芽数为39.4个。(2)叶片直接诱导不定芽的最佳培养基为MS+0.5 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1α-萘乙酸(NAA),不定芽诱导率为92.9%,每个外植体上平均不定芽数为18.1个。(3)两条途径再生的不定芽在不含植物生长调节剂的MS培养基上,2周内均可正常生根。(4)FCM结果显示亲本苗及2种再生苗均为二倍体。(5)ISSR分析表明,间接再生苗的平均遗传相似性系数为0.84,直接再生苗的平均遗传相似性系数为0.91,直接再生体系是一种更加快速高效的繁殖方法。     

普通小麦品种Alondra's遗传转化体系的建立

小麦(Triticum aestivum)幼胚愈伤组织的诱导和分化再生有高度依赖基因型特征。为了建立和优化Alondra’s的高效再生及遗传转化体系, 为小麦遗传转化提供更多的受体基因型, 以Alondra’s的幼胚为外植体, 研究了培养基种类、不同激素配比等对其幼胚愈伤组织诱导及再生的影响。结果表明, 在使用N₆培养基时, 添加3 mg·L^–1的2,4-D并附加1 000 mg·L^–1的CH对愈伤组织的诱导效果较好; 添加4 mg·L^–1的ZT、不附加IAA对愈伤组织的分化效果最好。通过构建植物表达载体pCAMBIA1301-220.6, 利用基因枪法将HYG基因导入Alondra’s幼胚愈伤组织中, 以建立Alondra’s的高效遗传转化体系。结果在含100 mg·L^–1潮霉素的选择培养基上进行筛选、分化, 获得了30棵抗性植株。经PCR检测, 其中5株为阳性转基因植株, 转化率为0.5%。Alondra's遗传转化体系的建立丰富了小麦遗传转化的基因型, 为小麦品种的转基因改良和在不同背景下研究基因的功能奠定了良好的基础。     

培养条件对三七愈伤组织生长和皂苷积累的影响

以MS为基础培养基,改变激素配比、氮源和光照等因素,以分光光度法和HPLC法分析三七愈伤组织培养过程中皂苷含量的变化。结果表明:培养条件对三七愈伤组织中皂苷积累有一定影响,激素配比对愈伤组织中皂苷含量的影响最大,在0.5 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA组合下,培养物中总皂苷含量最多,达到4.72%±0.29%;在总氮量为60 mmol·L-1条件下,45 mmol·L-1KNO3+7.5 mmol·L-1NH4NO3(NO3-/NH4+=7∶1)时,愈伤组织皂苷含量最多,达到4.71%±0.17%;分别在1 000 lx和500 lx光强下每天光照12 h的愈伤组织,皂苷含量均低于黑暗培养的愈伤组织,三者皂苷含量分别为1.94%±0.31%、2.38%±0.12%和3.57%±0.27%,光照引起愈伤组织表面变绿及细胞分化,可能是抑制愈伤组织中皂苷合成与积累的主要原因;HPLC检测发现,三七愈伤组织和根中均含有Rg1、Re、Rb1及Rd四种皂苷,但栽培三七根含有R1皂苷,而三七愈伤组织中未检测到R1,其原因需要进一步研究。该研究结果为未来愈伤组织培养成为部分代替人工栽培生产三七天然产物的潜在途径提供了研究基础。     

Effects of kanamycin on tissue culture and somatic embryogenesis in cotton

The aminoglycoside antibiotic kanamycin was evaluated for its effects on callus initiation from hypocotyl and cotyledon explants, proliferation of non-embryogenic and embryogenic calli, initiation and development of somatic embryos in cotton (Gossypium hirsutum L.). On this basis, the potential use of kanamycin as a selective agent in genetic transformation with the neomycin phosphotransferase II gene as the selective marker gene was evaluated. Cotton cotyledon and hypocotyl explants, and embryogenic calluses were highly sensitive to kanamycin. Kanamycin at 10 mg/L or higher concentrations reduced callus formation, with complete inhibition at 60 mg/L. Kanamycin inhibited embryogenic callus growth and proliferation, as well as the initiation and development of cotton somatic embryos. The sensitivity of embryogenic callus and somatic embryos to kanamycin was different during the initiation and development stages. Kanamycin was considered as a suitable selective agent for transformed callus formation and growth of non-embryogenic callus. Forty to sixty mg/L was the optimal kanamycin concentration for the induction and proliferation of transformed callus. The concentration of kanamycin must be increased (from 50 to 200 mg/L) for the selection of transformation embryogenic callus and somatic embryos. A scheme for selection of transgenic cotton plants when kanamycin is used as the selection agent is discussed.     

紫茉莉不定芽诱导和植株再生

紫茉莉(Mirabilis jalapa)观赏价值较高,是一种重要的污染修复植物.组织培养技术为植物品种改良和选育的重要途径,但紫茉莉离体快繁方面的研究尚未见有相关报道.该研究以紫茉莉叶片和茎段为外植体,通过观察和统计外植体愈伤组织和不定芽的诱导情况,分析不同植物生长物质对紫茉莉植株再生的影响.结果表明:紫茉莉带芽茎段比较适合丛生芽的诱导,当带芽茎段在MS+1.0 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1 KT+1.0 mg·L-1 NAA+0.05 mg·L-1 TDZ培养基中培养时,不定芽的增殖系数较高.无论是MS或1/2MS培养基,都可诱导不定根的产生,其中生根效果较好的培养基为1/2 MS+0.5 mg·L-1 NAA.该研究结果探索了紫茉莉组织培养的最适条件,根据愈伤组织诱导率和不定芽的增殖系数筛选出了适宜不定芽诱导的培养基类型,根据不定芽生根情况确定了最佳的生根诱导培养基,为建立紫茉莉高效稳定的再生和遗传转化体系奠定了基础.     

外源激素对马尾松花芽分化及内源物质的影响

为探讨马尾松球花形成与植物激素水平的关系,该研究对贵州省都匀无性系种子园11年生马尾松进行不同浓度的 IAA、IBA、GA3、BAP等植物激素处理,采用考马斯亮蓝G-250染色法、蒽酮法分别对不同浓度不同激素处理后的枝条上针叶中的可溶性蛋白质和可溶性糖含量变化进行测定,并在第二年开花时对试验枝条的开花情况进行了调查。结果表明：在8－11月份,进行500 mg·L-1的BAP 处理有利于马尾松雌球花和雄球花的形成,100 mg·L-1的GA3处理有利于马尾松雌球花的形成;而GA3250 mg·L-1和GA3500 mg·L-1处理有利于马尾松雄球花的形成,IAA 250 mg·L-1对马尾松雌雄球花同枝的数量有提高作用。在10－11月份,对马尾松进行500 mg·L-1的BAP、IAA、GA3处理后,马尾松针叶内蛋白质含量变化有显著影响;在10月份时,进行BAP 100 mg·L-1处理后,其可溶性糖含量及可溶性蛋白含量均可达到极显著水平。而在8月份与10月份时,分别进行IBA 100 mg·L-1与IBA 250 mg·L-1处理后,其可溶性蛋白含量与其对照差异处于极显著水平;在11月份时,进行GA3100 mg·L-1处理后,其可溶性蛋白含量与其对照差异处于极显著水平;而在11月份时,进行IBA 500 mg·L-1处理后,其可溶性蛋白含量与对照差异处于显著水平。